הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58916

⸱

22 בפברואר 2019

 ,  , 
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע חשיפות תרסיס סלולרי נייד ולמדוד את תגובת תאי. השיטה משתמשת בתאים, גדל הממשק אוויר נוזלי, מחקה ויוו פיזיולוגיה. תגובה תאית nanoparticle נחושת אירוסולים נצפתה כמו לחץ חימצוני באמצעות הדור מינים חמצן תגובתי cytotoxicity כמו שחרור לקטט דהידרוגנאז.

תקציר

פרוטוקול זה מציג במבחנה חשיפה מערכת חדשה, מסוגל להיות שחוקים, כולל אפיון והביצועים שלו. ממשק אוויר נוזלי (עלי) במבחנה חשיפה מערכות לעיתים קרובות מגושם, יצירת תחבורה שדה ומבצע במקור של פליטת או בתוך האזור נשימה קשה וגדולים. דרך המזעור של מערכות אלה, ניתן להביא את המעבדה לשדה, לזירוז זמן עיבוד ואספקת שיטה מתאימה יותר חשיפה זה אינו משנה את תרסיס לפני פנייה אל התאים. הנייד במבחנה חשיפה קלטת (PIVEC), מסתגל קלטת מסנן 37 מ מ כדי לאפשר במבחנה רעילות בדיקות מחוץ סביבה מעבדה מסורתיים. PIVEC התאפיינה באמצעות שלושה גדלים של חלקיקים נחושת כדי לקבוע יעילות התצהיר בהתבסס על gravimetric ניתוח ריכוז מספר החלקיקים. Cytotoxicity הראשונית הניסויים בוצעו עם תאי הריאות חשופות כדי לקבוע את היכולת של המערכת הפקדת חלקיקים תוך שמירה על התא הכדאיות. PIVEC מספק יעילות דומה או מוגבר התצהיר בהשוואת להתקני זרימה בניצב זמין במבחנה חשיפה. למרות התפוקה דגימה נמוך יותר, גודל קטן נותן כמה יתרונות ה הנוכחי במבחנה עלי חשיפה מערכות. אלה כוללים את היכולת להיות משוחק לניטור אישי, ניידות מהמעבדה כדי מקור פליטה, ואת האפשרות שיבנו מערכות מרובות עבור רזולוציה מרחבית תוך שמירה על משתמש התחתון עולה. PIVEC הוא מסוגל איסוף אירוסולים בשדה, בתוך האזור נשימה אל אוויר-לממשק, במבחנה מודל מערכת.

מבוא

דגימה אישי תוך שימוש בטכניקות במבחנה יכול לספק מידע מקיף על האפקטים הביולוגיים של אירוסולים במקום העבודה. 1 חשיפות מזהמים באוויר כוללים חשיפות הכימיקל עצמו, את הדגימות שנאספו אוויר, בתנאים המשוקע שבו הגז היא הציגה התליה תא, חשיפות לסירוגין באמצעות מכשיר כמו כיסא נדנדה, או ישירה חשיפות-הממשק אוויר נוזלי (עלי). 2 רבים של טכניקות אלה מבוצעים עם תאים גדל ההשעיה או האוסף של דוגמאות לפני החשיפה, שכל אחד מהם יכול להשפיע על המחקר רעילות עקב שינויים פוטנציאליים בתרסיס. 3 כדי למנוע שינויים אלה, המעבדה ניתן להביא לשדה באמצעות מספר במבחנה עלי תרבות החשיפה מערכות המשמשות בספרות,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 . עם זאת, מעטים הם זמינים מסחרית. 8 , 9 , 12 מערכות אלה לעיתים קרובות מגושם, במיוחד כאשר כולל מכשירים לווסת טמפרטורה, לחות של הסביבה התאית, קצב הזרימה של מדגם בתרסיס. באמצעות את PIVEC, תרסיס חשיפות ניתן לבצע מחוץ סביבה מעבדה מסורתי או בתוך האזור הנשימה בזמן מחקה שאיפה תנאים.

