בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

סיכום

אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.

תקציר

האוסטאופנות הינן גדולות, בנות בנות, ותאי-ספיגת עצמות של שושלת היוחסין המקרופאג מונוציט, הנוצרות על ידי היתוך של מונוציטים או מקרופאג פראוסמנים. ספיגת עצם מוגזמת הוא אחד המנגנונים הסלולריים המשמעותיים ביותר המובילים למחלות מחלות נגד חרדה, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו אוסטאופוליזיס periprosthetic. הפונקציה הפיסיולוגית העיקרית של האוסטאופתית היא לקלוט גם את רכיב המינרלים של ההידרוקסיטיט ואת המטריצה האורגנית של העצם, וליצור את המראה הספיגת האופייני על פני העצמות. יש מעט מאוד אוסטאוקיים בהשוואה לתאים אחרים בגוף, במיוחד בעצמות למבוגרים. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו כיצד להשיג osteoclasts וגרים יותר בזמן פחות, אשר תמיד היה בעיה. מספר שיפורים בטכניקות הבידוד והתרבות פותחו במעבדות על מנת להשיג האוסטאופי בוגרים יותר. כאן, אנו מציגים שיטה המבודדת מח עצם בפחות זמן, עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי, באמצעות מכשיר מיוחד ופשוט. עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של osteoclasts בדיל מלא של מח עצם החולדה, אשר מזוהים על ידי שיטות קלאסיות.

מבוא

הומאוסטזיס העצם הוא תהליך פיזיולוגי מורכב מוסדר על ידי עצם-ספיגת בינג העצמות האוסטאופתית והעצם יוצר אוסטאופתית¹. איזון בין פעילות osteoblastic האוסטטית בתיווך באמצעות אוסטאופיות ואוסטאופתנמשך, בהתאמה, הוא חיוני מאוד לשמירה על בריאות העצם הומאוסטזיס, כי רטבאליות הומאוסטזיס העצם עלול להוביל למחלות עצם, כגון כמו צמיחה עצם נורמלי או אובדן של צפיפות העצם. כמו תאים לספיגת עצם ייחודי, האוסטאופתיים חשובים מחלות הקשורות להשמדה העצם נורמלי, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו perioly, ו הפריתותבת^2,3.

התפתחות התרבות האוסטאופתיים מחולקת בעיקר לשני שלבים. השיטות שנקבעו על ידי Boyde et al.⁴ וצ'יימברס ואח '⁵ הלחין את השלב הראשון בשנות השמונים. הם השיגו שופע אוסטאופי עשיר יחסית מעצמותיו של בעלי חיים היילוד, שהיא תקופת השיפוצים המהירה. האוסטאופתות משתחררים על ידי מקטעים ומערבב את העצמות במדיום מיוחד. עם זאת, התאים שהושגו בשיטה זו נמוכים בכמות ובטוהר. השלב השני היה פיתוח של תרבויות ארוכת טווח של היווצרות אוסטאוקלסט, באמצעות תאים השושלת המטתית נגזר מח העצם⁶. ציטוקינים, כגון 1α, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D3, proגלנדין E2 (pge-2), ו הורמון יותרת התריס (pge), אשר מתווספים לתוך המדיום תרבות, לפעול באמצעות מערכת של התאים האוסטאופתיים/סטרומה כדי לעורר את היווצרות אוסטאוקלסט^7,8 . עם זאת, הטוהר וכמות האוסטאופה המתקבלים על ידי שיטה זו אינם יכולים לענות על הצרכים של מחקר הביולוגיה המולקולרית המודרנית. לאחר מכן, התגלית של גורם מעורר מקרופאג המושבה (M-שדרתי) ו קולטן activator עבור גורם גרעיני-κB ליגנד (rankl) להפוך osteoclastogenesis קל יותר^9,10,¹¹, ואת השיטה של שימוש בשיטת M-שדרתי ו Rankl לעירור ישיר היווצרות אוסטאוקלסט נמצא בשימוש נרחב ברחבי העולם. עם זאת, יש עדיין כמה פרטים במתודולוגיה כי יש צורך לשפר.

