ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

תקציר

המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.

מבוא

זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן¹. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם^2,3,<....

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול stepwise מפורט וזמינותו היא כמפורט להלן, פרוטוקול סכמטית מוצג באיור1.

1. ג אלביקנס זנים ותנאי גידול

1. גדלים זנים אלביקנס ג נוזלי בינוני תמצית-Peptone-Dextrose שמרים (YPD) ב- 30 °C ב שייקר אינקובטור בן לילה.
   הערה: לשמור על זנים של קנדידה מניות קפוא ולגדול על אגר YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, דקסטרוז 2% ו- 2% אגר).

2. הכנת נוגדנים

1. הכן את המדיום assay כדלקמן:
   1. עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay, לפזר אבקת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1.04 g, 2 גרם גלוקוז (2%) 90 מ ל מים סטרילי, חמים התקשורת 3....

תוצאות

המוקד של פרוטוקול זה היא לקבוע את הפונקציות bioenergetic של ג אלביקנס מוערך על ידי מנתח השטף נוספת. מוטציה אלביקנס ג חסר חלבון מיטוכונדריאלי Mam33 נכלל גם יחד עם זן המשלים שלו, mam33Δ/Δ::MAM33 לחקור את ההשפעות של המחיקה של חלבון מיטוכונדריאלי OCR, ECAR. MAM33 מקודד על חלבון בשם מטריקס חומצי מיטוכונדריאלי, תפקידה ב קנדידה לא ידוע.

מספרי הטלפון הנייד עבור assay השטף נוספת

דיון

ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.

ציפוי מוצלחת של אלביקנס ג בצלחת assay הוא אחד השלבים הקריטיים וזמינותו בגלל הדגירה של התאים לוחית PDL מצופה לאפשר את התאים לדבוק הצלחת וזמינותו. ויזואליזציה של הקפדה אלביקנס ג תאים מושגת על ידי מיקרוסקופ אור.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito ערכת מתח	Agilent	103015-100
אוליגומיצין	Calbiochem	495455
מד pH	Accumet	AR20
פנול אדום	סיגמא	P5530
פולי-D ליזין	סיגמא	P6407
רוטנונה	סנטה קרוז	203242
סוסון ים XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
נתרן כלוריד	אמרסקו	241
נתרן הידרוקסי כדורי	J.T Baker	3722
בדרגת תרבית רקמות	Gibco	1523-0147
XF תמיסת קליברנט לבדיקת	Agilent	100840-000
תמצית שמרים פפטון דקסטרוז	פישר מדעי,	BP2469
תמצית שמרים פפטון דקסטרוז אגר	סיגמא	A1296
תמצית שמרים פפטון גליצרול	Sigma	G2025

מים