מאמר שיטה

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58888

⸱

13 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

תקציר

מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז'ן.

מבוא

שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% - 40% של מסת גוף1. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.

פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בידול5,6,7. עם זאת, רוב השיטות האלה מייצגים סטטי שגרות אשר מסתמכים על הניתוח של תאים קבוע, כתוצאה מכך, תאפשר למדענים לחקור תהליכים מאוד דינמי, כגון myoblast פיוז'ן וההתבגרות myofiber באופן מלא. הדוגמה הבולט ביותר היא מיקום הגרעין, אשר הוא, עם גרעינים בתחילה במרכז myofiber, והיא, לאחר מכן, הממוקמים בפריפריה אחרי myofiber ההבשלה8,9. הדמיה חיה היא הטכניקה המתאימה ביותר כדי להשיג עוד תובנות תופעה מוזרה שכזו.

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים להקליט בידול myoblast היווצרות myotube על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות, כדי לבצע ניתוח כמותי החל מעקב אוטומטי של גרעינים myoblast. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה כמותיים אפיון של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast במהלך התמיינות ופיוז'ן. הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים שונים, כלומר (1) אוסף של השרירים hindlimbs של עכברים, (2) בידודו של ראשי myoblasts המורכבת עיכול אנזימטי ועל מכניים, התפשטות (3) myoblast, בידול ו (4) חיים הדמיה כדי לעקוב אחר גרעינים בתוך ה 16 הראשונה של בידול myoblast.

בהליך הבא, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים, שטופלו µg 1/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP, כפי שתואר קודם לכן10. לחלופין, זה אפשרי כדי לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר על ידי פימנטל ואח. 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי סן רפאלה אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.

1. ניתוח של השרירים hindlimb העכבר

  1. לחטא פינצטה ומספריים (שני ישרים ועקומים) על ידי autoclaving.
  2. להכין ולסנן (0.22 מיקרומטר) בכל אמצעי התקשורת (חסימה בינוני, בינוני עיכול, מתרבים בינוני, המבדילים בינוני) לפני תחילת הניסוי (ראה טבלה של חומרים).
  3. לשים 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) 35 מ מ פטרי לאוסף שריר.
  4. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או באמצעות CO2 , לחטא את העור עם אתנול. הסר את העור hindlimbs ואת הגפיים העליונות באמצעות מספריים, פינצטה, כדי להקל את ניתוקה של השרירים.
    הערה: השרירים יכול להיות מבודד עכברים neonatal או למבוגרים. עכברים neonatal יש עלייה במספר תאי לוויין לעומת עכברים בוגרים. עם זאת, המספר הכולל של תאי לוויין זה יכול להיות מבודד למבוגרים עכבר אחת מספיקה לבצע את הניסוי המתואר להלן.
  5. לבודד השוקתי הסוליה, השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הסובך, הארבע ראשי, התלת, לשים אותם בצלחת פטרי המכילות PBS. לעזוב את המנה על קרח. הסר בזהירות גידים ושומן עם פינצטה ומספריים מעוקר.

2. בידוד של myoblasts הראשי

הערה: כל נהלי תרבית תאים נעשים בתנאים סטריליים.

