מאמר שיטה

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

DOI:

10.3791/58933

⸱

15 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת תא (HSPC) hematopoietic של גזע, קדמון היה טיפול אבן הפינה של לוקמיה, סרטן אחרים במשך כמעט חצי מאה, ביסוד התרופה היחידה הידועה של זיהום וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), ואני מראה הבטחה עצומה הטיפול במחלות גנטיות כגון בטא תלסמיה. הקבוצה שלנו פיתחה פרוטוקול טיפול גנטי HSPC דגם במוסר פרימטים (NHPs), מאפשרת למדענים למטב את רבים של ריאגנטים אותו טכניקות מוחלים במרפאה. כאן, אנו מתארים שיטות לטיהור CD34+ HSPCs, לטווח ארוך שמירת תאי גזע hematopoietic (HSC) קבוצות משנה של מח העצם כאשר הבחינה (מוניטור). טכניקות זהה יכול להיות מועסק ולטיהור מקורות HSPC אחרים (למשל, גויסו דם היקפיים בתאי גזע [PBSCs]). בקווים כלליים הוא פרוטוקול 2 יום שבו תאים מטוהרים, תרבותי, שונה עם lentivirus (LV), הכין אינפוזיה בחזרה לתוך המארח עצמיים. המפרט מפתח להצלחה כוללים את טוהר CD34+ HSPC האוכלוסייה, היכולת של HSPCs מטוהרים להקים מושבות נפרדות מורפולוגית מדיה חצי קשות, ויעילות, והכי חשוב, ג'ין השינוי. היתרון המפתח כדי ריפוי גנטי HSPC היא היכולת לספק מקור של תאים חיים ארוכים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. ככזה, שיטות אלה שימשו מודל טיפולים עבור סרטן, מחלות גנטיות מחלות זיהומיות. בכל מקרה, היעילות הטיפולית היא הוקמה על ידי שיפור הפונקציה צאצאי HSPC ברורים, לרבות תאי דם אדומים, תאי T, תאים B, ו/או מיאלואידית קבוצות משנה. השיטות לבודד אותו, לשנות, להכין HSPC המוצרים הם ישירות הרלוונטיים לתרגום מרובים למחלות בחולים אנושיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריפוי גנטי בתאי גזע הוא אמצעי רב עוצמה כדי לטפל מגוון רחב של פתולוגיות אנושי. ריפוי גנטי HSPC היא גישה אטרקטיביים במיוחד, בשל i) בקלות יחסית של איסוף תאים אלה מחולים, ii) שפע של ידע זה אינו זמין לגבי פנוטיפים פני שטח התא, ex-vivo תרבות פרמטרים,, כשדה מתרחב, כי השלישי) הוא מציג מדענים עם ארגז הכלים ההולכת וגדלה של אסטרטגיות שינוי גנטי המותאמים במחלות שונות של עניין. אנו לחקור באופן פעיל HSPC ג'ין גישות טיפול מזוויות מרובות, כולל המדע הבסיסיים של ביולוגיה HSPC, את engraftment של ג'ין-השתנה HSPCs במודלים פרה ויוו, היישום לאוכלוסיות החולה הרלוונטיים. אנחנו ואחרים שאפיינו את תא השטח גן # מושגים בסיסיים של נפרדים פונקציונלית HSPC קבוצות משנה1,2,3, גיוס משטרי מיזוג למקסם את התשואה HSPC engraftment תוך מזעור רעילות4,5והגן השינוי ואסטרטגיות לעריכת ג'ין יש כבר למידותיו של מגוון רחב של ממאירות, גנטית, מחלות זיהומיות6,7,8, 9,10. ניתן להעריך את תפקוד ואת engraftment של HSPCs ג'ין-לאחרונה במספר דגמים קטנים, גדולים-מוצרים מהחי, כולל עכברים, כלבים ו NHPs. בפרט, מודלים NHP הם יתרון כי נוגדנים רבים, למשל, נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים פני שטח התא HSPC כמו CD34 ו- CD90, ניתן להשתמש בקבצים של האדם ותאים NHP. יתר על כן, בניגוד עכברים, חיים גדולים, כגון NHPs מאפשרים הערכה קרובה יותר של הסקאלה של התאמת גנים הדרושים עבור יעילות קלינית. לבסוף, NHPs תקן זהב עבור עיצוב אנושי פתולוגיות כגון זיהום ב- HIV-111 והם מערכת מודל המתעוררים המועמד נגד סרטן, אנטי-איידס immunotherapies12,13.

המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר שיטות טיהור, גנטית שינוי והכנת המוצרים אינפוזיה NHP HSPC. למרות שמחוץ להיקף של פרוטוקול זה, אנחנו בעבר הראו כי מוצרים אלה engraft ב hosts NHP עצמיים, להצמיח כל שושלות hematopoietic, מספקים יעילות טיפולית במגוון רחב של דגמים המחלה1. יש גם שאפיינה את clonality של engrafting HSPCs ואנו נבנה פלטפורמה כדי לעקוב אחר קינטיקה, סחר, של פנוטיפ של HSPCs בודדים, הצאצאים שלהם, עצמיים השתלת הבאות1,14. השיטות המובאות כאן פותחו עם היעדים הבאים: i) כדי לבודד HSPCs מאוד טהור ו לטווח ארוך engrafting HSC קבוצות משנה, ii) כדי לשמור על HSCs פרימיטיביים במהלך ex-vivo תרבות, ו- iii) לשינוי ביעילות ג'ין-גם בתפזורת HSPCs או לטווח ארוך קבוצות משנה של מועדון הכדורגל מונפלייה engrafting. אנו מעסיקים מגנטי בסיוע-מיון תא (מקינטוש), וכן תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), לבודד phenotypically/פונקציונלית ברורים HSPC אוכלוסיות, בקנה אחד עם שיטות רבות קבוצות2,15, 16. קיום פרימיטיבי HSCs בתרבות (קרי, למזער את הבידול של תאים אלה לתוך אבות מחויבת לתת עלייה במלואה הבדיל קבוצות משנה הלימפה ואת מיאלואידית) היא היבט חיוני של הפרוטוקול המתואר כאן. למרות שאנחנו בעבר אפיינו גישות כדי להרחיב את HSPCs תוך שמירה על פנוטיפ פרימיטיביים17,18, כאן, אנו מתארים פרוטוקול זה מתמקד שמירה על HSCs ויה מינימלי (h 48) ומוגדר ex-vivo תרבות.