הקביעה של תרסיס התצהיר במבחנה חשובה החקירה של השפעות בריאותיות כתוצאה מהשאיפה. אזור הנשימה, שטחה של 30 ס מ הפה והאף,14 חיוני להבנת את החשיפה חלקיקים ולשם קישור בין האפקטים הביולוגיים של הריאות. 2 לעתים קרובות, התצהיר על תאים מוגדר על יעילות התצהיר, החלקיקים הנמסרים, נלקח על ידי התאים מחולק החלקיקים מנוהל מערכת ה-6,15 או על בסיס המוני של כמויות זהה. 4 , 16 השיטות למדידת אירוסולים באזור נשימה הן מסנן המבוסס, לכידת חלקיקי על פני תקופה דגימה נתון ושימוש המסננים לערוך בדיקה נוספת. 17 ניטור אישי מחייב מערכת קטנה שמגיע עם עסקת החליפין של דגימות פחות.

קיימות גישות רבות כדי לקבוע את ההשפעות הבריאותיות מחשיפה תרסיס. המודל עלי מאפשר בתרסיס להינתן ישירות לתאים באוויר כמו תרחיש חשיפה אמיתית, אך היא חסכונית יותר, פחות זמן אינטנסיבי יותר ויוו לומד תוך כדי לחקות את המחסומים אוויר נוזלי כגון העיניים, העור והריאות. ריאות תאים גדל את עלי יש את היכולת ליצור שכבה מכשול מקוטב,18,19 אשר מייצרת תכונות פיזיולוגיות הדומות ויוו ריאות האפיתל, כולל ייצור ריר, חומרים פעילי שטח ספציפי שורות תאים הסמפונות או מכתשי, cilia מכות, צמתי צר19 , קיטוב20 ותא19,. 18 משתנה כגון אלה יכולים להשפיע על התגובה התאית נמדד מחקרי רעילות. 21 . בנוסף, עלי במבחנה דגם תוצאות הם לעתים קרובות יותר רגישה תאים נחשפו באמצעות מודלים ההשעיה22 ואין מסוגלות כדי דגם חריפה ויוו שאיפת רעילות. 23 , 24 . לפיכך, מערכת חשיפה עלי כי הוא מסוגל לבצע מדידות בתוך האזור נשימה היא צעד הבא טבעי.

על ידי חשיפת התאים תרסיס ישירות על מקור פליטה, חקירת ההשפעות של גזים, תרכובות נדיפות למחצה, וכל חלקיקי מעורב בתערובת מתרחשת. כאשר התערובת נאסף על מסנן, תרכובות נדיפות של גזים לא נתפס, לא יכול לחקור את כל התערובת. בנוסף, שיחזור של חלקיקי אבקה או השעיה נוזלי יכול להוביל צבירת או אינטראקציות חלקיקים-נוזל, כגון פירוק, ההשעיה נוזלי. 25 , 26 כאשר חלקיקי אירוסול מתווספים הנוזל, קיים פוטנציאל גבוה יותר עבור הצטברות,25,27 היווצרות של חלבונים קורונה,28 או אינטראקציה עם תרכובות בתוך הנוזל, אשר יכול להשפיע על התצהיר, להשפיע על התגובה הביולוגית. 29 , 30

חשיפה-עלי מבוססת על שלושה פרופילים תרסיס הראשי, ענן שיקוע, במקביל זרימה וזרימה בניצב. ענן להתיישב, בשימוש על ידי חשיפה תא ממשק אוויר נוזלי (אליס),4 היא מערכת אצווה שבו חלקיקים להפקיד באמצעות כוח הכבידה, diffusional מסתדר כמו בתרסיס היא כאל יחידה אחת. זרם מקבילים, המשמש את תרסיס אלקטרוסטטית במבחנה חשיפה מערכת (המרזבים)5 ו Multiculture חשיפה קאמרית (MEC) II,6 מאפשר התצהיר באמצעות התוספת של תנועה בראונית דרך הפרופיל זרימה. זרימת בניצב, בשימוש על ידי microsprayer,7 ננו תרסיס קאמרית In-Vitro רעילות (NACIVT),11 , מסחרי עלי מערכות8,9,10,12, מוסיף את פקק של חלקיקים בתוך אזור התצהיר. רבות ממערכות אלה חשיפה וגדולים מגושם, הדורשים מערכות עודף עבור תרסיס מראש מיזוג, משאבות הזרימה, או אפילו חימום לשכות דגירה של תאים. גודל גדול זה מקטין הניידות של המערכת. במקום דגימה ישירות על מקור פליטה, מערכות אלו לעתים קרובות יש דוגמאות הובא אירוסולים מעבדה או מודל שנוצר לצורך ניתוח. אסור לאבד את המורכבות בתרסיס הנפלט בתרגום מן השדה למעבדה. PIVEC הוא קטן יותר מאשר המערכות הקיימות, עם שטח פני השטח החיצוניים של 460 ס מ2 , במשקל 60 גרם בלבד, עם חום ולחות שולבו מערכת המאפשרת להתקן נייד במיוחד. ירידה בגודל ובמשקל לאפשר למערכת להיות שחוקים או נלקח למקור של חשיפה, המתיר דגימה ישירה.