כיום, שיטת התרבות הנפוצה ביותר הנפוץ ביותר, כפי שמתואר על ידי מרינו ואח '¹² ו-פיי et al^.13, לעתים קרובות דורש הסרת הרקמה הסובבת סביב העצם ומשתמשת במחט מחוטאת כדי לשטוף את חלל מח המוח עם מדיה שהושלמה. ישנם כמה החסרונות לתהליך זה, כולל העובדה (1) הסרת הרקמה המקיפה סביב העצם דורש זמן רב וטכניקה כירורגית גדולה, (2) העצמות הם שבירים יכול להוביל מח עצם תזרים, (3) חלל מח העצם עשוי להיות זעיר מדי כדי סומק, ו (4) יש סיכון של פציעה מקל מחט. כדי למנוע בעיות אלה, אנו מצנטריפוגה את הצינורות המכילים את העצמות של מח עצם במקום מחט-לרוקן את מח העצם. כאן, אנו מציגים שיטה יציבה ובטוחה אשר מבודד מח עצם בפחות זמן עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי. יחד עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של אוסטאוקלטורים מובחנים מלאים בתוך מבחנה.

פרוטוקול

כל השיטות הכרוכות בבעלי החיים המתוארים כאן מאושרות על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת נאנג'ינג של הרפואה הסינית.

1. ההתקנה

1. הכינו מספר longitudinally גזור 1 מ ל הצינורות (1 ס מ) ו מספר שפופרות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. שים את עצות הפיפטה ואת צינורות המיקרוצנטריפוגה ב-103 kPa ו-121 ° c עבור 20 דקות וודא שהם עקרים.
2. הכינו קופסת קרח ומספר מנות סטריליות כדי לשמר את הרקמות הבודדות במהלך תהליך הבידוד.

2. הכנת מדיום לתרבות

1. הכן את מדיום התרבות השלמה. השתמש בינוני חיוני מינימלי אלפא (α-הגברת) המכיל פתרון הסופי של 1% של פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% סרום בפרה העובר (FBS).
2. סנן את המדיה משלב 2.1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
3. הכינו את מח העצם אינדוקציה מדיום. עבור 50 mL של הפתרון, להוסיף 125 μL של מ. א. שדרתי בריכוז של 10,000 ng/mL (טבלת חומרים) כדי 49.875 mL של בינונית תרבותית מלאה (משלב 2.2) כדי לבצע פתרון סופי של 25 Ng/mL M-שדרתי.
4. הכן את המדיום האינדוקציה האוסטאוקלסט. עבור 50 mL של הפתרון, להוסיף 500 μL של RANKL בריכוז של 10,000 ng/mL (הטבלה של חומרים) כדי 49.5 mL של בינונית האינדוקציה מח עצם (משלב 2.3) כדי לבצע פתרון סופי של 25 Ng/ml M-שדרתי ו-100 Ng/ML rankl.

3. בידוד תאים שמקורם בעצם מבמח

1. מתת חסד
   1. המתת החסד ארבעה חולדות הג הג ידי CO₂ שאיפת ואחריו פריקה צוואר הרחם, ולטבול אותם ב 75% אתנול עבור 1 דקות.
      הערה: ודא שבעלי חיים הם מאותו מין ומגיל דומה. מומלץ לחיות מגיל 2 עד 3 שבועות. שני עכברושים מוכנים לשיטה הצנטריפוגלי, ואילו השניים האחרים הם בשביל השיטה המסורתית.
2. שיטה מסורתית
   1. מניחים את החיות על לוח חיטוי במצב פרקדן. לעשות חתך קטן (כ 1 ס מ) על עצם הירך הקרוב לקלף את העור, באמצעות מספריים סטרילית.
   2. . לנתח את העצמות ולעשות שטיפה חותכים את חלקי החיבור הדו סביב מפרקי הירך, הברך והקרסול כדי לבודד את הפטיטיה והפטורים בזהירות ובעדינות. לחתוך חלק מרקמות סביב העצם; היות יסודית אין לשבור את הטיטיה ואת הפמורי במהלך כל התהליך.
   3. מניחים את העצמות הנקיות לתוך תבשיל עם 5 מ ל של מדיום התרבות השלמה. לחתוך את העצם הארוך עם מספריים סטרילי ולהשתמש 1 מזרק mL מחט לשטוף את חלל מח המוח בזהירות עם 10 מ ל של התקשורת המלאה עד החלל מח מוח הופך לבן.
   4. להעביר את ההשעיה התא משלב 3.2.3 לצינור 50 mL, ולאחר מכן, לסנן אותו עם מסננת 70 יקרומטר כדי להסיר את הרקמה הנותרת.
   5. הוסף 5 מ ל של מאגר הפירוק של תא דם אדום (טבלת חומרים) להשעיה של התא. מודב את התאים 8 דקות על הקרח. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 250 x g עבור 5 דקות כדי להניב את הגלולה התא.
   6. מוריד את המדיום ומשהה מחדש את התאים ב -10 מ ל של מדיה מלאה. ספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וחשב את הזמן המושקע בצעדים מסעיף זה (סעיף 3.2).
3. שיטה משופרת
   1. מניחים את החיות על לוח חיטוי במצב פרקדן. הפוך חתך קטן (כ 1 ס מ) לעצם הירך הקרוב ביותר עם מספריים סטריליים לקלף את העור.
   2. . לנתח את העצמות ולעשות שטיפה כראוי לחתוך את החלק של הרקמות סביב העצם (אין צורך להסיר לחלוטין). אין לשבור את הטיטיה ואת הפמורי במהלך כל התהליך.
   3. שטפו את הטטיה והפמורי עם 12 מ ל של תמיסת מלח (PBS) וחותכים אותם לשניים. מניחים את tibias טיה והפמורי לתוך טיפ 1 מ ל הפיפטה (משלב 1.1), אשר לאחר מכן לשים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה והוא centrifuged 3x ב 1,000 x g עבור 45 s ב 4 ° c.
   4. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העצה הצינורות המכילים את העצם, ולהשאיר את מח העצם בתוך הצינור. הוסף 200 μL של מדיה מלאה לתוך הצינורית המיקרוצנטריפוגה וחזור על הפעולה כדי להתפרק ביסודיות את מח העצם.
   5. להעביר את ההשעיה התא משלב 3.3.4 לצינור 50 mL, ולאחר מכן, לסנן אותו עם מסננת 70 יקרומטר כדי להסיר את הרקמה הנותרת.
   6. ספור את התאים באמצעות הטציטומטר, וחשב את הזמן המושקע בצעדים מסעיף זה (סעיף 3.3).