השינוי יעיל של HSPCs ומועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה היא המטרה המרכזית של פרוטוקול זה. בין מספר גישות דיווחנו, שניכם עד כה הניסויים הקליניים ובדוקים ביותר ב: שינוי ג'ין בתיווך LV, בתיווך נוקלאז גן לעריכת6,1,19. אסטרטגיות לעריכת גן אחד של מספר פלטפורמות נוקלאז לשינוי במיוחד גן יישוב עניין, לדוגמה, C-C כימוקין קולטן הקלד 5 (CCR5) לטיפול ב- HIV זיהום7,19 או Bcl11A לטיפול פתולוגיות של המוגלובין6. כאן, אנו מתמקדים שינוי ג'ין בתיווך LV, שבו מטענים הטרנסגניים להשתלב semirandomly8,1,20הגנום. יתרון מפתח של LV גישות היא היכולת לספק כמויות גדולות של חומר גנטי (עד 8 או 9 kilobases). למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין מפותחים למטרה transgene עניין לשלב רק בשעה לוקוס שצוין על-ידי רקומבינציה הומולוגית התורם (HDR), שיטות אלה דורשים יותר לפיתוח במבחנה, במודלים של בעלי חיים קטנים. לעומת זאת, LV וקטורים נעשה שימוש נרחב ב- NHPs וב -חולים21,22. חשוב, הפרוטוקול המתואר כאן, שמשתמשת בשלה מוניטור כמקור HSPC ההתחלתי, ניתן בקלות, בהרחבה להתאים, למשל, לבודד PBSCs. כמתואר לעיל, עלינו לנצל של רמה גבוהה של דמיון גנטי בין NHPs לבין בני האדם להשתמש ריאגנטים הרלוונטיים בשני המינים. לבסוף, הותאם בגישה זו כדי לשנות קבוצות משנה hematopoietic אחרים, כלומר T תאים12,23,24; כניסתו של גישות חיסוני יעיל של T-cell הסתמכה בכבדות על פלטפורמה זהה LV מנוצל פרוטוקול זה. שיטות אלה מתאימים עבור כל חוקר מעוניין HSPC ביולוגיה או שינוי בתיווך LV ג'ין. לדוגמה, פרוטוקול טיהור HSPC המובאת כאן יכול לשמש כדי לאפיין את הרומן מועשר-מועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה, כפי שתואר לעיל15,1,25. באופן דומה, התמרה חושית LV השיטות המובאות כאן יכול באופן דומה להיות מיושם, פיתוח נוסף עבור רבים סוגי תאים אחרים, שאלות ניסיוני, שניהם במודלים במבחנה ו ויוו.

לסיכום, אנו מציגים שיטות כדי לבודד ולשנות גנטית NHP HSPCs. שיטות אלה ניתן להתאים בקלות עבור מינים אחרים ומקורות אחרים של HSPCs. פרוטוקול זה ביסודיות vetted מציגה הבטחה גדולה הדגמים של טיפולים אפקטיבי עבור מחלות אנושיות רבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצמיים NHP השתלות, הטרמה (גיוס), האוסף של תאים, שינוי ג'ין מתנהלים בקנה אחד עם פרוטוקולים שפורסמו בעבר26. בכל ההליכים ניסיוני נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה את פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן, באוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול #3235 - 01). כל מחקרים מבוצעים בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ("מדריך"); חיות חולקו באופן אקראי למחקרים.

1. העשרת CD34+ HSPCs ותרבות לילה (יום-1)

