הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

22 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

תקציר

חיסונים הם המאהה 20 רפואי פלא. הם צמצמו באופן משמעותי את התחלואה ואת התמותה הנגרמת על ידי מחלות זיהומיות, תרמה עלייה מרשימה בתוחלת החיים ברחבי העולם. למרות זאת, קביעת ליעילותו נשאר אתגר. מתעוררים הראיות עולה כי החיסון acellular הנוכחי (aPV) נגד שעלת בורדטלה (נולד ב- שעלת) מעניקה חסינות שיוצרת. לכן, האתגר העיקרי הוא עיצוב חיסון הדור הבא שגורם חיסון הגנתי ללא תופעות לוואי לוואי של חיסון כל-תא (wPV). כאן נתאר פרוטוקול השתמשנו כדי לבדוק את היעילות של אדג'וונט מבטיח, הרומן הטיה החיסון התגובות הפנוטיפ Th1/Th17 מגן ומקדם סיווג יותר אתגר שעלת דרב מ במערכת הנשימה מאתר. מאמר זה מתאר את פרוטוקול העכבר חיסון, חיסון חיידקי, קצירת רקמות של ניתוח של תגובות חיסוניות. באמצעות שיטה זו, בתוך המודל שלנו, אנו יש בהצלחה מבואר מנגנונים מכריע שהפיק חיסון שעלת acellular מבטיח, הדור הבא. בשיטה זו ניתן ליישם כל דגם למחלות זיהומיות על מנת לקבוע את יעילות החיסון.

מבוא

חיסונים מייצג את אחד ההישגים בריאות הציבור הגדולים של המאה ה-20, אך אנחנו עדיין אינם מבינים את המנגנון שלפיו חיסונים מצליח לעורר חיסון הגנתי. הזיהוי של חתימות מולקולרית (למשל., סמני הפעלת התא, הרחבה של סוגי הסלולר, ביטוי גנים) המושרה לאחר החיסון מספק שפע של מידע על חיזוי ותפיק יעיל התגובה החיסונית. המורכבות של פתוגן-פונדקאי תגובות לא ניתן שלמאחה לשכפל באמצעות במבחנה מערכות התרבות התא1. In vivo חיסון מודלים נועדו להעריך/ת מספר סוגי תאים חיסוניים בתוך המארח. זה מספק יתרון בעת אפיון חיסון נגד אנטיגן עיבוד, מצגת, הפרשת ציטוקינים דיפרנציאלית והרחבה של תאים חיסוניים. הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה מפורטת כדי לקבוע יעילות החיסון דרך הערכת התגובות החיסונית מערכתית ומקומיים, כימות של פתוגן נטל ברקמות של ריבית. דוגמה שסופק כאן בדיקות היעילות של חיסון ניסיוני עבור המחלה בורדטלה שעלת (נולד ב- שעלת).

שעלת דרב הוא חיידק גראם שליליים זה הסוכן etiological של מחלות נשימה שעלת (שעלת)2,3. מגע קרוב עם אנשים נגועים (סימפטומטי או אסימפטומטיים) מוביל הילוכים, קולוניזציה של המחלה. למרות החיסון העולמית משמעותי כיסוי4, שעלת נחשבת מחלה resurging במדינות רבות ברחבי העולם, היא הגורם העיקרי בילדות למניעה מקרי מוות5,6,7, 8. בשנת 2015, שעלת דרב שעלת ו נכללו בין המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מתעוררים רשימת פתוגן/מחלה זיהומית, מדגישים את הצורך פיתוח של חיסון יותר מקנה חיסון הגנתי חיים ארוכים.

כיום, אזור פעיל בחקירה כדי לשלוט תחיית שעלת היא פיתוח של חיסון שעלת acellular הדור הבא (aPV) עם שילוב אופטימלי של הרומן adjuvants ו אנטיגנים לחקות את התגובה החיסונית שהפיק את כל התא שעלת חיסון (wPV)9. באמצעות פרוטוקול המתואר, דיווחנו לאחרונה השינוי של הנוכחי שאושרו על-ידי ה-FDA aPV על ידי התוספת של אדג'וונט הרומן, בורדטלה קולוניזציה גורם א' (BcfA), הביא להפחתת יעיל יותר של שעלת דרב חיידקי טעינה הריאות העכבר10,11. הגנה מוגברת זו לוותה את הטיית של אלום-induced Th1/Th2 תגובה חיסונית הפרופיל החיסונית יותר מגן Th1/Th1710. פרוטוקול זה הוא מפורט ומקיף, הפעלת החוקר לקבל מידע מקסימלי באמצעות הערכה משולבת של המחשב המארח ו תגובות חיסוניות למגוון של פתוגנים.

