Method Article

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T לנצל תוכניות מטבוליות שונות כדי להתאים לצרכיהם תפקודית במהלך התמיינות והתפשטות. המיטוכונדריה הם רכיבים חיוניים הסלולר אחראית לאספקת אנרגיה תא; עם זאת, המיטוכונדריה עודף גם מייצרים מינים חמצן תגובתי (ROS) שעלולה לגרום מוות של תאים. לכן, ומספר המיטוכונדריה עליך להתאימם כל הזמן להתאים את הצרכים של התאים. תקנה דינמית זו מושגת באופן חלקי באמצעות הפונקציה של lysosomes להסיר את עודף/פגום organelles ו מקרומולקולות. לפיכך, תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי, lysosomal הם מחווני מפתח להערכת ההתאמה חילוף החומרים של התאים. עם התפתחות זונדי organelles, ליזוזום מאופיין היטב או צבע ספציפי המיטוכונדריה הפכו זמינים בפורמטים שונים כדי להדביק תווית lysosomes הסלולר ועל המיטוכונדריה. Cytometry זרימה ססגוניות הוא כלי נפוץ פרופיל תא פנוטיפים, יש לו את היכולת להיות משולב עם מבחני אחרים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לשלב צבעים ספציפיים אברון עם סמנים משטח מכתים כדי למדוד את כמות lysosomes של המיטוכונדריה באוכלוסיות שונות תא T על cytometer זרימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר רקמות הקציר ההליך המתואר כאן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.

1. הכנת לימפוציט השעיה של איברי הלימפה

  1. המתת חסד העכבר על ידי שיטה שאושרו כגון CO2 שאיפת בתא אקרילי שקוף ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
    הערה: לשמור על קצב הזרימה של CO2 עבור 20% לעקירה לדקה של התא, ומעלה לא מאשר 5 psi (פאונד לאינץ מרובע). זה לוקח 2-3 דקות בשביל עכבר איבד את ההכרה. לשמור על הזרימה2 CO לפחות עבור 1 דקות אחרי החיה הפסיק לנשום (5-7 דקות הכוללת).
  2. הנח את העכבר על גבו על לוח נקי (למשל לוח פלסטיק פוליסטירן) ולתקן את הגפיים עם קל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של קבוצות משנה עיקריים T cell הטחול, בלוטת התימוס

בקצרה, המתלים תא בודד מן הטחול ואת בלוטת התימוס lysed של כדוריות דם אדומות, מודגרות עם תגובת שיקוע 2.4G2, ואחריו צבע ספציפי אברון, סמן משטח מכתים עם נוגדנים מצומדת קרינה פלואורסצנטית (טבלה 1). התקדמות התפתחותית thymocytes יכולה להיות מתוארת באמצעות נוגדנים קולטני שיתוף CD8 ו CD4. Thymocytes הכי ילדותי לא מבטא CD4 או CD8, והם נקראים כפול שלי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב צבעים ספציפיים אברון סמן משטח מכתים לכמת את כמות המיטוכונדריה או lysosomes באוכלוסיות שונות תא T. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על המגבלה של מספר תאים הומוגניות דרישות עבור שיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח immunoblot. זה שימושי במיוחד ניתוח נדיר תא אוכלוסיות ובדיקת סוגי תאים מרובים בו-זמנית באותו זמן.

משך ההליך הטמפרטורה של דגירה הגורמים הקריטיים ביותר פרוטוקול זה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. תיוג אברון תקין דורש טיטור מדויק של צבע ספציפי אברון. תאים צריך גם לשמור ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים משרד טייוואן המדע, הטכנולוגיה (רובם) NSC103-2320-B-010-002-MY2, MOST104-2628-B-010-002-MY4 מודיע Hsu. . סי-וו ווי היא נמען של מעולה התזה פרס של המכון של מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ס"מ מלקחיים Graefe (ישרים ומשוננים)Dimeda
11 ס"מ מספריים איריס (ישר עם ראשים חדים/חדים)Dimeda
צינור צנטריפוגה 15 מ"לThermo Fisher Scientific339650
מזרק 5 מ"לTERUMO 
צלחת פטרי 6 ס"מאלפא;-פלוס
70 ומיקרו; מסננת תאי ניילון mSPL Lifesciences93070
אמוניום כלוריד (NH<תת>4Cl)    SigmaA9434
נגד עכבר CD25Biolegend102007שיבוט: PC61
נגד עכבר CD4Biolegend100453שיבוט: GK1.5
נגד עכבר CD44Biolegend103029שיבוט: IM7
נגד עכבר CD62LBiolegend104407שיבוט: MEL-14
נגד עכבר CD8Biolegend100713שיבוט:53-6.7
אנטי עכבר TCR ובטא;שיבוט 109233 BiolegendH57-579
BD LSRFortessaBD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Bio basic6381-92-6
FALCON 5 מ"ל צינור פוליסטירן עגול תחתון (צינור FACS)BD Biosciences352052
סרום בקר עוברי (FBS)HycloneATD161145
Flowjo, LLCBD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES)SigmaH4034
L-גלוטמין (200 מ"מ)GibcoA2916801
LysoTracker Green DND26Thermo Fisher ScientificL7526
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (100X)Gibco11140050
MitoTracker ירוק FMתרמו פישר ScientificM7514
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ג'יבקו15140122
אשלגן ביקרבונט (KHCO3)J.T.baker298-14-6
תמיסת יודיד פרופידיוםסיגמא25535-16-4
RPMI 1640 בינוני (אבקה)גיבקו31800089
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)סיגמאS5761
נתרן פירובט (100 מ"מ)ג'יבקו11360070
:

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicolor Flow CytometryMitochondria QuantificationLysosome DetectionT Cell AnalysisOrganelle specific DyesSurface Marker StainingFlow Cytometry ProtocolCell Surface MarkersPropidium Iodide StainingAuto Compensation Setting

Related Articles