  1. הקציר מוניטור, במצב זה.
    1. לגייס את NHPs עם גורם מגרה המושבה גרנולוציט (GCSF) ארבעה ימים כפי שתואר לעיל26.
    2. לסמם את החיות עם 100 מ"ג/ק"ג של קטמין, 0.03 נקודות mL/kg של dexmedetomidine (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל). לנהל משככי כאבים (למשל, SR. הבופרנורפין) בזמנו של ההגרלה.
    3. בעזרת קוצץ, לגלח את השיער של בעל החיים מהקצה הפרוקסימלית של עצם הזרוע ו/או עצם הירך bone(s), לשפשף את העור עם פילינג המבוסס על יוד או פתרון חיטוי דומה, לסירוגין עם אלכוהול, וחזור על 3 x. כחומר הרדמה נוספים, להחדיר קרום העצם נמשך (2 מ ג לכל אתר, מניות 5 מ"ג/מ"ל).
    4. מקמו את המחט השאיפה של מח העצם (16 גרם) האתר ערך חידוש (מדולרי חלל), לחדור את העור, חודר את חלל מדולרי באמצעות תנועה מסתובב. הסר את stylet של המחט השאיפה, להזמין אותו בתוך שדה סטרילי לשימוש נוסף.
      הערה: לבחור חידוש כניסה לאתר חלל מדולרי באזור עצם זה אינו מכוסה על ידי השרירים ואיפה הנוף/הצורה של העצם או גלוי או יכול להיות מורגש בקלות דרך העור (בדרך כלל לקראת סיום צינתור או דיסטלי של העצם).
    5. כדי שהמחט מוניטור, צרף שמולאו מראש המזרק המכיל תערובת של פתרון דקסטרוז ציטראט קרישה (ACD-A) והפרין (20 USP/mL, mL 1 לכל 9 מ של מח להיות שנאספו).
    6. לצייר על הבוכנה בחזרה תוך בעדינות נדנדה האיבר וסיבובו, כדי להתסיס את המזרק לערבב וביופסיה, נוגד קרישה. לסובב את המחט ולמקם אותו ברחבי השאיפה נסיגה לגשת אחוז גדול יותר של תאים בתוך מח.
    7. ברגע המדגם נאסף, הסר את המחט והפעילו לחץ לאתר השאיפה עד התחנות דימום.
      הערה: בהתאם לנפח הדרוש, ניתן למשוך מח עצם מאחת עד ארבע הגפיים (שני humeri, שני עצמות הירך) במהלך אוסף יחיד. לא יותר מ 20 מ ל צריכים להיאסף אבר כל, ומהווים הנפח הכולל שנאסף צריך לא יותר מ- 10% ממשקל של החיה (10 מ"ל/ק"ג).
    8. אם קבלת aspirates של הגפיים מרובים, לשלב והקלטה של אמצעי האחסון.
    9. תן postanesthesia לשחזר את NHP.
      1. להפוך את ההשפעות של dexmedetomidine עם atipamezole 0.03 נקודות מ"ל/ק"ג (5 מ"ג/מ"ל מניות) לאחר ההליך. לספק משככי כאבים (למשל, SR. הבופרנורפין) כפי שנקבע על ידי צוות וטרינרי קליניים לפחות 48 שעות לאחר הניתוח או ארוך יותר, שיקול דעתו של וטרינר קליני, בהתבסס על סימנים קליניים.
      2. להחזיר את החיה בכלוב הביתה לאחר ההליך, לפקח עליו כל 15-20 דקות, עד החיה הוא מסוגל לשבת משלו. לפקח על החיה מדי יום על ידי צוות וטרינר עד נקבע כי האתר השאיפה נרפא. בנוסף, לפקח על סימנים של דלקת, זיהום או כאבים.
    10. במקביל התא עיבוד, להתנות את NHP אותו עם myeloablative גופית (TBI): 1,020 cGy בשיעור של 7 cGy לדקה מנהל הקרנה במינון fractionated במהלך הימים 2 לפני תא אינפוזיה.
  2. Hemolyze את מוניטור.
    1. לחלק ויטביע את צינורות חרוט 50 מ ל (10-12 mL למחזור) ולהוסיף מאגר היילוד כדי להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל (טבלה 1). דגירה התאים בטמפרטורת החדר (RT) עד הם lysed אך לא יותר מ במשך 7 דקות צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע של pellet(s), עוזב 2-5 מ של אמצעי אחסון/צינור. Resuspend בגדר באמצעי האחסון שיורית.
      הערה: דוגמאות lysed בהצלחה לשנות צבע, אדום כהה כדי אדום בהיר שקוף.
    2. להוסיף 10-15 מ של היילוד מאגר/גלולה. הסר כל קרישי דם באמצעות 70 strainers תא מיקרומטר. להוסיף היילוד מאגר עד 50 מ ל, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT ו ספין-800 x גרם במשך 5 דקות.
    3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend התאים 10 מ"ל MACS מאגר (טבלה 1). לסנן שוב דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. יש לשטוף את שפופרת ואת מסנן זה עם 40 מ"ל של מקינטוש מאגר עד 50 מ.
  3. להעשיר את CD34+ תאים מחלון hemolyzed כדוריות הדם הלבנות (WBCs) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    1. לסובב התאים ב 800 x גרם במשך 15 דקות הסימון הצינורות כדי לוודא כי אין מערבולות תא ניכרות באמצע/העליון. אם התאים נמצאים מעל בגדר, ספין שוב במהירות גבוהה יותר (עד 1,000 x g המרבי), עבור עד 10 דקות.