הפרוטוקול המתואר כאן עוקב אחר לוח הזמנים חיסון נציג, המוצגת באיור 1, כדי להבטיח תגובות חיסוניות מארח אופטימלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויים שנערכו על בעלי חיים נערכו בעקבות פרוטוקול שאושרו על-ידי IACUC של אוניברסיטת מדינת אוהיו בהתאם להנחיות IACUC. C57BL/6 עכברים שימשו כל החיסונים וזיהומים. גם זכר וגם נקבה עכברים משמשים בכל קבוצה לפי הנחיות NIH. מספר החיות לכל קבוצה נקבע על ידי כוח חישובים בהתבסס על ההבדלים החזוי התוצאה בקרב קבוצות הניסוי. לדוגמה, עכברים 8 לכל קבוצה תניב 80% כוח-α = 0.05 (דו-צדדית) עבור 2-sample t- test כדי לזהות הבדלים בין התוצאה של האינטרס של 1.33 סטיות תקן (מרחביות).

1. חיסון של עכברים

  1. להכין תערובת בסיס חיסון במאגר פיזיולוגית סטרילית כמו תמיסת מלח או DPS.
    הערה: הנפח הכולל בתערובת צריך לכלול 10% יותר מאשר זה נדרש חיסון בקבוצה כולה. ריכוזים של הרכב החיסון מפורטים להלן בשלבים 1.1.1 ו 1.1.2. מעבירים את הפריטים ביבר על קרח.
    1. ללימודים שעלת דרב , כוללים את הקבוצות חיסון הבאות: aPV ו aPV + BcfA. בנוסף, להשתמש אלום, חיסון נגד אנטיגנים לבד (FHA ולאחר Prn) ועכברים תמימה (ללא חיסון) קבוצות שליטה.
      הערה: aPV הוא 1/5ה המינון האנושי של aPV שאושרו על-ידי ה-FDA, המורכב משילוב של טטנוס טוקסואידי טוקסואידי מופחתת דיפתריה, שעלת טוקסואידי (PT), filamentous hemagglutinin (FHA), pertactin (Prn) הספוחה כדי מלחי אלומיניום. מנה אחת האנושית של aPV שעלת הנוכחי הוא 0.5 מ ל, לכן, 1/5ה מינון הוא 0.1 מ"ל. אמצעי אחסון עבור aPV + BcfA הם 0.1 מ"ל של aPV (1/5ה המינון אנושי) + mL 0.046 של BcfA (30 µg) לכל העכבר. אמצעי האחסון המרבי יכול להיות בבטחה מועברת שריר אחת היא 0.1 מ"ל. כי aPV + BcfA חיסון נפח גדול מ- 0.1 מ"ל, החיסון צריך להישלח לתוך שתי הכתפיים, מחולק בערך באותה מידה, על מנת להינתן בבטחה.
    2. כדי להכין חיסון ניסיוני, למנה אחת לשלב 1 µg של FHA 0.5 µg של Prn עם 50 µg של אלומיניום הידרוקסיד ג'ל ב- PBS סטרילי. אפשר את aPV ניסיוני לערבב על גלגלת מעבדה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, לסובב את הצינור ב- g x 18,000 עבור 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התוכן ב- 1 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. ביבר, הגדר את מכונת ההרדמה (איור 2).
    הערה: ודא קיימות רמות מספקת של חמצן, איזופלוריין במיכלים בהתאמה שלהם לפני השימוש. שוקל את המיכל נבלות איזופלוריין ולהחליף כאשר משקלו מגדילה 50 גרם.
  3. ביסודיות לנקות את הארון בטיחות ביולוגית (BSC) ומניחים את התא אינדוקציה נקי בפנים BSC. לחבר את הקווים נבלות והרדמה ממכונת ההרדמה אל התא אינדוקציה. פתח את החמצן הטנק באמצעות המתקן כדי להבטיח חמצן זורם והגדר את רמת 1.5-2 L/min.
  4. הצב עכברים בגיל הרצוי (6-12 שבועות) אל החדר אינדוקציה. הפעל את איזופלוריין ל- 2.5-3% על מנת בקלות ראש עזים ומתנגד העכברים. נטר את החיות עד שהם לא עוברים בקנה הנשימה שלהם הואט.
  5. מבחן הרמה של אינדוקציה על ידי הבוהן-צביטות, התבוננות עבור כל תנועה רפלקסיבי. אם אין כאלה, אז העכברים מוכנים להזריק.
    הערה: בניסוי זה, לכלוב שלם של בעלי חיים היו מרדימים בבת אחת. ניתן לבחור עזים ומתנגד חיות בנפרד להזרקה או להזריק את החיות ללא הרדמה. באחת משיטות אלו הוא המתאים.
  6. בינתיים, להכין 1 מ"ל מזרקים אינסולין (28G 1/2) עם 0.1 מ"ל של כל חיסון. כאשר בעלי חיים הם המושרה באופן מלא, להסיר חיה אחת מן החדר ושכבה העכבר ventrally על משטח במגבת או ספסל.
  7. לנהל את החיסון intramuscularly. עם המזרק בזווית של 45 מעלות עם שפוע פונה כלפי מעלה, להכניס את המזרק ~ 5 מ"מ שריר הדלתא של העכבר, להזריק את החיסון.
    הערה: האחוריות רבעון/האגף עשוי לשמש כאתר הזרקת במקום שריר הדלתא.
  8. לאחר ההזרקה, להשאיר את המחט מוכנס לשריר עבור s ~ 5-10. ברגע האחסון מועבר, לסובב את המזרק ב- 180° כך השיקוע פונה משם כדי ליצור חותם ולמנוע דליפת החיסון. ואז, לאט לאט להוציא את המחט ההזרקה.
  9. להחזיר את העכבר על הכלוב. חזור על התהליך עם כל בעלי החיים בקבוצה המיועדים לכך.
  10. כבה את איזופלוריין ואת ריקון התא אינדוקציה עם חמצן לפני מאלחש את הכלוב הבא של עכברים.
  11. נטר את החיות עד שיהיו כל התראה ומרגש בכלוב. להחזיר את הכלוב למיקום דיור.
  12. צג חיות כל 12 שעות פוסט חיסון, למעלה עד 48 שעות, עבור תסמינים קליניים של תחלואה כגון מחוספס/מסורקות המעיל, איטי הילוך, או קשה לה לנשום. אם התופעות ממשיכות להתייעץ עם הוטרינר מוסדיים ולהסיר העכברים מן המחקר במידת הצורך.
  13. ארבעה שבועות לאחר חיסון ראשוני, להגביר את העכברים מאת מאלחש, מתן זריקות תוך שרירית לתוך שריר הדלתא נכון של העכבר עם אותו ניסוח חיסון שניתן בעבר.
  14. שוב, לפקח על בעלי חיים עבור תסמינים קליניים. בית חיות למשך שבועיים נוספים ולאחר מכן המשך עם זיהום.