גודלו של מערכות החשיפה הנוכחית גם פוחתת היכולת לבצע דגימה לחקור את מרחבי מעברי צבע בריכוזים. החלטה זו היא המפתח בעת החלטה על תופעות רעילות של פוטנציאל סביבתיים רבים, סיכון מקצועי כגון פליטה לרכבים חלקיקי החומר או מקום העבודה פעילויות שבו מתרחשת חשוד. מיד לאחר פליטה, הופך שם שונות מרחבית בריכוז החלקיקים. זה גדל עם הזמן כפי החלקיקים לפזר ברחבי האטמוספירה ולשנות אפקטים אלה בהתבסס על תנאי הסביבה, כגון טמפרטורה, לחץ, רוח, שמש. חלקיקים יכולים להתחיל בגיל, נישחק גם פעם הנפלט31,32 , פיזור המחירים המושפעים הטופוגרפיה; ריכוז גבוה ניתן למצוא קניונים ומנהרות, שבו פיזור האפקטים הם האטה, ריכוז נמוך יותר ניתן למצוא איפה יש אזור גדול עבור פיזור. 33 שינויים אלה של פיזור המחירים יכול להיות השפעות משמעותיות על בריאות האדם, ניתן לראות כאשר משווים את המספר של אסתמה מבוגרים המתגוררים עירוני לעומת הכפרי. 34 בעוד מערכות חשיפה רבות לספק דוגמאות מרובים בבת אחת, מערכות מרובות נחוצים עם שפע של ציוד גדול לביצוע רזולוציה מרחבית.

על ידי הבאת מהמעבדה לשדה, הניתנות להפחתה הזמן של ניתוח על-ידי שימוש את כל התא חיישן. בעקבות מנגנונים ביולוגיים ידוע ונקודות קצה יכול לסייע בקביעת הרכב תרסיס ואת גודל. בשל שיטות הסיווג איטי, לרבות בשחרור ליחה, phagocytosis רוברטסונית, חלקיקים אלה לעיתים קרובות אינטראקציה עם תאים כ ימים עד שבועות3 יוצר סטרס חמצוני, דלקת, אפילו מוות של תאים. אלה נקודות קצה ביולוגי יכול להיות נקודות המוצא עבור תוצאה שלילית מסלולים עבור מחלות לב וכלי דם או מחלת ריאות חסימתית כרונית. בנוסף, Wiemenn. et al. לבצע מגוון של מבחני במבחנה כדי להשוות ערכים ספרות לטווח קצר ויוו שאיפת רעילות. 35 In vivo התגובה היה חזה עם שניים מתוך ארבעת תוצאות חיוביות של בדיקות cytotoxicity באמצעות שחרור לקטט דהידרוגנאז, סטרס חמצוני של הפחתת גלוטתיון היווצרות מימן על-חמצני ושחרור, דלקת אפשרית מן הגן הגידול נקרוזה מקדם אלפא. מתוך עשר nanosized תחמוצות מתכת נבדק, שש נבדק כמו פעיל (טיטניום אוקסיד, תחמוצת אבץ ו תחמוצת צריום שונות ארבעה) באמצעות חשיפות בתוך חוץ גופית עם אישור ויוו. 