    2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend זה ב 10 מ"ל או פחות מאגר MACS, וציין את עוצמת הקול המדויק. לספור התאים לדילול בטחונות או 1:1,000 באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
      הערה: זו ספירת הכולל הוא המונה העשרה מראש.
    3. להוסיף מאגר MACS להביא את הריכוז תא עונה 1 פרק 108 תאים/מ ל.... במידת הצורך, תחילה חזור על שלבים 1.3.1 - 1.3.2 (למשל, עקב מספר קדם העשרה נמוך). שומרים 5 x 106 תאים במקינטוש המאגר עבור ערכה HSC מכתים (דוגמה העשרה מראש).
    4. מוסיפים נוגדן (שיבוט 12.8, טבלה של חומרים) נגד unconjugated-CD3427 לתאים טרום העשרה הנותרים כדי ריכוז סופי של 40 µg/mL (1 x 108 תאים/mL). דגירה התליה תא ב 4 ° C ב rotator הרכבת התחתית (ראה את הטבלה של חומרים) למשך 25-30 דקות.
    5. מאגר מקינטוש לשימוש כדי להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל, לסובב את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דק. תשאף את תגובת שיקוע, resuspend התאים 50 מ של מאגר MACS, ומסתובב שוב ב x 800 גרם במשך 5 דקות.
    6. דגה 100 מ של מאגר מקינטוש עם שני לסנן צינורות, עוטף את כניסת אוויר עם נייר שעווה, למשך 25-30 דקות או עד מוכן לשימוש.
    7. חישוב הנפח של beads מגנטי: 1 מ"ל של חרוזים/109 תאים. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend לתאים 108 תאים למ"ל, לאחר הוספת החרוזים. לדוגמה: 3 x 109 תאים + 3 מ"ל של חרוזים + 27 מ"ל של מקינטוש מאגר 30 מ של הנפח הכולל.
    8. דגירה התליה תא ב 4 ° C-מסובב צינור 25-30 דקות.
    9. במהלך רכישת מגנטים עבור העמודות; מתכנן להשתמש 0.6 x 109 תאים בכל עמודה. מניחים את העמודות על המגנט והצב צינור חרוטי 50 מ ל מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה. הכן צינור חרוטי 15 מ"ל, הבוכנה עבור כל עמודה עבור • תנאי (שלב
    10. עם השלמת הדגירה בשלב 1.3.8, להוסיף למאגר MACS 50 מ ל ספין-x 800 גרם עבור 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע, resuspend את התאים במקינטוש degassed מאגר (2 מ"ל לכל עמודה). פיפטה בעדינות כדי להימנע מהחדרה בועות.
    11. מבלי לאפשר את העמודה להתייבש, להוסיף 1 מ"ל degassed MACS מאגר כל עמודה, ואחריו 2 מ"ל של התא השעיה. לשטוף את המסנן ואת הצינור המקורי עם מאגר מקינטוש degassed ולחלק את הפתרון באופן שווה בין עמודות (6 מ ל/עמודה); לאחר מכן, להוסיף 7 מ של מאגר מקינטוש degassed בשביל הכביסה הסופי.
    12. בעדינות למשוך את העמודה הרחק המגנט (דחיפה מאחור העליון) ולאסוף את הטפטפת האחרונה לתוך הצינור זרימה דרך. הוסף 5 מ של מאגר מקינטוש degassed כל עמודה ולהחיל על הבוכנה כדי elute את התאים לתוך הצינור חרוט סטרילי מהשלב 1.3.9. לא לאסוף את כל נוזל לאחר שהבועות מופיעות.
  4. לספור את התאים את מועשר והן זרימה דרך (FT) אוסף הצינורות ביחס דילול של 1:10. שמור את התאים על קרח. Aliquot עונה 1 פרק 106 תאים מן השבר מועשרת CD34 ו 5 x 106 תאים מן השברים מטרים לניתוח על ידי cytometry זרימה. אחסן את השבר מטרים ב 4 ° C עד בקרת האיכות (שלב 2) הסתיימה.
    הערה: מספר CD34+ תאים הדרוש מוצלח engraftment multilineage ב NHP תלויה תדירות CD34 מועשרת HSC+CD90+CD45RA– משנה. מבוסס על תדירות ממוצעת של 3% - 5%, את הדרישה המינימלית של 122,000 CD34+CD90+CD45RA– תאים לכל קילוגרם של הגוף משקל1, זה מומלץ להמשיך עם סכום כולל של פחות 2.5 x 106 עד 10 x 10 6 CD34+ תאים לכל קילוגרם של משקל גוף.
  5. להוסיף מקינטוש מאגר כדי CD34+ מועשר שבר 50 מל ' סך הכל, ספין-x 800 גרם עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ועל resuspend לתאים 106 תאים למ"ל בתקשורת HSPC (טבלה 1).
    1. צלחת התאים-צפיפות של 106 תאים למ"ל בתרבות רקמה פרקו, (TC)-מבחנות T-75, 10-20 מ לכל מבחנה ובא דגירה אותם בן לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. שאר המבחנות לאורכו (לא בעמידה).
      הערה: אם רצונך בכך, CD34 נוספים+ תאים או CD34– מטרים יכולים להיות cryopreserved 90% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) + 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-ריכוז של עונה 1 פרק 106 5 x 106 תאים/מ ל..., ולאחר מכן להאט מקורר- 80 ° C (למשל, באמצעות מכולות ההקפאה). התשואה ההחלמה הממוצע של תאים cryopreserved תלויה CD34+ טוהר, בדרך כלל נע בין 50% עד 80% עם הכדאיות של > 80%.