2. צמיחה של שעלת דרב זנים, הכנה של זיהום Inoculum

  1. ממניות קפואים [cryopreserved ב-80 מעלות צלזיוס גליצרול 15%, קפוא מגידול פלנקטוניים הוספת גוון לסמלים-Scholte (הה) מדיה12], פס החוצה שעלת דרב על צלחות13 אגר בורדה-Gengou (BG) בתוספת של 10% defibrinated כבשים דם, 100 µg/mL סטרפטומיצין (10% BG + Sm) לבחירה. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.
  2. לבחור ~ 8-10 מושבות בודדות של strain(s) מהצלחת, לחסן 3 מ"ל של האס. אס מדיה בתוספת 22.8 מ מ L-ציסטאין 3.6 מ מ גופריתי, ניאצין 3.3 מ מ, מ מ 48.8 גלוטתיון, חומצה אסקורבית מ 227, heptakis 1 מ"ג/מ"ל, סטרפטומיצין µg/mL 100. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס תוף רולר-סל ד 60 עבור 16-24 שעות.
  3. למחרת, לדלל את תרבות ראשי 1:600, 1:300, 1:120, יצירת, 1:30 ו- 1:15 ב 3 מ"ל של מדיה SS שהושלם. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס בחבית רולר-סל ד 60 עבור 16-24 שעות.
  4. לבצע מדידות צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) עבור התרבויות חיידקי. באמצעות וואקום ספקטרופוטומטרים, לדלל 1:10 תרבויות על-ידי הוספת 0.1 מ"ל של התרבויות נוזלי 0.9 מ של PBS סטרילי.
  5. בחר בתרבות עם יתר600≈ 0.8-1.2. לחשב את אמצעי האחסון הדרושים כדי לקבל 1 OD (איור 3). לסובב את הווליום בצינור microcentrifuge 1.5 mL ב 6000 x g למשך 5 דקות ב 25 º C. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend צנפה תא החיידק ב 1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להשיג צפיפות של 1 OD/mL [1-3 x 109 המושבה יוצרי יחידות (CFU) /mL].
  6. כדי להכין את inoculum של 5 ~ x 105 כדי 1.5 x 106 CFUs/עכבר ב 40-50 µL, המערבולת ו באופן סדרתי לדלל את הפתרון חיידקי (מתוך שלב 2.5) 100-fold ב 1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להשיג ~ 1-3 x 107 CFUs/mL (איור 4א). מעבירים את inoculum ביבר על קרח.