על מנת לחקור את ההשפעות של אירוסולים בסביבה תעסוקתית, המעבדה שלנו פיתח את PIVEC עבור חשיפות בשטח. בנוסף, PIVEC יכול להיות משוחק על דגימה אישי לפקח ולחקור שאיפת חשיפה כמו קלטת מסנן36 37 mm או מערכות מרובות ניתן להשיג רזולוציה מרחבית בתוך אזור נתון. ב פרוטוקול זה, אפיון ושימוש PIVEC הנדונה. לאחר החשיפה, השפעות ביולוגיות הם נצפו דרך מבחני cytotoxicity.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מפעילי חייב ללבוש ציוד מגן אישי (למשל חלוק, כפפות, משקפי מגן) בעת ביצוע שלבים 1, 2, 3, 5 ו- 6.

1. הכנה של חומרים

  1. להכין חומרים עבור מכלול המערכת ולהבטיח חשיפה הדיר.
    1. ודא שימוש חדש 70% אתנול ניקה ¼" הקוטר הפנימי מוליך צנור ו- ¼" הקוטר החיצוני למחברי או עבור מכלול המערכת.
    2. מאגר חומרים מבחן כולל מסננים, PIVEC רכיבים, פינצטה, אבקות חלקיקים בסביבה מבוקרת היטב, לגבי טמפרטורה, לחות, במשך לפחות 24 שעות לפני הניסוי.
      הערה: הטמפרטורה צריכה להיות קרוב לטמפרטורת החדר, כ 20 ° C, עם לחות יחסית פחות מ- 35%. זה חשוב מאוד להשיג את הדיר בין ניסויים.
    3. להכין את מוני חלקיקים באמצעות אלכוהול איזופרופיל לנקות חלקים ולאפשר מערכת החימום על-פי המלצות היצרן, כולל ניידות סריקה של חלקיקים סייזר (SMPS), חלקיקים אופטיים סייזר (OPS) למדידה.

2. דור של תרסיס יבש

הערה: מפעילי יש לבצע תרסיס דור בשכונה fume.

  1. להרכיב מערכת להפקת אירוסולים יבש
    הערה: התליה של חלקיקי גז או נוזל צריך להיות מתאים התרבות מעוצבת של יישום, תא. השיטה הבאה יכולה להתבצע באמצעות תרסיס בנוזל. העיצוב של המערכת תרסיס יבש הוא מפני אש ואח. 37 סכימטי של מערכת פיזור יבש מוצג באיור1.
    1. את ברז להתחבר בכל קצה של גודל השחיל הצינור 4" 1/8, זה ישמש הופר חלקיקים. להתחבר 2" 1/8 גודל צינור ברז אחד.
    2. שוקל חלקיקים נחושת, במחקר זה ריכוז מסה עבור כל גודל החלקיקים נשמר קבוע תוך קביעת היעילות התצהיר. להשתמש 7.5 מ"ג של 40 ננומטר נחושת חלקיקים, 7 מ"ג של חלקיקים nm נחושת 100 מ"ג 13 של חלקיקים 800 nm נחושת לכל חשיפה. למקם את חלקיקי נחושת הופר חלקיק דרך הקצה הפתוח.
      הערה: כמות חלקיקי נחושת שקל ישמש המיסה מבוסס ריכוז מנוהל.
    3. המקום של 3" פיסת הקוטר החיצוני (OD) אבובים ½" סביב צינור 2" המקום HEPA מסנן בתוך צנור קצר זה כך כיוון הזרימה היא דרך ברז.
    4. להתחבר הגנרטור ואקום שסתום כדור אחרים באמצעות שרשור. להתחבר ואקום גנרטוריים מיכל אוויר על-ידי הצבת של "5/16" OD צינורות לתוך הקשר דחיפה-כדי-lock. השתמש OD אבובים ¼" כדי להתחבר לשקע של הגנרטור ואקום הסידור ניסיוני על ידי הנחת הצנרת מעל השקע של הגנרטור ואקום.
  2. השימוש במערכת תרסיס יבש כדי ליצור תרסיס יבש
    1. לפתוח את המיכל אוויר על-ידי סיבוב שמתחזקים את הברז הראשי ולאפשר זרימת אוויר למערכת. לפתוח את השסתום על המתקן זרימה על המיכל אוויר, להגדיר כך הזרימה דרך המערכת שווה ההגדרות הרצויות על המשאבה ואקום.
    2. פתח את ברז הקרוב מסנן HEPA ולאחר מכן לפתוח את ברז ואקום גנרטוריים הקרוב ביותר. פקח אלה עבור 3 s כדי לאפשר חלקיקים ששולפים לתוך זרם האוויר.
    3. לסגור את ברז הקרוב ואקום מחולל ולאחר מכן לסגור ברז הקרוב מסנן HEPA. לאפשר האוויר ממיכל לזרום משך זמן הניסוי לפי הצורך.
    4. סגור שסתומים הראשי, הרגולטור על מיכל אוויר כדי לעצור את הזרימה. נקי כדוריים, ואקום גנרטוריים באמצעות אתנול 70%. אוטוקלב צינורות מתכת עבור עיקור.

