ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

סיכום

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

תקציר

מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז'ן.

מבוא

שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% - 40% של מסת גוף¹. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers^2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.

פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בי....

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי סן רפאלה אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.

1. ניתוח של השרירים hindlimb העכבר

1. לחטא פינצטה ומספריים (שני ישרים ועקומים) על ידי autoclaving.
2. להכין ולסנן (0.22 מיקרומטר) בכל אמצעי התקשורת (חסימה בינוני, בינוני עיכול, מתרבים בינוני, המבדילים בינוני) לפני תחילת הניסוי (ראה טבלה של חומרים).
3. לשים 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) 35 מ מ פטרי לאוסף שריר.
4. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או באמצעות CO₂ , לחטא את העור עם אתנול. הסר את העור hindlimbs ואת הגפיים העליונות באמצעות מספריים, פינצטה, כדי להקל את ניתוקה של השרירים.
   הע....

תוצאות

לעקוב באופן אוטומטי של גרעיני התנועה במהלך התמיינות myoblast בתחום ההדמיה בשידור חי, הגרעינים יש מעדיפים fluorescently לתייג. חשוב לציין כי באמצעות מולקולות DNA-intercalating הוא לא ריאלי כי מולקולות אלה להפריע התפשטות ובידול של ראשי myoblasts¹³. לדוגמה, התפשטות ובידול יש כבר ניתחו ב ראשי myoblasts תרבותי עם או בלי Hoechst (איור 1). זה מתבטא התפשטות (איור 1 א', ב') ובידול (

דיון

סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול^{2,3, 4}. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן שונות כדי לבצע immunofluorescence מכתים עבור MyHC, סמן של בידול, כתמים גרעינים עם DNA-intercalating מולקולות (למשל, Hoechst)⁵. שיטה זו ש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמצית עוברי עוף	Seralab	CE-650-J
קולגנאז	Sigma	C9263-1G	125 יחידות/מ"ג
קולגן מעור עגל	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 יחידות/מ"ג
דוקסיציקלין	סיגמא	D1515
DMEM	סיגמא	D5671
סרום בקר עוברי	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
סרום סוסים	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	קורנינג	356231
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא	P0781
תאי דם אדומים מדיום ליזה	Biolegend	420301
<חזק>עיכול בינוני
קולגנאז	40 מ"ג
דיספאז	70 מ"ג
PBS	20 מ"ל
מסוננים 0.22um
חסימת מדיום
DMEM
סרום בקר עוברי	10%
L-גלוטמין	1%
פניצילין-סטרפטומיצין	1%
גנטמיצין	1 ופרמיל;
מסונן: 0.22um
Proliferation Medium
IMDM
סרום בקר עוברי	20%
L-גלוטמין	1%
פניצילין-סטרפטומיצין	1%
גנטמיצין	1 ופרמיל;
תמצית עובר צ'יצ'ן	3%
מסוננת 0.22um
מדיום התמיינות
IMDM
סרום סוסים	2%
L-גלוטמין	1%
פניצילין-סטרפטומיצין	1%
גנטמיצין	1 ופרמיל;
תמצית עובר צ'יצ'ן	1%
מסוננת 0.22um