המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת תא (HSPC) hematopoietic של גזע, קדמון היה טיפול אבן הפינה של לוקמיה, סרטן אחרים במשך כמעט חצי מאה, ביסוד התרופה היחידה הידועה של זיהום וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), ואני מראה הבטחה עצומה הטיפול במחלות גנטיות כגון בטא תלסמיה. הקבוצה שלנו פיתחה פרוטוקול טיפול גנטי HSPC דגם במוסר פרימטים (NHPs), מאפשרת למדענים למטב את רבים של ריאגנטים אותו טכניקות מוחלים במרפאה. כאן, אנו מתארים שיטות לטיהור CD34+ HSPCs, לטווח ארוך שמירת תאי גזע hematopoietic (HSC) קבוצות משנה של מח העצם כאשר הבחינה (מוניטור). טכניקות זהה יכול להיות מועסק ולטיהור מקורות HSPC אחרים (למשל, גויסו דם היקפיים בתאי גזע [PBSCs]). בקווים כלליים הוא פרוטוקול 2 יום שבו תאים מטוהרים, תרבותי, שונה עם lentivirus (LV), הכין אינפוזיה בחזרה לתוך המארח עצמיים. המפרט מפתח להצלחה כוללים את טוהר CD34+ HSPC האוכלוסייה, היכולת של HSPCs מטוהרים להקים מושבות נפרדות מורפולוגית מדיה חצי קשות, ויעילות, והכי חשוב, ג'ין השינוי. היתרון המפתח כדי ריפוי גנטי HSPC היא היכולת לספק מקור של תאים חיים ארוכים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. ככזה, שיטות אלה שימשו מודל טיפולים עבור סרטן, מחלות גנטיות מחלות זיהומיות. בכל מקרה, היעילות הטיפולית היא הוקמה על ידי שיפור הפונקציה צאצאי HSPC ברורים, לרבות תאי דם אדומים, תאי T, תאים B, ו/או מיאלואידית קבוצות משנה. השיטות לבודד אותו, לשנות, להכין HSPC המוצרים הם ישירות הרלוונטיים לתרגום מרובים למחלות בחולים אנושיים.
מבוא
ריפוי גנטי בתאי גזע הוא אמצעי רב עוצמה כדי לטפל מגוון רחב של פתולוגיות אנושי. ריפוי גנטי HSPC היא גישה אטרקטיביים במיוחד, בשל i) בקלות יחסית של איסוף תאים אלה מחולים, ii) שפע של ידע זה אינו זמין לגבי פנוטיפים פני שטח התא, ex-vivo תרבות פרמטרים,, כשדה מתרחב, כי השלישי) הוא מציג מדענים עם ארגז הכלים ההולכת וגדלה של אסטרטגיות שינוי גנטי המותאמים במחלות שונות של עניין. אנו לחקור באופן פעיל HSPC ג'ין גישות טיפול מזוויות מרובות, כולל המדע הבסיסיים של ביולוגיה HSPC, את engraftment של ג'ין-השתנה HSPCs במודלים פרה ויוו, היישום לאוכלוסיות החולה הרלוונטיים. אנחנו ואחרים שאפיינו את תא השטח גן # מושגים בסיסיים של נפרדים פונקציונלית HSPC קבוצות משנה1,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עצמיים NHP השתלות, הטרמה (גיוס), האוסף של תאים, שינוי ג'ין מתנהלים בקנה אחד עם פרוטוקולים שפורסמו בעבר26. בכל ההליכים ניסיוני נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה את פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן, באוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול #3235 - 01). כל מחקרים מבוצעים בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ("מדריך"); חיות חולקו באופן אקראי למחקרים.
1. העשרת CD34+ HSPCs ותרבות לילה (יום-1)
- הקציר מוניטור, במצב זה.