3. בתצהיר היעילות מדידה באמצעות PIVEC

הערה: מפעילי יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

  1. למדוד את התצהיר על ידי איסוף בתרסיס nanoparticle נחושת שנוצר בשלב 2.2 על מסנן קדם שנשקל. השתמש את המינון הופקדו, נמדד באמצעות המסה שנאספו על המסנן, והמנה מנוהל, נמדד באמצעות כמות החלקיקים נחושת שנשקל, כדי לקבוע את היעילות התצהיר.
    1. שמור 1.00 מיקרומטר נקבובית זכוכית סיבים מסננים בתנאים לחות נמוכה, שמתואר 1.1.2, במשך לפחות 24 שעות לפני טרום חשיפה מדידות. שוקל מסנן בשימוש שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. המקום למסנן שאינם בשימוש של תרבות תא הכנס.
    2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם (6 טוב או טוב 24) עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. המקום התרבות התא להוסיף מתאם פיסת על הבסיס PIVEC, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה.
    3. שימוש פינצטה כדי למקם תרבית תאים מסנן נטען להוסיף בתוך חתיכת מתאם. מניחים את החלק העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
    4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
    5. לעטוף את החימום resistive סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
    6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
    7. לחבר 2" חתיכה ארוכה של 1/2" הקוטר החיצוני גמיש אבובים על המתאם על גבי PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
    8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. הגדרת להשלים עם משאבת ואקום, מוני חלקיקים, הגדרת תרסיס.
      הערה: המינון הופקדו המבוססת על מספר יכול להיקבע רק אם מוני חלקיקים ממוקמים לפני את PIVEC ואחרי את PIVEC על מסלולים נפרדים.
    9. חושפים את המסננים באמצעות שלב 2.2 פרוטוקול, זמן החשיפה הרצויה וקצבי זרימה, במחקר זה שזמן החשיפה של 10 דקות-0.5 LPM שימש. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב תרבות תא ולמקם את המסנן חשוף בעל מסנן תחת תנאי לחות נמוכה לפחות 24 שעות לפני מדידות.
    10. PIVEC נקי עם 70% אתנול. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
    11. שוקל את המסנן חשוף שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. מקם את המסנן חשוף בעל מסנן תוויות עבור אחסון.

4. חישוב של הפקיד מינון ויעילות התצהיר

הערה: הידע של העדות הוא חשוב עבור המינהל תרסיס ופרשנות של תגובת תאי.

  1. לחשב את התצהיר של מדידות מבוסס-מסה
    1. לחשב את המסה הופקדו על מסנני כהפרש בין משקל ממוצע טרום חשיפה לבין משקל ממוצע לאחר חשיפה. ערך זה הוא המינון הופקדו מבוסס-מסה לניסוי.
    2. שימוש מנוהל מסה, מ'admin, המבוסס על מסה שהופקדו המינון נקבע 4.1.1, זה-dep, כדי לחשב את היעילות התצהיר מבוסס-מסה, ηמ', לניסוי.
      figure-protocol-1
    3. ממוצע של ערכים מן 4.1.1 4.1.2 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.
  2. לחשב את התצהיר של המבוססת על מספר מדידות
    1. ודא כי מדידות עם מוני חלקיקים בוצעו עם מוני לאחר את PIVEC, כדי לקבוע ריכוז החלקיקים לפני PIVEC. לשלב את ריכוז החלקיקים לאורך זמן עבור המונה חלקיקים ואז לשלב מעל קוטר של חלקיקים כדי לקבוע את הסכום הכולל חלקיקים נמדד.
    2. לחשב את מספר החלקיקים הופקדו כהפרש בין החלקיקים מנוהל חלקיקים למדוד את הפוסט-PIVEC. ערך זה הוא המינון הופקדו המבוססת על מספר לניסוי.
    3. שימוש מנוהל חלקיקים, nadmin, המבוססת על מספר להפקיד במינון ndep, ספיקה, V, זמן, t, כדי לחשב את התצהיר המבוססת על מספר יעילות, ηn, לניסוי.
      figure-protocol-2
    4. ממוצע של ערכים 4.2.2 ו 4.2.3 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.