3. מודל מאתר זיהום תוך-אפי

  1. ביבר, הגדר חמצן ותנאי הרדמה כפי שתואר בשלבים 1.3 ו- 1.4. כפי שמתואר בשלב 1.5, מקום העכברים בבית הבליעה כדי עזים ומתנגד. נטר את החיות עד הרדמה נכנס לתוקף.
  2. כאשר העכברים הם מרדימים, להסיר חיה אחת בכל פעם מן החדר אינדוקציה. הרם את העכבר הזה. של בית החזה הגבי, מאחורי השכמות והצוואר. מקם את זקוף העכבר כדי לגשת האף.
  3. באמצעות טיפ פיפטה µL 200, להחיל לאט 40-50 µL של inoculum חיידקי נארס של העכבר (µL 20-25 בכל n האם). החזק את העכבר עד נשאף את inoculum כולו על-ידי החיה. אם חלק הבועות inoculum החוצה, לאסוף את הבועות, מחדש להחדיר לתוך נארס. לספק כמות שווה של PBS סטרילי לקבוצה אחת של עכברים כפקד שלילי.
  4. כפי שנעשה צעדים 1.10-1.12, לחזור החיות חוסנו הכלוב שלהם ונטר את החיות עד שהם התראה ומרגש. להחזיר את הכלוב בחזרה אל מרחב דיור המקורי על המדף. לרוקן את התא אינדוקציה עם חמצן כדי להסיר את שאריות איזופלוריין לפני מאלחש הסט הבא של בעלי חיים. לפקח על החיות במשך 48 שעות לאחר הפגיעה.
  5. במעבדה, נמסר דילולים טורי צלחת של inoculum, ב- PBS סטרילי, כדי לוודא CFUs בפועל את העכברים. צלחת 0.1 מ"ל של דילולים על 10% BG + צלחות Sm (איור 4א). מקם את הצלחות בחממה 37 ° C ולגדול במשך 4 ימים. לספור ולחשב את CFUs מ inoculum להעביר את העכבר (איור 4B).