4. טיהור מצנטריפוגה מעבר לדחיסות

1. כוונן את השעיית התא משלב 3.2.6 או שלב 3.3.5 עד 2 מ ל עם α-גברתי.
2. הכינו צינור צנטריפוגלי אחד סטרילי ומוסיפים 8 מ ל של פתרון הפרדת התאים (טבלת חומרים) לצינור.
3. הוסף את השעיית התא משלב 4.1 לפתרון הפרדת התאים. יש לדבוק בעצת הפיפטה למשטח הפנימי של הצינור ולשמור על 45 ° לפני השטח הפנימי. לאחר הוספת ההשעיה, מגבלה ברורה תופיע בין שכבת התאים ופתרון ההפרדה.
   הערה: הפעולה דורשת טיפול מצוין וצריכה להתבצע באיטיות.
4. צנטריפוגה את הפתרון שכבתית בצנטריפוגה אופקית ב 500 x g עבור 30 דקות. לאחר צנטריפוגה, מעונן עם שכבה שנייה מעוננים, המכילה את תאי היעד, מלמעלה למטה.
   הערה: בטלו את ההאצה והאטה של הצנטריפוגה לפני צנטריפוגה. יש שש שכבות לאחר צנטריפוגה; השכבה הראשונה היא השכבה הדילול, השכבה השנייה היא השכבה המונולוציטים, השכבה השלישית היא השכבה של תאים מונוליתיים, השכבה הרביעית היא הפרדה שקופה נוזלית שכבה אחת, החמישית היא שכבת התאים הגרעינית, והשכבה השישית היא התא האדום שכבה.
5. העבר את תאי היעד לשפופרת חדשה. הוסף 5 מ ל של PBS לשטוף את התאים 3x. אחרי כל כביסה, צנטריפוגה את תאי היעד ב 250 x g עבור 5 דקות כדי להניב את הגלולה התא.
6. השהה מחדש את הגלולה התא עם בינונית אינדוקציה מח עצם ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר. הוסף 5 – 8 מ ל של מח עצם אינדוקציה בינוני משלב 2.3 להשיג פתרון התא הסופי של 300,000 תאים/mL. הוסף 1 מ ל לכל טוב של צלחת 24.

5. תרבות ובידול

1. לאחר הדגירה של התאים בשעה 37 ° צ' עבור 24 שעות, בעדינות להדוף את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של המדיום האינדוקציה אוסטאוקלסט לכל טוב. מתפרעים את הצלחת בעדינות ומכניסים אותו לאינקובטור ב-37 ° c.
2. לשנות את בינונית האינדוקציה אוסטאוקלסט כל 48 h. בעודו עושה זאת, לשנות 0.8 mL של המדיום בבאר ומתפרעים את הצלחת בעדינות.
   הערה: יש לצפות בבאר שמתחת למיקרוסקופ הפוך, בדרך כלל בסביבות היום 4 – 6.

6. tartrate חומצה עמידים בפני השפעת פוספאטאז

הערה: לאחר 4 – 6 ימים, במידה והאינדוקציה (סעיף 5) מוצלחת.