- לגייס את NHPs עם גורם מגרה המושבה גרנולוציט (GCSF) ארבעה ימים כפי שתואר לעיל26
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר לעיל נועד לבודד ולשנות ג'ין-NHP CD34+ HSPCs, אשר לאחר מכן להיות חדורים בחזרה לתוך המחשב המארח עצמיים (איור 1 ואיור 2). כאשר בעקבות פרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להשיג עד 8 x 109 WBCs הכולל של מוניטור להתקפת מ שהצטיירה קופי מקוק, לפעמים, תכפיל את הסכום של קופי מקוק רזוס. בשני המינים, מספר CD34+ HSPCs אנחנו המעשירים הוא יחסי הקלט של הספירה הכוללת WBC (איור 3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
LV וקטור הנדסה היא השיטה הכי מאופיין ג'ין-לשנות סוגי תאים כגון CD34+ HSPCs, כבר אין ויוו עוקבות. הפרוטוקול המתואר כאן מיועד על מנת למקסם את מספר גנים-לאחרונה HSPCs זה נמשכות לטווח ארוך ויוו, לספק יתרונות קליניים בחולים עם מחלות ממאירות, זיהומיות, גנטי שונות. למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין הופיעו בעשור האחרון, LV-השתנה תאים הם הטובים ביותר למד במבחנה, במודלים של בעלי חיים, מטופלים1,8,20,21
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים הלן קרופורד על הכנת את כתב היד, ג'ים Woolace לעיצוב גרפי, ואת ורוניקה נלסון Devikha Chandrasekaran עבור השתתפות בפיתוח של הפרוטוקול. הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים של NIH המכון הלאומי לאלרגיה, מחלות זיהומיות (R01 AI135953 ו- AI138329 כדי H.P.K.) הלאומי ללב, ריאות, ואת מכון דם (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ו U19 HL129902 אל H.P.K.), כמו גם NIH P51 OD010425, בחלקו דרך מרכז הסרטן NIH/NCI, תמיכה גרנט P30 CA015704. H.P.K. הוא חוקר רפואה מולקולרית מרקי קיבל תמיכה כנמען ההשבעה של חוסה קאררס/דגלס Donnall תומאס ניחן הכיסא לחקר הסרטן, הכיסא ניחן פרד. האץ ' תא, ריפוי גנטי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Stemspam SFEM II ("HSPC") מדיה | StemCell | 09655 | |
| תמיסת מלח מאוזנת של האנק | Gibco | 14175095 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט | Gibco | 14190-144 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא אולדריץ' | D2650-100 | |
| 100% אתנול | דקון מעבדות | M18027161M | |
| ציקלוספורין | סיגמא | 30024-25 מ"ג | |
| 500 מ"מ EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| סרום בקר עוברי מומת בחום | סיגמא אולדריץ' | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 מ"ל, 1 ומיקרו; g/µ L) | TaKaRA | T100B | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא | A7906-100 גרם | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| עכברוש נגד עכבר חרוזים מגנטיים | IgM Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| גורם תאי גזע אנושי רקומביננטי (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| תרומבופויטין אנושי רקומביננטי (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| רקומביננטי אנושי דמוי FMS טירוזין קינאז 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| פרוטמין סולפט | סיגמא | P-4505 | |
| 14 מ"ל פוליפרופילן צינור עגול תחתון | |||
| ג'ל מושבה 1402 | ReachBio | 1402 | |
| מפרידי QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 עמודות | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 מ"מ PGE2 | קיימן כימי | 14753-5 מ"ג | |
| צלוחיות T-75 שטופלו TC | Bioexpress | T-3001-2 | |
| צלוחיות T-75 שאינן מטופלות | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 מ"ל מזרקים | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 גרם מחטים | BD מכסה | 305198 | |
| BD Biosciences | 305819 | ||
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| מכסה רצועה 8 צינורות PCR | ארה"ב מדעי | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | ||
| מסנני הפרדה מראש | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| מסננת, תא; בי.די פלקון; עקר; רשת ניילון; גודל רשת: 70um; צבע: לבן; 50/CS | Fisher Scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 מ"ל Luer-Lock מזרקים | תרמו-פישר | 14823435 | |
| 35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבית תאים | קורנינג | 430165 | |
| 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת תרבית תאים | קורנינג | ||
| 430196 צלחת תרבית תאים בגודל 150 מ"מ x 25 מ"מ | קורנינג | ||
| שאינן מטופלות TC פלקון | 353133 | ||
| מיצוי DNA Qiagen | Qiagen | 51104 | |
| PE אנטי אנושי CD90 (Thy1) שיבוט: 5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 עכבר אנטי אנושי CD34 שיבוט: 563 | BD אופק | 562449 | |
| שיבוט עכבר APC-H7 אנטי אנושי CD45RA: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 עכבר אנטי-NHP CD45 שיבוט: d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| סרום אוטולוגי | נאסף ממארח אוטולוגי ונשמר בהקפאה לפני גיוס ואיסוף של CD34+ HSPCs | N/A | בירד, ב. ס. ואחרים. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| מדיה מותנית וירוסים (VCM) | מעבדת קיים, המרכז הקואופרטיבי FHCRC למצוינות בהמטולוגיה (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| נוגדן נגד CD34, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| פריימר Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | טכנולוגיות DNA משולבות | N/A | Peterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| פריימר Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | טכנולוגיות DNA משולבות | N/A | Peterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| פריימר Actin F: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | טכנולוגיות DNA משולבות | N/A | Peterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| פריימר Actin R: GAAGCATTTGCGGTGGACCGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 וברירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016). |
מקורות
- Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