5. תרסיס חשיפה של תאים

הערה: עבור התא תרבות הממשק אוויר נוזלי הקורא נקרא ריק ואח. 38 אופרטורים, יש לבצע הוספה תרבות תא טעינה (צעדים 5.1.2-5.1.4) בתוך ארון אבטחה. אופרטורים, יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

  1. התרבות תאים על ממשק אוויר נוזלי
    1. הרם A549 תאים מן הבקבוק תרבות על-ידי הוספת טריפסין-EDTA, 3 מ"ל בקבוקון T75 או 1 מ"ל על בקבוקון T25, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C. להוסיף 7 מ של מדיה מלאה עבור בקבוקון T75 או 4 מ"ל של התקשורת מלאה T25 הבקבוקון אל הבקבוק, יש לשטוף את הבקבוק קיר עם השעיה תא למקסם את מספר התא התאושש. להעביר את המתלים תא צינור חרוטי סטרילי 15 mL ואז צנטריפוגה תאים ב 800 x גרם במשך 3 דקות.
    2. הסר את supernatant המכיל טריפסין-EDTA, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של התקשורת מלאה. להסיר µL 10 של השעיה תא ומוסיפים hemocytometer. לספור תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את הריכוז ואת המספר הכולל של תאים.
    3. המקום 0.5 מ"ל של מדיה מלאה כל טוב בתוך צלחת טוב 24 שעות ביממה. מקום מוסיף התרבות תאים שאינם בשימוש בארות. תרבית תאים זרע מוסיף בצד הפסגה צפיפות תא ליד עונה 1 פרק 105 תאים/cm2 עבור סוגי תאים לגדול בקצב ליד הכפלת ליום. זרע A549 תאים בתוך בגודל 24 להוסיף טוב, להוסיף תאים זרע על צפיפות של עונה 1 פרק 105 תאים/cm2 על-ידי הוספת תאים 35,000 התרבות התא.
      הערה: תאים עם קצב צמיחה איטי יכול להיות נזרע על צפיפות תאים מוגברת.
    4. הוסף מדיה מלאה לצד הפסגה של התא תרבות הוספה כדי להגיע את עוצמת הקול הסופי (עבור 24 צלחת טוב נפח סופי הוא 0.25 mL).
    5. תרבות במשך 7 ימים בתנאים המשוקע, החלפת מדיה כל 1-2 ימים. לאחר 7 ימים, הסר את הפסגה המדיה והתרבות לפחות יום אחד בתנאים עלי, החלפת רק התקשורת basolateral.
  2. להרכיב PIVEC
    1. מאפשרים לתאים equilibrate לממשק אוויר נוזלי לפחות 24 שעות לפני החשיפה.
    2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. תרבית תאים המקום להוסיף מתאם חתיכה על גבי PIVEC הבסיס, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה. להוסיף 4 מיליליטר תא תרבות המדיה הבאר של בסיס PIVEC.
    3. שימוש פינצטה כדי למקם את התרבות התא להוסיף בתוך חתיכת מתאם להציב בשלב 5.2.3. מניחים פיסת העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים היטב, PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
    4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC, על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
    5. לעטוף חימום התנגדות סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
    6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
    7. להתחבר קטע קצר של 1/2" צנור גמיש הקוטר החיצוני המתאם בראש PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