4. קציר של רקמה חיה לאחר ההדבקה

  1. היכונו לנתיחה העכבר ו רקמת הקציר.
    1. לחטא את כל הכלים (בסדר וגסים מספריים, מספריים מעוגלים, מלקחיים בסדר, גלולה בקווקז ו חזה משולש) לצורך עיבוד רקמות ב החיטוי. חותם הכלים בעיקור שקיות. לעטוף את לטקס דאונס זכוכית בנייר ולהוסיף אוטוקלב הקלטת כדי לציין עקרות.
    2. להכין אגר צלחות 1 או 2 ימים לפני הקציר רקמות כדי להבטיח כי לוחות הקרושה לפני השימוש. שעלת דרב, לשימוש 10% BG + צלחות Sm. תווית עבור מחיצת האף, קנה הנשימה והריאות עבור כל עכבר עם דילולים הרצוי, שנקבע מדעית ניסוי.
    3. מילוי ותווית CFU דילול צינורות. הוסף 0.9 מ של PBS סטרילי כדי סטרילי mL 1.5 microcentrifuge צינורות מבוסס על מספר איברים תהליך, דילולים לכל איבר.
    4. צינורות מילוי ותווית לאיסוף רקמות:
      1. מחיצת האף, קנה הנשימה: למלא את צינור microcentrifuge סטרילי mL 1.5 mL 0.3 של קזאין עקר 1% ב- PBS (Ca2 + ו- Mg2 +-חינם). חנות ב 4 º C.
      2. הריאות: להוסיף 2 מיליליטר עקר 1% קזאין PBS צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל ו החנות ב 4 º C. הקציר הריאות בשביל היסטולוגיה, להוסיף 2 מיליליטר 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF) ולאחסן ב RT.
      3. טחול: להוסיף 3 מ"ל של RPMI + 5% FBS לרכבת התחתית חרוט 15 מ"ל. חנות ב 4 º C.
      4. דם: תווית שתי ערכות של צינורות microcentrifuge mL 1.5 סטרילי, אחד עבור כל דם ואחד עבור סרום.
    5. אתנול 70% טרי צריכים להיות מוכנים תמלא בקבוקונים ומרסס בקבוקי על ניתוח.
  2. תחבורה כל החומרים ביבר על עגלה ביום של קציר. לנקות את BSC ולהגדיר את מכונת הרדמה כמו שלבים 1.3 ו- 1.4.
  3. מקום העכברים כדי ניסויים בבית הבליעה אינדוקציה, עם חמצן זורם, להפעיל את איזופלוריין ל 5% והמתן עד חיות חסרי הכרה. להסיר עכברים אחת בכל פעם, cervically לנקוע את החיה כשיטה משנית כדי להבטיח מוות. בעקבות נקע בצוואר הרחם, המתת חסד צריך להיות מאושרות על ידי העדר של קצב הנשימה ו/או העדר רפלקס הנסיגה (הבוהן קמצוץ מבחן).
  4. הצב את העכבר, בצד הגחוני פונה כלפי מעלה, על לוח חיתוך ולהדק את הידיים והרגליים פתוחות. לרסס את הגוף של העכבר עם 70% אתנול.
  5. באמצעות מלקחיים, לפות העור מתחת בבטן, במרכז האגן. באמצעות מספריים חדות, לבצע חתך אנכי עד הלסת התחתונה. לאחר מכן, לנתח את העור מן הקיר הצפק על ידי דחיפת שתי שכבות בנפרד, באמצעות תנועות קטנות עם המספריים סגור. המקום העור בצדי הגופה כדי ליצור שדה פתוח לקציר איברים סטרילי.
  6. לתפוס את הצפק שלמים מתחת לכלוב הצלעות או סביב הכבד, לחתוך ולפתוח נע לכיוון הצלעות. לחשוף את מערכת העיכול התחתונה ולהעביר את המעי הגס משמאל חשיפת הטחול. בעזרת מלקחיים מעוקל, תופסים את הטחול, לנתח את רקמת החיבור עם מספריים. מקום הטחול 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל 3 מ"ל של RPMI + 5% FBS למקום ברכבת התחתית על קרח.
  7. להשתמש מלקחיים כדי לייצב את כלוב הצלעות על הסרעפת וחתך את הסרעפת. הריאות עליו השטחת קצה, ליפול לכיוון עמוד השדרה. לחתוך את כלוב הצלעות בצדדים כדי להסיר את הצלחת השד.
  8. לבודד ולהסיר את אונת הריאה הימנית14, חיתוך ריאתי העורקים והוורידים מעולה. מקום האונה צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10% NBF ומקום הצינור ב RT לפחות 24 שעות לתקן את הרקמות. לבודד את האונות הנותרים של הריאה הימנית ואת הריאה השמאלית. למקם את האונות צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 2 מ של 1% קזאין ב- PBS ומניחים אותו על קרח.
  9. לאחר לחתוך את הוורידים ריאתי וצירי שווייץ הריאות, לאפשר את חלל החזה למלא דם כמו העכבר exsanguinates. באמצעות pipetman של 1 מ"ל עם טיפ, לאסוף את הדם, להעביר אותו הצינור microcentrifuge mL 1.5 שכותרתו מראש. מניחים את הצינורית על קרח.
  10. לאחר מכן, מהצוואר, הסרת הרקמות הרכות (בלוטות parotid, sublingual ואת submaxillary ואת בלוטות הלימפה) מכסה קנה הנשימה. לפתוח ולהסיר את הקרומים מגן סביב קנה הנשימה. . בעדינות, שימוש בסדר. מלקחיים ומספריים, נפרדים קנה הנשימה לבין הוושט בכל רקמת חיבור אחרים העליון של עצם הבריח לחלק התחתון של הלסת התחתונה.
  11. באמצעות מלקחיים, לשמור על קנה הנשימה וחותכים את קנה הנשימה בחלק העליון של עצם הבריח. לנתץ את קנה הנשימה על מנת למקסם את האלסטיות לחתוך את קנה הנשימה בחלק התחתון של הלסת התחתונה מעל הגרון, בידוד ככל האפשר (~ 1 ס מ). הכנס את האיבר צינור microcentrifuge mL 1.5 שכותרתו מראש עם mL 0.3 של 1% קזאין ב- PBS ומניחים אותו על קרח.
  12. בטל הצמדה העכבר ושים אותה ventrally, עם העכבר מול החוקר עבור גישה ברורה אל האף. לרסס את הראש של העכבר עם 70% אתנול, באמצעות הידיים, לתפוס את העכבר ישירות מאחורי הגולגולת.
  13. באמצעות מספריים לחתוך בבשר רך של החוטם, החל מהתחתון של האף, לנוע כלפי מעלה. בנוסף, להסיר את פרווה, עור, שפם סביב האף. לאחר מכן, עם מלקחיים ומספריים מעוקל, הכנס את הטיפים של מספריים נארס עם העקומות מכוון כלפי חוץ, וחתך את המעבר האף לכיוון העיניים, יצירת צורה דמויית V.
  14. בעזרת מלקחיים בסדר, לאסוף את מחיצת האף, רקמה רכה בתוך היווצרות שנוצר. הכנס את רקמת צינור microcentrifuge mL 1.5 שכותרתו מראש עם mL 0.3 של 1% קזאין ב- PBS ומניחים אותו על קרח.
  15. השלך הגווייה בשקית של חומרים מסוכנים. לפני לנתח החיה הבאה, לשטוף את הכלים במים יונים, ולאחר מכן מקם בתוך מלא 70% אתנול. להסיר את הכלים, לנער עודפי אתנול, ולאחר מכן המשך עם הקרע הבא
  16. לנתח כל עכבר בעקבות צעדים 4.3-4.14.
  17. תהליך הרקמות כפי שמתואר להלן.