2. בקרת איכות תאי CD34 מועשרת (יום-1)

  1. להכין דגימות cytometry זרימה.
    1. Resuspend דגימות שאומנם כל שלב בידוד שהוזכרו לעיל (העשרה קדם מטרים, שברים מועשרת CD34) במאגר FACS-ריכוז של 10 x 106 תאים למ"ל ולהעביר µL 100 לכל תא השעיה (טבלה 1) צינור FACS.
      הערה: דגימות הבקרה צריכה לכלול תאים וללא רבב בכל שלב בידוד (למשל, 5 x 105 תאים) עבור ההתאמה של פיזור קדמי (FSC), לצד פיזור (האס) ו autofluorescence בכל אחד מהערוצים זריחה. בנוסף, חרוזים פיצוי שהוכתמו יחיד עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדת יידרשו כדי לכוונן הפיצוי בין ערוצי סמוכים (טבלה 2 , טבלה 3).
    2. הוספת נוגדנים הרצוי (למשל, anti-CD45, אנטי-CD34, anti-CD45RA, אנטי-CD90), על פי הוראות היצרן, עבור מבחן אחד (1 x 10 תאים6 100 µL) (טבלה 3). תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C. להוסיף 3 מ"ל של מאגר FACS, ספין-800 x גרם עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר FACS, ולנתח על cytometer הזרימה המתאימה (שלב 2.2).
  2. להכין בסדרן תא cytometer זרימה לניתוח.
    הערה:     מומלץ לבצע הניתוח באותו מחשב שישמש עבור תא מיון בשלב 2.3.
    1. ליצור פרוטוקול כולל FSC/האס, CD45/CD34 ו CD45RA/CD90 (שלושה מגרשים זרימה). לחץ לחיצה ימנית על זרימה חלקה ומוסיפים את פריסת הירארכיה האוכלוסייה .
    2. לחיצה שמאלית על העלילה FSC/האס, בחר בתכונה שער מצולע, וצייר שער להוציא פסולת ותאים מתים. להאיר את השער החדש, שנה את פיזור בחלון המפקח.
      הערה: זה נקרא באופן אוטומטי כמו P1.
    3. לחץ לחיצה ימנית במרכז העלילה זרימת CD45/CD34, נווט כדי להראות אוכלוסיותולאחר שער העלילה על פיזור. צייר שער מלבני סביב CD45intCD34+ תאים תאים שאינם-CD34 תכלול ותאים nonhematopoietic, טוב כמו שיורית טסיות, אריתרוציטים (CD45–). לשנות את השער CD34+.
    4. שער העלילה זרימת CD45RA/CD90-CD34+ האוכלוסיה. לצייר שלוש עצמאית subgates סביב CD90+CD45RA תאים– (מועשר עבור HSCs), CD90–CD45RA תאים– (מועשר עבור multipotent ו- erythro-מיאלואידית אבות [MPPs/פעימה]), CD90–CD45RA + תאים (מועשר עבור lympho-מיאלואידית אבות [LMPs]). שנה את השערים כדי HSC MPP-EMP, LMP, בהתאמה.
    5. כשהפעולה תסתיים, להבטיח כי האוכלוסייה הירארכיה מכילה שש ערכי מאורגנים באופן היררכי לפי הסדר הבא: 1) כל האירועים; 2) פיזור; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. ודא כי החלקות זרימה, צורת השער נראים כמופיע באיור4.
    6. הפעל WBCs העשרה מראש וללא רבב כדי להתאים את המתח FSC, האס של קרינה פלואורסצנטית כל הערוצים (טבלה 2, דגימת 5). הפעל את הפיצוי שהוכתמו יחיד חרוזים להתאמת הפיצוי בין ערוצי סמוכים (טבלה 2, דגימות 1-4). לרוץ כל הנותרים מוכתם והמוכתמות דגימות עם מנוכי עונתיות פיצוי פרוטוקול, לתעד CD34 העשרה יעילות (דוגמאותבטבלה 2, 6-9).
      הערה: שמור את הדגימה הסופי (טבלה 2, לדוגמה 10) כדי להפוך את ניתוח תזרים סימולטני התא מיון בשלב 2.4.
  3. להגדיר את סדרן התא ולטיהור המיון-קבוצות משנה CD34 לתוך המושבה יוצרי מבחני תא (CFC).
    הערה:     אם מכונה אחרת שימש לניתוח (שלב 2.2), להגדיר את הפרוטוקול ב סדרן התא תיאר כאמור בשלבים 2.2.1 - 2.2.5.
    1. להתאים את הזווית/המתח עבור הזרמים מצד שמאל ימין בתוכנה סדרן התא להפקיד תאים לתוך צינורות 15 מ"ל המכיל CFC בינוני. לקבוע את הזווית של הנחל בצד כדי למנוע חוסר התאמה. Step-wise, לכוונן את הזווית של הנחל הסיט את הצד עד בתאים ממוינים להכות המדיום CFC ואת לא הצד של הצינור כי מעט מאוד תאים ממוינים.
    2. בדפדפן, פתח את התיקיה גליונות עבודה גלובלי, וליצור מיון-פריסה חדשה באמצעות הלחצן בתפריט העליון של חלון הדפדפן. לשנות את הערך בתפריט הנפתח אוסף התקן כדי 2 צינורות, הערך בתפריט הנפתח דיוק 4-way טוהר או תא בודד ולהגדיר את האירועים היעד תאים 800-1,200. לחיצה שמאלית על השדה מיין-מיקום (שמאלי או ימני), בחר את הערך להוסיף בתפריט ובחרו האוכלוסייה כדי למיין מתוך התפריט.
  4. למיין את התאים עבור מבחני CFC.
    הערה:     מיון עבור מבחני CFC מבוצעת רק עם תאים מן המוצר CD34 מועשרת (טבלה 2, לדוגמה 10).
    1. לטעון לדוגמה 10, רושמים אירועים 2,000-3,000 והתאם פיין-השערים מיון כדי להתאים חוזק האות לאוכלוסייה היעד.
    2. עם השלמת ההתקנה, רוכשים תאים (טבלה 2, לדוגמה 10). לרכוש נתונים כמתואר בשלב 2.2.3, להתאים את קצב הזרימה ל- 500-1, 000 תאים/s ו למיין 800-1,200 תאים מהשער i) פיזור ii) CD34+ שער, iii) בשער מועדון הכדורגל מונפלייה, iv) השער MPP-EMP, ושער v) LMP לתוך צינורות נפרד המכיל מ 3.6 ל CFC מדיה.
      הערה: מיון עבור מבחני CFC מבוצעת רק עם תאים מן המוצר CD34 מועשרת (טבלה 3, לדוגמה 10). תאים מן פיזור CD34+ יש למיין השערים בנפרד, ואילו HSCs MPP-פעימה, LMPs ניתן למיין בו זמנית למצב בעל שפופרת ימינה ושמאלה.
    3. מערבולת ונותנות 1 מ"ל של השעיה תא לכל אחד nontissue סטרילי, 3 x 3.5 ס מ, שטופלו תרבות צלחות פטרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-14 ימים במיכל המשני (למשל, 15 ס מ פטרי).
    4. ימים 10-11 postplating, לספור מושבות נפרדות של כל שלוש הצלחות לכל תנאי, בהתבסס על מורפולוגיה המושבה.

3. ג'ין שינוי של CD34+ HSPCs ושחזור לילה (יום 0)