    8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. השלם את קביעת עם משאבת ואקום, הגדרת תרסיס.
  3. לחשוף תאים-עלי באמצעות את PIVEC
    1. להשתמש יעילות התצהיר נקבע בשלב 2 כדי לחשב את המסה של חלקיקי להיות aerosolized. שוקל מסה המתאים ולהוסיף מערכת תרסיס להגדיר בעקבות שלב 2 בתוך המנוע fume.
    2. לחשוף תאים על-ידי ביצוע שלב 2.2 במחקר ביולוגי נקודות הקצה של התאים נחשפו כ- 3.5 מ"ג של חלקיקים נחושת עם קצב זרימה של 0.5 LPM, משך חשיפה של 10 דקות שליטה מחקרים שבוצעו לקביעת אוויר humidified השפעת אוויר לבד. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב התרבות תאים, מניחים בצלחת טוב סטרילי וחוזרים החממה2 CO (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 90% לחות).
    3. האחות המדיה מן PIVEC. אם ביצוע ניסויים נוספים, שטיפה התחתון של PIVEC עם פוספט buffered פתרון ולאחר מכן חזור על שלב 5.1 ו- 5.2.
    4. PIVEC נקי עם אתנול 70% בסיום. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
  4. נהלים וזמינותו הביולוגית
    הערה: מבחני שבוצעה במחקר זה היו דור סטרס חמצוני דרך וזמינותו DCFH-DA cytotoxicity דרך שחרור לקטאט דהידרוגנאז (LDH).
    1. להמיס 24.4 מ"ג של DCFH-DA ב 50 מ ל מתנול כדי להפוך פתרון 1 מ DCFH-DA. פתרון זה ניתן לאחסן ב-20 ° C עד 4 חודשים. למהול 1 מ DCFH-DA פתרון על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של 1 מ מ DCFH-DA פתרון 9.9 מ ל HBSS לעשות 10 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-פרקליט המחוז
    2. הסר תא תרבות ומדיה שטיפת תא תרבות עם 1 מ"ל ל- PBS. להוסיף 0.5 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-DA פתרון כל טוב, החלפת מוסיף בסיום. מכסים בצלחת ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photoactivation של לצבוע ולחזור חממה 37° C עבור 1 h.
    3. להסיר תאים של החממה, וארוקן את הפתרון עובד DCFH-DA מן הבארות. להוסיף 0.5 mL HBSS בארות ולהחליף מוסיף התרבות תאים.
    4. לטעון את הצלחת היטב לתוך צלחת קורא ולמדוד פלורסצנטיות בסיסית באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר. הסר צלחת צלחת קורא ו'טען הוספה לתוך PIVEC לחשיפה.
    5. לחשוף תאים למשך החשיפה הרצויה. הסר הוספה PIVEC ולחזור לבסיס טוב. הסר µL 50 של נוזל basolateral צלחת טוב והמקום בצלחת טוב לבן 96. למדוד את זריחה של DCF באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר בכל 30 דקות לאחר חשיפה כבר שעתיים.
    6. תן נוזל basolateral equilibrate לטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות להוסיף 50 µL של LDH assay פתרון, מעורבות פרוטוקול יצרן הבאים, כדי basolateral נוזלים צלחת היטב ולתת מגיב במשך 10 דקות להוסיף 25 µL של להפסיק פתרון טוב. לקרוא זריחה של מוצר resorufin באמצעות עירור/פליטה אורכי גל 560/590 ננומטר.
    7. להסיר נוזל basolateral נוספות, חזור על שלב 5.4.6 ב 4 שעות ו- 24 שעות לאחר חשיפה.