5. עיבוד של הטחול

  1. מביצועם טחולים, מקום מסננת תא מיקרומטר 70 מנה תרביות רקמה 60 מ מ. שופכים את הטחול ואת התקשורת הנלווים לתוך המסנן, באמצעות הבוכנה של מזרק 3 מ. בזהירות מועכים את האיבר עד היא חלופה מועדפת, מסונן דרך מסננת תא לחלוטין.
  2. לשטוף את המסנן עם 3 מ"ל של RPMI + 5% FBS לתוך המנה תרביות רקמה. לאסוף את התליה תא ולמקם אותו בצינור 15 מ"ל המקורי שלה. Centrifuge הצינורות ב g x 450 דקות 5-4 ° C עד הצניפה התאים.
  3. האחות או decant את תגובת שיקוע ואת lyse כדוריות דם אדומות על-ידי resuspending בגדר ב 2 מ של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) מאגר (150 מ מ אמוניום כלוריד, 10 מ מ אשלגן ביקרבונט, 0.1 מ מ נתרן EDTA). תקופת דגירה של 3 דקות ב RT (25 ° C).
  4. למלא את הצינורות עד 8 מ עם RPMI + 5% FBS צנטריפוגה צינורות ב g x 450 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. האחות או decant את תגובת שיקוע. Resuspend תא כדורי ב 5 מ של RPMI + 5% FBS ונספור splenocytes באמצעות hemocytometer במיקרוסקופ.
  5. חישוב הנפח של התאים הדרושים כדי לעורר 2.5 x 106 תאים לכל טוב. בצלחת 48-ובכן, זרע את התאים ב- 0.5 מ של מדיה T-cell (RPMI 1640 + 10% FBS, גנטמיצין µg/mL 10 וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר) לכל טוב.
  6. על סמך החישוב לעיל, למקם את אמצעי האחסון הדרושים של התליה תא לתוך צינור טריים, תאי-גלולה ב g x 450 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
  7. Resuspend בגדר בהיקף הנדרש של T-cell מדיה. עבור מודל זיהום שעלת דרב , בדיקת אנטיגן ספציפי ציטוקין תגובת חיסון נגד אנטיגנים: pertactin (Prn) הידבקות filamentous hemagglutinin (FHA). לפיכך, נדרשים טיפולים 3: 1) לא גירוי (NS, כמו שליטה שלילי), 2) Prn ו 3) FHA. עבור וזמינותו, 7.5 x 106 תאים ב- 1.5 מ ל T-cell מדיה הוא נדרש (2.5 x 106 תאים לכל 0.5 מ"ל).
  8. Aliquot 0.5 מ של התליה תא לתוך צלחת 48-. טוב.
  9. לעורר תאים, מערבבים אנטיגנים על פי 2 את הריכוז הרצוי ב- T-cell מדיה. סופי ריכוזי Prn FHA = 1 µg/mL ו- 0.5 µg/mL, בהתאמה. לכן, מערבבים 2 µg/mL Prn או 1 µg/mL FHA ב- 0.5 מ. ואז, aliquot 0.5 מ של המדיום גירוי לתוך כל איזור, דילול הטיפול אנטיגן x 1 באמצעי אחסון הסופי של 1 מ"ל כל היטב.
  10. דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2. לאסוף supernatants ביום 7 aliquot 0.5 מיליליטר supernatants לתוך צינורות microcentrifuge שכותרתו מראש. אחסן את הדגימות-20 ° C עד מוכן לבחון אנטיגן ספציפי ציטוקינים מאת אליסה (איור 6).