  1. למהול 2.5 מ ל 1 פתרון CH-296 µg/µL µg/mL 50 ב 50 מ של תמיסת מלח מאוזנת של האנק, (HBSS, ראה את הטבלה של חומרים).
  2. היכונו מבחנות התמרה חושית LV.
    1. לקבוע את המספר המשוער של תרבות-nontissue (הלא-TC)-מטופלים מבחנות הדרושים (בדרך כלל מן הסעיפים תא שנקבע בשלב 1.4). מתכנן צלחת תאים7 עונה 1 פרק 10 מ"ל של מדיה לכל T-75 את הבקבוק (1 x 108 תאים הכולל ידרוש 10 מבחנות) כוללים שאינם TC-מטופלים 12-ובכן לוח אחד (תנאי התמרה חושית מעושה). הוסף סטרילי HBSS ו- µg/mL 50 מניות CH-296 צעד 3.1 כל הבקבוק/צלחת, בכל ריכוז של µg/cm 22. T-75 המבחנות, להשתמש 3 מ"ל של µg/mL CH-296 + 7 מ של HBSS; לוח 12-ובכן, להשתמש µL 160 של 50 µg/mL CH-296 + 340 µL של HBSS לכל טוב.
    2. לאפשר את הכלים לשבת ללא הפרעה-RT על ספסל נקי או בשכונה עבור 2 ח' וביופסיה 296-CH ולהחליף אותו עם נפח דומה של HBSS סטרילי + 2% אלבומין שור (BSA). דגירה-RT למשך 30 דקות, וארוקן את HBSS/BSA, לשטוף את הכלים עם נפח דומה של HBSS סטרילי המכילה 2.5% 1 מ' HEPES, pH 7.0. האחות מייד לפני ציפוי התאים (שלב 3.4).
      הערה: בעקבות צעד 3.2.2, אינם מאפשרים הצלחות/המבחנות להתייבש. צלחות המכיל סטרילי HBSS + 2.5% 1 מ' HEPES נערכים 4 ° C בלילה (קרי, להכין ביום-1).
  3. הקציר, מגלי CD34 את+ תאים מיום-1.
    1. באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, לשטוף תאים באופן רופף חסיד בשטיפת חוזרות ונשנות, עדין של כל תרבות הבקבוק עם HBSS סטרילי. ודא כי כל התאים תנתק (אם יש צורך, ברז/סטירה הבקבוק כדי לשחרר את התאים).
    2. Centrifuge התאים ב x 800 גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים בתקשורת התמרה חושית כדי ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל.... לאחר שנאסף כל התאים, לקבוע את הרוזן תא, באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית.
    3. להוסיף 1 מ"ל של התא השעיה (1 x 106 תאים) באר אחת של צלחת 12-ובכן CH-296-מצופה (עבור המדגם שליטה מוק-transduced). לחלק שאר התאים בין המבחנות T-75 (שלב 3.2.2), הוספת כ 10 מ ל (1 x 107 תאים) לכל את הבקבוק. לאפשר את התאים לדבוק הציפוי CH-296 מאת המקננת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות, עם פרקו את הפקקים.
    4. הפשרת ממוזגים-וירוס מדיה (VCM, טבלה של חומרים) ולקבוע את כייל ביחידות זיהומיות לכל מיליליטר (IU/mL)28,29,30,31,32 . להוסיף נפח מתאים של VCM כל הבקבוק T-75 מהשלב 3.3.3, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      הערה: אם מבצע של התמרה חושית יחיד, דגירה בין לילה; אם ביצוע של התמרה חושית כפולה, חזור על זה stepapproximately 6 - 8 h לאחר התמרה חושית הראשונה ללא החלמה/שטיפת תלת פאזי ו, אז, דגירה בין לילה. לדוגמה, עבור בקבוק אחד (1 x 107 תאים) עם ריבוי הרצוי של זיהום (MOI) של 10, להוסיף 1 מ"ל של וירוס titered בכל עונה 1 פרק 10-8 IU/mL.

4. תא הקציר והכנה אינפוזיה (יום 1)

  1. לקצור את התאים.
    1. איסוף תאים transduced ו מעושה כמתואר בצעדים 3.3.1 - 3.3.2. ביצוע שוטף רציפים עם 10 מ"ל של HBSS, העברת שוטף את הצינור חרוט עם התאים. ודא כי כל התאים הוסרה מן המבחנות, הקשה/סטירות המבחנות במידת הצורך.
    2. Centrifuge את המתלים תא ב x 800 גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של HBSS. לשלב את הצינורות המכילים תאים באותו המצב. לשטוף כל אחד עם 10 מ"ל של HBSS ולהוסיף את התליה תא. לקבוע את ספירת תאים באמצעות hemocytometer. להביא נפח התאים הכולל 50 מ ב- HBSS וצנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 5 דקות.
  2. דופק פרוסטגלנדין E2 (PGE2) ולהכין ריאגנטים עבור המוצר אינפוזיה.
    1. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend תאי transduced (לא תלעג) כדי 5 x 106/mL HSPC מדיה ללא ציטוקינים. להוסיף 10 מ מ PGE2 ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. דגירה התאים על הקרח כבר שעתיים, בעדינות מתערבל אותם בכל 30 דקות.
    2. במהלך שלב 4.2.1, חום-בטל סרום עצמיים (טבלה של חומרים), גלישת המכולה בנייר שעווה ו המקננת זה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להכין סרום עצמיים 2% בתמהיל (500 µL של נסיוב להשבית חום + 24.5 מ של HBSS), HBSS אותם היטב, ו לאחסן את התערובת על הקרח עד השימוש. בנוסף, במהלך שלב 4.2.1, לקצור מוק-transduced תאים בצלחת 12-ובכן מאת pipetting התאים למעלה ולמטה נמרצות. להוסיף התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, לשטוף אותם 3 x 1 מ של HBSS, ולהוסיף שוטף את הצינור חרוט באותה 15 מ"ל.
    3. לאחר שעתיים של PGE2 דגירה, לשטוף את התאים 2 x על ידי צריך שתוציאו אותם ב x 800 גרם במשך 5 דקות ומחיקת את תגובת שיקוע. לאחר השטיפה השנייה resuspend תאי אחסון מסוג המתאים של HBSS עבור ספירה, באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
      הערה: תאים נדבקות לעתים קרובות לאחר דופק PGE2, אשר יכול להפוך עבור ספירת פחות אמין. אם כן, השתמש. ספירת מהשלב 4.1.2 במקום האחד מהשלב 4.2.3.
  3. שמורת מעושה ותאי transduced לבקרת איכות (שלב 5) של המוצר אינפוזיה: 5 x 105 עונה 1 פרק 106 תאים עבור לזרום cytometry תא מיון (שלבים 5.1 ו- 5.3) של 1 x 106 תאים לתרבות נוזלי (שלב 5.2), המושבה תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) (שלב 5.4).
  4. להכין את המוצר אינפוזיה.
    1. עם שאר התאים transduced, לבצע שטיפה השלישי ב- 50 מ של HBSS, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של HBSS + 2% סרום עצמיים (להכין בשלב 4.2.2). לצייר את הפתרון 10 מ"ל לתוך מזרק 20 מ ל מצויד עם מחט 16.5 גר'. לשטוף את הצינור עם 10 מ"ל של HBSS + 2% אוטומטי סרום וצייר לשטוף את תוך המזרק אותו להביא את הנפח הכולל 20 מ. קאפ המזרק בפקק מחט, לתייג את המזרק, ומניחים אותו על קרח על תחבורה/אינפוזיה.
    2. להשרות את המוצר תא transduced לתוך המחשב המארח עצמיים, ממוקם בתוך מתקן מחקר בבעלי חיים מוסמכים, דרך 33,מרכזי34. לפקח על החיות המושתלים מלאה תא ספירת דם (שלבי), בדיקות דם, הביוכימיה ולבצע מחקר ספציפי ג'ין-סימון מבחני למידותיו של פרויקט1,6,19.