1. הכינו את התמיסה הקבע על ידי שילוב 4 מ ל של 37% פורמלדהיד, 32.5 מ ל של אצטון, ו-12.5 mL של תמיסה ציטראט. אחסן את התמיסה הקבע ב-4 ° c.
2. להכין את החומצה העמידה tartrate (המלכודת) פתרון הכתם (טבלה של חומרים) על ידי הוספת 50 μl של נתרן nitrite, 50 μl של הפתרון הבסיסי מהיר של גארנט gbc, 50 μl של נפתלי כ-BI פוספט פתרון, 200 μl של פתרון אצטט, ו-100 μl של tartrate פתרון לתוך 4.55 mL של מים מוכי הוא קדם התחמם 37 ° c. ואז, לערבב בעדינות על ידי היפוך עבור 1 דקות, ולתת לו לעמוד 2 דקות.
3. לאחר אינדוקציה מוצלחת של osteoclasts ומכה את המדיום, ולשטוף בעדינות את הבארות 3x עם PBS.
4. הביאו את התמיסה הקבע לטמפרטורת החדר (RT). הוסף 2 מ ל של פתרון קבע לבארות עבור 30 s, ואל תאפשר לתאים להתייבש.
5. מנושף את התמיסה הקבע, שוטפת בעדינות את התלת-ממד עם מים מפוהים הקדם עד 37 ° c ולאחר מכן, מטפי את המים.
6. הוסף 2 מ ל של פתרון כתם השמנה עבור 1 h ב 37 ° צ' ולשמור את המדגם בחושך.
7. אחרי 1 h, מטפי את הכתם, ולשטוף בעדינות את המדגם עם מים מפוהים כי הוא קדם עד 37 ° c, ולאחר מכן, ומכה את המים.
8. מנגד את התאים במשך 1 דקות בתמיסה של המטאוקסילין. לאחר כתמים, מכתים את התמיסה המטאוקסילין בעדינות לשטוף את התאים 3x עם מים מפוהים.
9. האוסטאופסט התמונה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד, והשמנה⁺ תאים עם שלושה גרעינים או יותר יופיע סגול.

7. שיטת ספיגת עצם באמצעות Toluidine כחול כתמים

1. טיפול מקדים בפרוסות העצם
   1. חותכים את קליפת העצם הטרייה הירך לתוך 2 ס"מ פרוסות עבה לאורך ציר האורך על ידי מסור מיקרואלקטו. ואז, לגזור ולטחון את הפרוסות עם מטחנות רקמה קשה לתוך 80 μm.
   2. לשטוף את הפרוסות בגביע עם מים מאוהים ו-100 הרץ אולטרסאונד 1 h, וחזור על 3x.
   3. לטבול את הפרוסות לתוך 75% אלכוהול עבור 2 h. ואז, מרוקן את האלכוהול ולחשוף כל צד של פרוסות לאור אולטרה סגול עבור 1 h על פלטפורמה נקייה.
   4. לפני נטיעת התאים, לטבול את הפרוסות במדיום התרבות לפחות 2 h.
2. מכתים כחול טולואין
   1. מניחים את פרוסות העצם שטופלו מראש לתוך צלחת 24. לשתול את התאים כפי שהוזכר בשלב 4.6 ולגרום לתאים כפי שהוזכר בסעיף 5.
   2. לאחר הופעתו של אוסטאוקלזום (אחרי 4 – 6 ימים), לשטוף את הפרוסות עם 1 מ ל של 0.25 M אמוניום הידרוקסיד, ו sonicate אותם 3x עבור 5 דקות כל אחד כדי להסיר את התאים החיים כדי לאפשר ניתוח של בורות ספיגת על פרוסות העצם. ואז, להסיר את הידרוקסיד אמוניום ולהכתים את הפרוסות עם 1 מ ל של 1% (wt/vol) פתרון כחול טולדין לכל פרוסה עבור 2 דקות.
   3. שטוף את הפרוסות עם ה-PBS. בחר באופן אקראי חמש תצוגות ובצע ניתוח כמותי למחצה של אזור הספיגת התוכנה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

8. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

1. הוסף את פרוסות העצם משלב 7.2.1 באמצעות 1 מ ל של 2.5% גלוטאלדהיד לפרוסה עבור 2 h ב RT, ולאחר מכן, sonicate את הפרוסות 3x עבור 3 דקות כל אחד עם 1 הידרוקסיד אמוניום כדי להסיר את התאים ולהסיר את הידרוקסיד אמוניום.
2. לשטוף את פרוסות העצם 3x עבור 12 דקות כל אחד עם PBS.
3. תקן את פרוסות העצם עם 1% חומצה osmic עבור 2 h ב RT.
4. ביצוע התייבשות אתנול מדרגה, עם 50%, 70%, 80%, 90%, ו 95% אתנול, עבור 15 דקות עבור כל מעבר צבע, ולאחר מכן, להחליף את אתנול עם אצטט isoamyl עבור 15 דקות.
5. העילו את הפרוסות בעזרת פלאדיום זהב, ולאחר מכן מנתחים על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני.