6. עיבוד של הריאות

  1. להעביר את הריאות (ב מ 2 ל 1% קזאין ב- PBS) לתוך מהמגן דאונס סטרילי, 15 מ"ל. שימוש המרוסקים כדי homogenize רקמות. מביצועם עד להישאר אין חלקיקים גדולים של רקמות. המקום ההשעיה homogenized חזרה בצינור 15 מ"ל המקורי.
  2. הסרה של mL 0.3 aliquot עבור ציפוי CFUs ו centrifuge של homogenate-450 גרם x עבור 5 דקות ב 4 º C. לאסוף, aliquot תגובת שיקוע ב- 0.5 מ"ל aliquots לתוך microcentrifuge מראש שכותרתו צינורות. אחסן את הדגימות-20 ° C עד הניתוח של ציטוקינים מאת אליסה.
  3. הכן דילולים שבחרת על ידי באופן סדרתי דילול 0.1 מ"ל של ההשעיה ריאות הומוגני דילול צינורות (0.9 מ"ל של PBS סטרילי). צלחת 0.1 מ"ל של דילולים מדעית שבחרת אל שכותרתו מראש 10% BG + צלחות Sm וכפולה באמצעות משולש סטרילי מפזר.
  4. תקופת דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס באוויר החדר של 4 ימים.
  5. לספור ולחשב CFUs/ריאות (איור 6). בקצרה, להכפיל מספרים CFU ששוחזרו על ידי הגורם דילול של הצלחת ולאחר מכן גם באמצעות אמצעי האחסון הכולל שבו עיבדה את האיבר. החישובים CFU ואז הופך יומן10 ערכים עבור כל בעל חיים, בגרף.
    1. צלחות עם 30-300 מושבות נספרים בקלות ובדייקנות. צלחות עם מושבות פחות מ 6 אין להשתמש לחישובי מאז כאלה מספרים נמוכים המושבה להציג שגיאה15. כדי להשיג מגבלה נמוכה יותר של זיהוי, לנפח הכללי שבו איבר היה הומוגני מחולקת על ידי אמצעי האחסון בשימוש ספוט לצלחת מתוך homogenate מדולל (למשל., הנפח הכולל 2 מ"ל מחולק 0.1 מ"ל של homogenate מדולל שווה את הגבול התחתון של 20 CFUs לזיהוי).

7. עיבוד של מחיצת האף, קנה הנשימה

  1. Homogenize הרקמה ב mL 0.3% 1 PBS/קזאין עם גלולה שהעקב לטקס מנוע אלחוטיים. Homogenize הרקמה של 0.5-1 דקות עד הרקמה בעיקר חלופה מועדפת. חיידקים צריך להישפך לתוך ההשעיה.
  2. הכינו 10 שבחרת x דילולים על ידי דילול טורי של 0.1 מ"ל של ההשעיה homogenized צינורות דילולים המכילות 0.9 מ של PBS סטרילי. נקודה 0.1 מ"ל של כל דילול על גבי מראש הנקרא BG 10% + Sm צלחות ולהפיץ את המתלים. באמצעות מפזר משולש זה יש עברו עיקור כפוי על ידי 70% אתנול שטיפת להבה.
  3. תקופת דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס באוויר החדר של 4 ימים.
  4. לספור ולחשב CFUs/איברים כמו שלב 6.5 (איור 6). כדי להשיג מגבלה נמוכה יותר של זיהוי, לנפח הכללי שבו איבר היה הומוגני מחולקת על ידי האחסון המשמש כדי נקודה על צלחת מ homogenate מדולל (למשל., הנפח הכולל 0.3 mL מחולק 0.1 מ"ל של שווים מדולל את הגבול התחתון של 3 CFUs לנו כאן? צרות).