5. בקרת איכות

הערה: Flow cytometry, מיון תא מבוצעות לאחר התאים מעורבבים לתוך החיות כחלק ההמשך שמתואר בשלב 4.4.2. זרימת הנתונים משמשים מיד לאחר השתלת כדי לקבוע את ההרכב של phenotypically מוגדרת קבוצות משנה של תא גזע, קדמון במוצר אינפוזיה (שלבים 5.1 ו- 5.3), בעוד הניתוח של מבחני CFC מתבצע בימים 12-14 cytometric postinfusion כדי לקבוע את היעילות שינוי ג'ין על ידי המושבה PCR (שלב 5.4).

  1. לבצע cytometry זרימה ומיון CFC של המוצר אינפוזיה.
    1. לנתח את התאים ידי cytometry זרימה ולטהר מיון-CD34 קבוצות משנה עבור מבחני CFC, כמתואר בסעיף 2. מבחני CFC זרע של תאי CD34 מדומה ו- transduced (המוצר אינפוזיה אחרי הדופק PGE2).
    2. מיון מספר מרבי של 800 תאים לכל מצב, מערבולת, צלחת, תרבות, ולספור מבחני CFC כפי שמתואר בשלב 2.4. לאחר ספירת, לבחור את המושבות של מבחני CFC לבצע המושבה PCR כפי שמתואר בשלב 5.4.
  2. תרבית נוזלית
    1. צלחת תאים לתרבות נוזלי בתקשורת HSPC-עונה 1 פרק 10 /mL6בצלחות שאינם TC-מטופלים. ימים 2, 5 ו- 12 posttransduction, הקציר, לספור את התאים עבור cytometry זרימה. תא מיון עבור מבחני CFC אינה נדרשת.
    2. בימים 2 ו-5, replate 33% של התאים בתקשורת HSPC טריים-עונה 1 פרק 106/mL. להקפיא 33% של התאים במאגר מיצוי DNA עבור ה-PCR כמותי בזמן אמת. השתמש 33% של התאים עבור cytometry זרימה כפי שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2.
    3. השתמש נתונים אלה מהשלב 5.2.2 כדי לנתח את הרכב פנוטיפי צאצאי hematopoietic. לקבוע את התדירות של תאי CD34 + ואת קבוצות משנה מוגדרים phenotypically כפי שמתואר בשלב 2.2.2 בתוך כל דגימה. להשוות את ההרכב של CD34+ תאים בין תנאי כדי לקבוע את ההשפעה של שינוי ג'ין.
      הערה: CD34+ תאים צריך לשמור על הביטוי שלהם לאורך כל התרבות כולה ומכילים כל קבוצות משנה פנוטיפי. הפסד של CD90+CD45RA– התאים או על overrepresentation של קבוצות משנה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר יכול להצביע על תופעות עקיף או ישיר של שינוי ג'ין.
  3. לכמת ביטוי transgene (למשל., ירוק חלבון פלואורסצנטי [GFP]) על ידי cytometry זרימה (אופציונלי, בהתאם את הגדרת הניסוי), התאמת הפרוטוקול משלב 2.2.
    1. להוסיף שלושה מגרשים זרימה מציג האס/transgene (למשל, האס/GFP). שער העלילה הראשונה על HSCs, השני על מגה-מנות בשנייה-פעימה, והשלישי על מגרש LMPs. כל נגד transgene (למשל, GFP) וליצור השערים בשם מועדון הכדורגל מונפלייה-GFP+MPP-EMP-GFP+, LMP-GFP+, בהתאמה.
    2. כשהפעולה תסתיים, האוכלוסייה הירארכיה חייב להכיל 9 ערכים מאורגנים באופן היררכי לפי הסדר הבא: 1) כל האירועים; 2) פיזור; 3) CD34+; 4) HSC; 5) מועדון הכדורגל מונפלייה-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      הערה: כל ביטוי transgene מאוחר יותר בתרבות נוזלי (למשל, בימים 5 ו- 12) כדאי ישקפו את היעילות שינוי גנטי נקבע על ידי המושבה PCR בשלב 5.4. נקודות זמן קודמות בתרבות נוזלי עשוי מגזים הביטוי transgene, בשל אותו משולבות. באופן דומה, מיון זרימה GFP+ תאים עבור מבחני CFC ביום 1 תגרום במושבות רבות חיובי כוזב.
  4. לבצע המושבה ה-PCR.
    1. לאחר ספירת בשלבים 2.4.4 ו 5.1.1, לבחור אחת המושבות לתוך µL 50 מאגר הפקת דנ א, באמצעות µL של 10 או 20 µL פיפטה, פיפטה למעלה ולמטה כדי להעביר את המושבות שפופרת אחת של 8-PCR רצועת הצינורית. לקחת את המושבות שמונה לפי מצב מדומה מושבות 88 לפי מצב transduced כדי ליצור לוח מלא 96-ובכן אחד. להוסיף 50 µL מאגר מיצוי DNA מכל קידוח.
    2. לחלץ הדנ א של המושבות, תוך שימוש thermocycler של התוכנית הבאה: 65 מעלות צלזיוס/20 דקות, 99 ° C/10min ו 4 ° C החזק. מתכנן להעביר את ה-DNA ל-20 ° C בהקדם לקבלת איכות מיטבית.
    3. לבצע המושבה PCR לכמת תאים LV-transduced, השוואת מספר מושבות LV+ , באמצעות Lenti F/R תחל למושבות הכולל, באמצעות תחל אקטין F/R ושליטה (טבלה של חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל נועד לבודד ולשנות ג'ין-NHP CD34+ HSPCs, אשר לאחר מכן להיות חדורים בחזרה לתוך המחשב המארח עצמיים (איור 1 ואיור 2). כאשר בעקבות פרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להשיג עד 8 x 109 WBCs הכולל של מוניטור להתקפת מ שהצטיירה קופי מקוק, לפעמים, תכפיל את הסכום של קופי מקוק רזוס. בשני המינים, מספר CD34+ HSPCs אנחנו המעשירים הוא יחסי הקלט של הספירה הכוללת WBC (איור 3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV וקטור הנדסה היא השיטה הכי מאופיין ג'ין-לשנות סוגי תאים כגון CD34+ HSPCs, כבר אין ויוו עוקבות. הפרוטוקול המתואר כאן מיועד על מנת למקסם את מספר גנים-לאחרונה HSPCs זה נמשכות לטווח ארוך ויוו, לספק יתרונות קליניים בחולים עם מחלות ממאירות, זיהומיות, גנטי שונות. למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין הופיעו בעשור האחרון, LV-השתנה תאים הם הטובים ביותר למד במבחנה, במודלים של בעלי חיים, מטופלים1,8,20,21