9. כתמים אימונולואורנסאוציציציללקיקיטונין

הערה: לאחר 4 – 6 ימים, במידה והאינדוקציה מוצלחת (סעיף 5).

1. מוריד את המדיום בעדינות לשטוף את הבאר 3x עם PBS.
2. תקן את התאים עבור 10 דקות עם 4% פאראפורמלדהיד, אשר מקורר עד 4 ° c.
3. הוסף 1 מ ל של PBS עם 0.3% nonionic החומרים בבאר עבור 30 דקות על הקרח. לאחר מכן, משלחים את ה-PBS עם 0.3% nonionic הסטנט ולהוסיף 1 mL של PBS עם 5% FBS לכל טוב עבור 30 דקות על הקרח.
4. מנושף את ה-PBS ואת הקרומים עם קולטן נגד קלציטונין (anti-קליקים) בדילול 1:100 ב-PBS ב-4 ° c בלילה.
5. מנושף את הפתרון, ומארג את הקרומים עם אלקסה-488-מצומדת נגד הארנבת נגד הארנב ב-1:1000 דילול ב-PBS עבור 1 h ב RT.
6. מנושף את הפתרון בעדינות לשטוף את התאים 3x עם PBS. מנוגד את הגרעינים עם Hoechst 33342 כתם עבור 3 דקות ב RT.
7. לשטוף את הפתרון, ובעדינות לרחוץ את התאים 3x עם PBS. שימו לב לעוצמת הקליקים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

תוצאות

מטרת הפרוטוקול הייתה לבודד ולטהר מספרים גדולים של מקדים אוסטאופהאחרונים בנוחות ולגרום לאוסטאופתך בהצלחה. על ידי להשלים עם M-שדרתי ו RANKL, האוסטאופה ענק נראו בימים 5 – 6. היווצרות osteoclasts זוהה בהצלחה על ידי כתמים מלכודת (איור 1A). תאים גדולים וסגולים נחשבו תאים מלכודת חיובית עם מספר רב של גרעינים (בדרך כלל ≥ שלושה גרעינים). באמצעות שיטה זו, זה היה אופייני להשיג 800 האוסטאופתים, המכיל כמה שיותר 30 גרעיני לכל אוסטאופאוקלסט, בצלחת 24-באר (

דיון

היכולת להשיג וללמוד אוסטאופאוקיים בתחום החוץ הוא מיומנות קריטית ויסודית עבור כל חוקר המבקש ללמוד מטבוליזם העצם, אשר עשוי לעזור להבין את המנגנונים של מחלות העצם קליטת ולפתח סוכנים טיפוליים חדשניים. המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שינויים המבוססים על שיטות קודמות.

באמצעות טיפים וצינורות מיקרוצנטריפוגה כדי להשיג מח עצם, זה הפחית ברובו את זמן הפעולה של קבלת מח עצם ואת עומס העבודה של אנשי מעבדה לעומת שיטות מסורתיות. בינתיים, השיטה מונעת את הסיכון של אובדן מח עצם או המחט מקל פציעה. במחקר קודם, התא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה פוספטאז, לקוציט (TRAP) ערכת	Sigma-Aldrich	387A
פורס רקמות קשות אוטומטי	Lecia	RM2265
עצם			נרכש על ידי עצמנו
חממת תאים	Heraus	BB16 / BB5060
סרום בקר עוברי	סרנה	s-fbs-au-015
עיזים נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
מטחנות רקמות קשות	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	צינור צנטריפוגלי סיליקוני ופתרון הפרדת תאים
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך	אולימפוס	CKX31
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	Lecia	DMI-3000
MEM, ללא גלוטמין	Gibco	11090-081
פניצילין-סטרפטומיצין, נוזלי	Gibco	15140122
ארנב קולטן אנטי קלציטונין	Bioss	bs-0124R
חולדה רקומביננטית M-CSF	PeproTech	400-28
חולדה רקומביננטית sRANK ליגנד	PeproTech	400-30
מאגר ליזה של תאי דם אדומים	אבסין	abs47014932
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	FEI	Quanta 200
טולואידין כחול	סיגמא-אולדריץ'	89649