8. עיבוד של דם

  1. Centrifuge הצינורות המכילים דם מבודדים ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב- 4 ° C עד הצניפה כדוריות דם אדומות.
  2. בזהירות תוריד את הנסיוב supernatant ואת pipet לתוך צינור microcentrifuge סרום מראש עם תוויות. לאחסן הצינורות ב-20 ° C עד מוכן במורד הזרם ניתוח נוסף (כלומר., אליסה Ig מוחלטת ובלתי ספציפית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המודל המתואר מציג שיטה כדי להעריך את יעילות החיסון, תגובות מערכת החיסון במהלך אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. איור 1 מציג לוח הזמנים חיסון נציג נהגה להתחסן ולא להדביק עכברים ולקצור רקמות לצורך ניתוח. איור 2 מדגים את ההתקנה של מערכת הרדמה המועסקים לזירוז עכברים, הפעלת חוקרים כדי לספק החיסונים, חיידקי inoculums. איור 3 מראה דוגמה OD600 מדידות וחישובים להשגת השעיה חיידקי 1 OD להכין 100-fold inocul...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול מקיף המתוארים כאן ללמוד חסינות הנוצרות על-ידי חיסון שעלת דרב זיהום יאפשר גם הערכה של תגובות מארח מגוון רחב של פתוגנים אחרים. הפרוטוקול דן שיטות כדי לספק החיסונים, לקבוע את יעילות החיסון הבא הפתוגן. אתגר ולאחר ניתוח מקביל של תפקוד מערכת החיסון. בהתאמת הפרוטוקול ללימוד פתוגנים אחרים, מספר פרמטרים צריכים להיות שונה. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, למצב של הרדמה בעלי חיים, הרכב החיסון, מינון התוואי של המינהל. בנוסף, המינון ואת המסלול של הממשל של המחלה המוגבל של עניין, רקמות שנבחר לקציר, והערכה במורד הזרם של תג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות 1R01AI125560-01, סטארט-אפ של אוניברסיטת אוהיו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תא אינדוקציה 2LVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017כל מותג מתאים
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
קזאיןסיגמאC-7078
חומצות קסמינוVWRJ851-500Gמסננת Scholte (SS) רכיבי מדיה
חומצה L-גלוטמיתמוצרי מחקר IntG36020-500
L-Prolineמוצרי מחקר IntP50200-500
נתרן כלוריפישרBP358-10
אשלגן פוספט מונו-בסיסיפישרBP362-1
אשלגן כלוריפישרP217-500
מגנזיום כלוריד הקסהידרטפישרM2670-500G
סידן כלורידפישרC75-500
טריס בסיספישרBP153-1
L-ציסטאין הידרוכלורידפישרBP376-100SS חומרי אספקה
סולפט הפטהידראטסיגמאF-7002
ניאציןמוצרי מחקר IntN20080-100
גלוטתיוןמוצרי מחקר IntG22010-25
חומצה אסקורביתIntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  כל מקור אמריקאי,
גנטמיציןThermoFisher Scientific15710064
B-מרקפטואתנולפישר BP176-100
מטחנת רקמות 15 מ"לWheaton357544כל מותג דומה מתאים
הומוגנייזר ידני אלחוטיKontes/Sigma Z359971-1EAכל מותג דומה מתאים
מכשירים - מספריים, מספריים עקומה, מלקחיים, מלקחיים עדינים, מפזריכל מותג מתאים
מזרקי 3 מ"לBD bioscience309657
צינורות חרוטיים 15 מ"לפישר 
339651 צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"לדנווילC2170
70um מסנני תאיםפישר 
22363548 צלחות 60 מ"מThermoFisher Scientific130181
צלחות תרבית רקמות 48 בארותThermoFisher Scientific08-772-1C
1 מ"ל מזרק אינסולין 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
עכבר IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! ערכהInvitrogen / eBioscience50-173-21
עכבר IL-17 ELISA Ready-SET-Go! ערכהInvitrogen / eBioscience50-173-77
עכבר IL-5 ELISA Ready-SET-Go! ערכתInvitrogen / eBioscience50-172-09
ברזל מוצרי מחקר מומת ללא חום משולשים

מקורות

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תגובת מאפיל-פתוגןחיסון עכבריםe接接 inoculation בקטריאליקצירת רקמותספירת CFUפלואו ציטומטריהאנליזת ELISpotBordetella Pertussisקיטוב Th1 Th17
הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.