  1. הסר את השרירים, טוב, מגניב. לחתוך, מינצ השרירים, באמצעות מספריים מעוגלים סטרילי, עד מסה אחידה, מתקבל. לשים את השרירים החלקים לתוך צינור 50 מ.
  2. להוסיף 10 מ של המדיום עיכול החלקים שריר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות חזקה (250 דקות-1) באמבט מים, לעכל enzymatically את השרירים.
  3. להוסיף 10 מיליליטר של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו גנטמיצין 1% (חסימה בינוני) כדי לעצור את העיכול.
  4. צנטריפוגה ב x 40 g למשך 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע בשפופרת 50 מ. שמור את צניפה על קרח.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, תגובת שיקוע מכיל כמה תאים הלוויין, תאי דם, תאי אנדותל ו fibroblasts, בעוד בגדר מכיל חתיכות מעוכל משרירים ורקמות. כדי להגדיל את מספר תאים בודדים, בגדר חייב להיות נתון שלבים נוספים של מערכת העיכול, כפי שמתואר להלן.
  5. Centrifuge תגובת שיקוע ב x 650 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS. שמור בגדר resuspended על הקרח.
  6. חזור על שלבים 2 x למשך שארית בגדר שהושג בשלב 2.4 2.2 – 2.5 ולהוסיף את כדורי resuspended לאחר מכן בגדר resuspended הראשון והתפאורה על קרח.
  7. עוברים את כדורי resuspended דרך מסנן מיקרומטר 70 ואז דרך פילטר מיקרומטר 40. להוסיף 15 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
  8. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר פירוק של תאי הדם האדומים כדי לרוקן את תאי הדם האדומים. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 40 מ של PBS להפסיק את פירוק של כדוריות דם אדומות, ואת צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של DMEM עם 10% FBS.
  9. בשלב preplating, לוחית רישוי התאים 20 מ של התפשטות בינוני בצלחת פטרי 150 מ מ ללא ציפוי. לאחר h 1 של דגירה ב חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2), לאסוף את המדיום.
    הערה: Fibroblasts, הצמדת לצלחת, ואז מתבטלים, בעוד תאי לוויין להישאר ההשעיה.
  10. חזור על שלב 2.9 3 x ו, בשלב preplating האחרונה, לאסוף את המדיום המכיל תאי לוויין ההשעיה.
  11. צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
  12. בעוד התאים הם צריך שתוציאו, מעיל שתי צלחות פטרי 150 מ מ עם קולגן (10 מ"ל של פתרון 0.1% ב- 0.1 M חומצת חומץ). כדי לעשות זאת, לשים הקולגן בצלחת, תקופת דגירה של 5 דקות, ולהסיר אותו. תן את הצלחת יבש למשך 30 דקות.
  13. למחוק את תגובת שיקוע שהושג בשלב 2.11, resuspend בגדר תא ב- 40 מ של התפשטות בינוני (טבלה של חומרים). צלחת את התאים על שתי צלחות פטרי מצופים קולגן 150 מ מ (20 מ"ל לכל מנה) ולשמור התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2) התפשטות בינוני במשך 2-3 ימים עם 1 µg/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP.
    הערה: שלב זה מאפשר ההתפשטות של myoblasts כדי לקבל מספר גדול יותר של תאים עבור עוד מבחני. תא צפיפות נשמר נמוך מאוד כדי למנוע הבחנה ספונטנית של myoblasts לתוך myotubes.

3. מבחני התפשטות ובידול Myoblast

הערה: כאשר myoblast צפיפות גבוהה, כמה תאים ליזום התארכות ולאחר מכן, יש צורך לפצל את התאים. באופן כללי, זה אפשרי לפצל תאים 2 x x-3 מבלי להשפיע על פנוטיפ שלהם.

  1. למחוק את המדיום, לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS, להוסיף 2 מ של טריפסין (1 x), דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה תא עבור 5 דק הסימון תחת המיקרוסקופ ואת, כאשר תאים עגולים לנתק, הוסף 5 מ של DMEM עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין. לספור את מספר תאים (בדרך כלל זה ניתן לקבל כ עונה 1 פרק 106 תאים/עכבר...).
    הערה: הדגירה עם טריפסין עבור 5 דקות בדרך כלל מספיק לנתק את myoblasts proliferating.
  2. נושא את התאים לאחד מבחני המתוארים להלן.
    1. התפשטות assay
      1. צלחת 50,000 תאים/טוב 1 מ"ל/טוב של התפשטות במדיום צלחת 12-ובכן מצופים קולגן, דגירה מצופים בתאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). לתקן ולספור את התאים 24, 48 או 72 h.
        הערה: המדיום מוחלף כל 48 שעות כדי למנוע תשישות התזונתי.
    2. בידול assay
      1. מעיל צלחת 12-ובכן עם 350 µL של בידול בינוני המכיל קרום המרתף מטריקס (1: 100). דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את המדיום.
      2. צלחת 200,000 תאים/היטב במדיום בידול בצלחת מצופים מטריצה. דגירה התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2) עד הם דבקים לצלחת (2 h הם בדרך כלל מספיק עבור התאים לדבוק וכדי להתחיל בידול).
      3. כדי להעריך בידול, לבצע צביעת שרשרת כבדה צולבות הקישור חוטים שרירן, גרעינים כמו שתואר לעיל11. לחלופין, לבצע ניתוח הדמיה לחיות כפי שמתואר להלן.