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים הלן קרופורד על הכנת את כתב היד, ג'ים Woolace לעיצוב גרפי, ואת ורוניקה נלסון Devikha Chandrasekaran עבור השתתפות בפיתוח של הפרוטוקול. הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים של NIH המכון הלאומי לאלרגיה, מחלות זיהומיות (R01 AI135953 ו- AI138329 כדי H.P.K.) הלאומי ללב, ריאות, ואת מכון דם (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ו U19 HL129902 אל H.P.K.), כמו גם NIH P51 OD010425, בחלקו דרך מרכז הסרטן NIH/NCI, תמיכה גרנט P30 CA015704. H.P.K. הוא חוקר רפואה מולקולרית מרקי קיבל תמיכה כנמען ההשבעה של חוסה קאררס/דגלס Donnall תומאס ניחן הכיסא לחקר הסרטן, הכיסא ניחן פרד. האץ ' תא, ריפוי גנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Stemspam SFEM II ("HSPC") מדיהStemCell09655
תמיסת מלח מאוזנת של האנקGibco14175095
תמיסת מלח חוצצת פוספטGibco14190-144
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140-122
דימתיל סולפוקסידסיגמא אולדריץ'D2650-100
100% אתנולדקון מעבדותM18027161M
ציקלוספוריןסיגמא30024-25 מ"ג
500 מ"מ EDTAInvitrogen15575-038
סרום בקר עוברי מומת בחוםסיגמא אולדריץ'PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 מ"ל, 1 ומיקרו; g/µ L)TaKaRAT100B
סרום בקר אלבומיןסיגמאA7906-100 גרם
HEPESSigmaH9897
עכברוש נגד עכבר חרוזים מגנטייםIgM Miltenyi Biotec130-047-301
גורם תאי גזע אנושי רקומביננטי (SCF)Peprotech300-07
תרומבופויטין אנושי רקומביננטי (TPO)Peprotech300-18
רקומביננטי אנושי דמוי FMS טירוזין קינאז 3 (FLT-3)Peprotech300-19
פרוטמין סולפטסיגמאP-4505
14 מ"ל פוליפרופילן צינור עגול תחתון
ג'ל מושבה 1402ReachBio1402
מפרידי QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 עמודותMiltenyi biotec130-042-401
10 מ"מ PGE2קיימן כימי14753-5 מ"ג
צלוחיות T-75 שטופלו TCBioexpressT-3001-2
צלוחיות T-75 שאינן מטופלותThermo-Fisher13680-57
20 מ"ל מזרקיםBD Biosciences302830
16.5 גרם מחטיםBD מכסה305198
BD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
מכסה רצועה 8 צינורות PCRארה"ב מדעי1402-2708
96-well ThermocyclerThermo-Fisher
מסנני הפרדה מראשMiltenyi Biotec130-041-407
מסננת, תא; בי.די פלקון; עקר; רשת ניילון; גודל רשת: 70um; צבע: לבן; 50/CSFisher Scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 מ"ל Luer-Lock מזרקיםתרמו-פישר14823435
35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבית תאיםקורנינג430165
60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת תרבית תאיםקורנינג
430196 צלחת תרבית תאים בגודל 150 מ"מ x 25 מ"מקורנינג
שאינן מטופלות TC פלקון353133
מיצוי DNA QiagenQiagen51104
PE אנטי אנושי CD90 (Thy1) שיבוט: 5E10Biolegend328110
PE-CF594 עכבר אנטי אנושי CD34 שיבוט: 563BD אופק562449
שיבוט עכבר APC-H7 אנטי אנושי CD45RA: 5H9BD Pharmingen561212
V450 עכבר אנטי-NHP CD45 שיבוט: d058-1283BD Biosciences561291
סרום אוטולוגינאסף ממארח אוטולוגי ונשמר בהקפאה לפני גיוס ואיסוף של CD34+ HSPCsN/Aבירד, ב. ס. ואחרים. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010).
מדיה מותנית וירוסים (VCM)מעבדת קיים, המרכז הקואופרטיבי FHCRC למצוינות בהמטולוגיה (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010).
נוגדן נגד CD34, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. בחירה יעילה ויציבה בתיווך MGMT של תאי גזע המאוכלסים מחדש לטווח ארוך בפרימטים לא אנושיים. כתב העת לחקירה קלינית. 120 (7), 2345-2354, (2010).
פריימר Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAטכנולוגיות DNA משולבותN/APeterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016).
פריימר Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAטכנולוגיות DNA משולבותN/APeterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016).
פריימר Actin F: TCCTGTGGCACTCACGAAACTטכנולוגיות DNA משולבותN/APeterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 ובחירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016).
פריימר Actin R: GAAGCATTTGCGGTGGACCGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. השתלה רב-שבטית רב-שושלת של תאים שעברו שינוי בגן Cal-1 וברירה in vivo לאחר זיהום SHIV במודל פרימטים לא אנושי של איידס. שיטות מול תר Clin Dev. 3 16007, (2016).
352059 TC קצה מזרק מדויק 4375786 צלוחיות 430599

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389(2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173(2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34(2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD34HSPC

מאמרים קשורים