6 שיטות סטטיסטיות

  1. ניתוח של נתוני וזמינותו הביולוגית
    1. דוח ROS ייצור כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית תאי המטופל ביחס למדידות בסיסית. דו ח פעילות LDH כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית של תאים שטופלו ביחס תאים ללא טיפול.
    2. לבצע גורם יחיד ANOVA כדי לקבוע הבדלים סטטיסטיים בין ערכות נתונים. במקרים המתאימים, לבצע סטודנט t-בדיקות לפי שווי של מובהקות של 0.05. לדווח נתונים כמו הממוצע ± סטיית התקן של פחות שלוש מדידות חשיפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תעסוקתית במבחנה הרעלים כוללת שמירה על יכולת הקיום הסלולר תוך כדי ביצוע החשיפה תרסיס. מערכת PIVEC מוצג באיור 2, לרבות הטמפרטורה, בקרת לחות, את PIVEC שחוקים. הטמפרטורה נשמר באמצעות תנור resistive המופעלים באמצעות סוללות והגדילה תרסיס humidified באמצעות לחות טבעי דרך צינור נקבובי, שנרטבו. תרסיס מבוקרת הגדרת בתוך מעבדה, PIVEC יכולה להיות הגדרת חשיפה המוצג באיור1. אפיון המערכת מאפשרת קביעת המינון הופקדו על גבי התאים אשר ישויך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מסנן קלטות מספקות שיטה פשוטה, זולה של איסוף אירוסולים באזור נשימה; עם זאת, תרסיס מופק מסננים לא מייצגים את תרסיס כולו (כלומר גזים שיכללו חומרים נדיפים, חלקיקים) ודוגמאות כתוצאה מכך להגביל את ההערכה של השפעות ביולוגיות קשורים. באמצעות העיצוב הראשוני בקלטת מסנן 37 mm, PIVEC נועד לשמור על ניידות ומחקים את ויוו הפקדת חלקיקים משאיפת. PIVEC הוא קטן באופן משמעותי יותר הנוכחי עלי חשיפה למערכות, בערך בגודל של תיבת רקמת עם בקרת טמפרטורה ולחות כלל. הגודל הוא דומה impactors אשד אישי תוך מתן נתונים על התגובה התאית בתרסיס בנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לשיוך המחברים הוא כפי שמוצג בעמוד השער. המחברים נתמכים כלכלית על ידי אוניברסיטת וירג'יניה חבר העמים, לאן שהעבודה הושלמה בריצ'מונד, va המחברים יש אחריות מלאה הכתיבה והתוכן של המאמר. המחברים מצהירים כי ישנם אין אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים רוצה להודות בוריס סולומונוב, החנות המכונה החדשנות של חבר העמים הבריטי וירג'יניה לעזרה עם שטנץ מהירה המכשיר. המחברים רוצה גם להודות Cristian רומרו-פואנטס של קבוצת Lewinski, ד ר Vitaliy Avrutin, ד ר דמיטרי Pestov, וירג'יניה קהיליה ננו הליבה אפיון המתקן על עזרתם עם איפיון חלקיקים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה סופק לו ד ר Lewinski על ידי המכללה האקדמית להנדסה באוניברסיטת וירג'יניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סריקת גודל חלקיקי ניידות (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
גודל חלקיקים אופטי (OPS)TSI, Inc.3330
, 4 אינץ' ארוךMcMaster-Carr4830K116קיר סטנדרטי 304/304L, מושחל בשני הקצוות, 1/8 גודל צינור
שסתום כדור פליז עם ידית מנוףMcMaster-Carr4112T12דירוג קומפקטי בלחץ גבוה, צינור פלדה נקבה 1/8 NPT
2 אינץ' ארוךMcMaster-Carr7753K121, מושחל בקצה אחד, 1/8 גודל
צינור HEPA filterGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap חד פעמי סינון אוויר קפסולה
מחולל ואקוםPISCO ארה"בVCH10-018C
PIVECVCUלעיצוב אנא צור קשר עם
מחברים מחמם
1/4 אינץ' מחברים דוקרנייםZefon International, Inc.
צינורות נקבובייםScientific Commodities, Inc.BB2062-1814Aהידרופילי 10 אום נקבוביות
סוללה בנק
הכנס תרבית תאיםפישרברנד35309524 באר הכנסת צלחת
מלקחיים מסנןפישרברנד09-753-50
העברת פיפטהThermoScientific13-711-27
מסנני סיבי זכוכיתSKC225-7סוג ללא קלסר מסנן AE 37 מ"מ 1.00 אום נקבוביות
Ultra Micro BalanceA& DBM-22שוכנת בתא סביבתי
קלטת מסנן 37 מ"מSKC225-3250קלטת מסנן ריקה, 37 מ"מ,
משאבת ואקום בזרימה משתנהSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 עד 5000 מ"ל לדקה
חלקיקי נחושתU.S. Research Materials, Inc.US109040 ננומטר
U.S. Research Materials, Inc.US1088100 ננומטר
U.S. Research Materials, Inc.US1117M800 ננומטר
צינור נירוסטה , קיר סטנדרטיהתנגדות459743כוח סוללה של סטירן שקוף חלקיקי נחושת חלקיקי נחושת

מקורות

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31(2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8(2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20(2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514(2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33(2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16(2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

in vitro
חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.