4. Live-הדמיה של בידול myoblast ומעקב גרעינית

  1. עבור תא חי הדמיה, לשים את התאים, שהתקבל בסעיף 3.2.2, מצופה של צלחת 12-ובכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מאובזר עם מערכת דגירה כדי לשמור על התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  2. השתמש מטרה יבש 20 x (0.7 NA) כדי לקבל מבט שדות עם מאות תאים, מספיק כדי לעקוב אחר היווצרות myofiber. ויזת עבודה H2B-GFP תאים יכולים לדימות עם לייזר בעוצמה נמוכה 488 ננומטר ארגון.
    הערה: חריר פתוח מבטיח כי עומק התמונה (~ 10 מיקרומטר) מכיל את עובי התא כך תאים נשמרים בפוקוס לאורך כל הניסוי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אמנם יתרון, שכן היא משפרת את יחס אות לרעש של התמונות, מיקרוסקופיית שדה רחב יכול לשמש גם. היווצרות Myofiber ניתן לנטר דרך ערוץ שידור.
  3. לרכוש תמונות של 16 סיביות ו 1,024 x 1,024 פיקסלים לכל מסגרת כל 6 דקות עבור 16 h. לכל תפקיד הנרכש, ליצור קובץ multiframe.tif (ראה לדוגמה את הקבצים המשלימים).
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תוכנה מסחרית הקשורים עם המיקרוסקופ (טבלה של חומרים) שימש; השתמש התוכנה המתאימה כדי להשיג את אותה המטרה, כאשר באמצעות מיקרוסקופים אחרים.
  4. להוריד את התוכנה המצורפת. zip קובץ משלים.
    הערה: רוטינות הם קבצי script שיש להפעיל ב- MATLAB. התוכנה היא עיבוד של התוכנה שפורסמו12 אופטימיזציה עבור המעקב של הגרעינים במהלך היווצרות myotube. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: הראשון זיהוי הגרעינים בכל מסגרת לפי הממיין אותם, בעוד השני יוצר "מסלולים" (מסלולים) תנועת גרעינים. הקוד המלא עבור פילוח גרעיני ומעקב ומדריך צעד אחר צעד על תחילת העבודה ניתנים הקבצים המשלימים.
  5. לחלץ את קובץ ה-zip, לשמור אותו בנתיב הרצוי על המחשב האישי (PC) בשימוש. לבצע את כל להלן קטעים במחשב עם התוכנה הדרושה מותקן כבר. שימו לב כי קובץ ה-zip מורכב שלוש תיקיות כאמור להלן.
    הערה: פילוח רוטינות מכיל את הפונקציות להפעלה פילוח. מעקב אחר רוטינות, במקום זאת, מכיל את הפונקציות הדרושות עבור המעקב. מעקב אחר פילוח דוגמה מספק סקריפטים בסיסיים של קבצים כדי להכיר את המערכת. התוכנה פילוח והוא מעקב של הגרעינים פועל כהלכה ב- MATLAB, R2015a או גירסאות מאוחרות יותר.
  6. כדי לחלק את הגרעינים מהקובץ. tif, שם הקובץ, לדוגמה, NameFile.tif.
    1. פתח את תיקיית מעקב פילוח דוגמה ולחץ על DoSegmentation.m. פעולה זו תפתח חלון הפקודה ב- MATLAB.
    2. בדוק את חלון התיקייה הנוכחית בצד שמאל כדי לראות את כל האלמנטים בתיקיה דוגמה של פילוח מעקב . לחץ פעמיים על DoSegmentation.m.
      הערה: ניתן למצוא מידע מפורט על השינויים צריכים להיעשות בקובץ ה-script בקובץ StepbyStep.txt. זה הכרחי כדי לשנות את ה-script כך משתנה filenameinput היא NameFile.tif והיא folderinput התיקיה שבה נכלל בקובץ. tif
    3. להריץ את הסקריפט (על ידי לחיצה על הירוק לחצן הפעל ). התוצאה של פילוח יישמרו של file.mat (SegmentedNameFile.mat), ואילו פילוח של הגרעינים, ניתן לאבחן באיור פלט.
      הערה: פרמטרים עבור פילוח, תיאר בקובץ ה-script, יכול להיות שונה אם יש צורך. איכות פילוח ניתן לבדוק באמצעות קובץ ה-script CheckSegmentation.m (ראה קובץ StepbyStep.txt). בהתבסס על זה, אם האיכות של פילוח עניים (רק כמה גרעינים זוהה), להתאים את הפרמטרים של פילוח, בבירור שצוין בקובץ ה-script DoSegmentation.m , וחזור על ההליך.
  7. כדי להפיק את הרצועות (קרי, מסלולים של כל האטומים בזמן), באמצעות תנוחות גרעיני להשיג פילוח, להריץ את הסקריפט GenerateTracks.m לעבוד באותה תיקיה. הקפד להוסיף את הקובץ המתאים פילוח כקלט, שהושג בעבר (ראה הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף).
    הערה: כפלט, המשתמש יהיה להשיג קובץ TrackedNameFile.mat, עם מטריצה עבור הקואורדינטות x ובמטריצה עבור הקואורדינטות-y של המסילה שנוצר.
  8. להעריך את איכות המסילות CheckTracking.m (ראה את הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף). להשתמש את דמותו פלט של קטע זה האחרון כדי להמחיש לכל תפקיד רב-קוטבי בזמן. בדוק בצד השמאל של צלבים ירוק המציינים כל גרעין מקוטע. כדי לבחור גרעין אחד ספציפי, השתמש בפס הגלילה נמוכה יותר. שימו לב כי הקיף את הגרעין שנבחר באדום, ואילו בצד ימין, המסלול של התא שנבחר ניתן בעקבות בזמן (באמצעות הגלילה העליון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לעקוב באופן אוטומטי של גרעיני התנועה במהלך התמיינות myoblast בתחום ההדמיה בשידור חי, הגרעינים יש מעדיפים fluorescently לתייג. חשוב לציין כי באמצעות מולקולות DNA-intercalating הוא לא ריאלי כי מולקולות אלה להפריע התפשטות ובידול של ראשי myoblasts13. לדוגמה, התפשטות ובידול יש כבר ניתחו ב ראשי myoblasts תרבותי עם או בלי Hoechst (איור 1). זה מתבטא התפשטות (איור 1 א', ב') ובידול (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול2,3, 4. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן שונות כדי לבצע immunofluorescence מכתים עבור MyHC, סמן של בידול, כתמים גרעינים עם DNA-intercalating מולקולות (למשל, Hoechst)5. שיטה זו ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי AFM-מופע ההתרמה כדי E.V. (#21545) ועל ידי המענק זרע Ospedale סן רפאלה (OSR) כדי ש ז (ZAMBRA5X1000). ד ר ז'אן-איב Tinevez מהרכזת ניתוח תמונה של מכון פסטר הוא הודה לשיתוף פומבי הרגלים "פשוטה אירועי הכיבוי" MATLAB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמצית עוברי עוףSeralabCE-650-J
קולגנאזSigmaC9263-1G125 יחידות/מ"ג
קולגן מעור עגלSigmaC8919
dispaseGibco17105-0411.78 יחידות/מ"ג
דוקסיציקליןסיגמאD1515
DMEMסיגמאD5671
סרום בקר עובריLife technologies10270106
gentamicinSigmaG1397
סרום סוסיםInvitrogen16050-098
Hoechstlife technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-glutamineSigmaG7513
Matrigelקורנינג356231
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP0781
תאי דם אדומים מדיום ליזהBiolegend420301
<חזק>עיכול בינוני
קולגנאז40 מ"ג
דיספאז70 מ"ג
PBS20 מ"ל
מסוננים 0.22um
חסימת מדיום
DMEM
סרום בקר עוברי10%
L-גלוטמין1%
פניצילין-סטרפטומיצין1%
גנטמיצין1 ופרמיל;
מסונן: 0.22um
Proliferation Medium
IMDM
סרום בקר עוברי20%
L-גלוטמין1%
פניצילין-סטרפטומיצין1%
גנטמיצין1 ופרמיל;
תמצית עובר צ'יצ'ן3%
מסוננת 0.22um
מדיום התמיינות
IMDM
סרום סוסים2%
L-גלוטמין1%
פניצילין-סטרפטומיצין1%
גנטמיצין1 ופרמיל;
תמצית עובר צ'יצ'ן1%
מסוננת 0.22um

מקורות

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846(2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047(2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100(2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

H2BGFP

מאמרים קשורים