כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטרת שיטה זו היא למדוד את הפעילות הפרוטאוליטי של דגימות ביולוגיות מורכבות. הדגימות מופרדים באמצעות משקל מולקולרי באמצעות אלקטרופורזה באמצעות ג'ל פתרון מוטבע עם מצע מתכלה. שיטה זו שונה zymography ג'ל מסורתיות בכך fluorogenic מתרצה פפטיד הוא שולב covalently הג'ל פתרון במקום חלבונים באורך מלא, כגון ג'לטין או קזאין. השימוש פפטידים fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות הפרוטאוליטי ללא שלבים נוספים מוכתמים. אנזימים בתוך דגימות ביולוגיות קליב פפטיד fluorogenic מתרצה, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה. האות פלורסנט, ג'לים ולאחר מכן עם תמונה עם סורק ג'ל פלורסנט רגיל, לכמת באמצעות densitometry. השימוש של פפטידים המצע מתכלה מאוד מרחיבה של פרוטאזות אפשרי לזיהוי בטכניקות zymographic.
מבוא
ג'ל zymography היא טכניקה ביולוגי למדידת פעילות הפרוטאוליטי בתוך דגימות ביולוגיות, כגון נוזלי הגוף או תא תרבות המדיה1,2,3. הדגימות מופרדים באמצעות משקולות מולקולרית שלהם עם אלקטרופורזה באמצעות ג'ל לזיהוי מוטבע עם מצע מתכלה. מצעים מתכלה נפוצים כוללים ג'לטין, קזאין, קולגן ואלסטין, אשר שימשו כדי למדוד את הפעילות של מטריקס metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7, -8,-9 ו-11, בנוסף למגוון cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. לאחר אלקטרופורזה, האנזימים renatured הינם מותרות כדי להשפיל את החלבון בתוך הג'ל. Zymography ג'ל מסורתיים, הג'ל הוא מוכתם צבע חלבון, כגון כחול Coomassie, ולאחר פעילות פרוטאז מתגלה כמו איבוד אות, קרי, לבנים להקות (השפלה של חלבון) על רקע כחול כהה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שיטה חלופית zymography ג'ל, שבו המצע מתכלה הוא קצר, פפטיד fluorogenic covalently שולבו הג'ל לזיהוי (איור 1). ההחלפה של peptides סינתטי בשם דיאלקטריים מתכלה מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות לעומת zymography ג'ל מסורתי עם חלבונים מקורית9. להצמדת קוולנטיות פפטיד fluorogenic מונע פעפוע פפטיד והעברה במהלך בג'ל נצפתה עם שיטות קודמות9,10. יתר על כן, השימוש של מצע fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות פרוטאז מבלי להכתים נוספים וצעדים מבטל את ההגדלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא הגילוי של פעילות פרוטאז דגימות ביולוגיות באמצעות שיתוף קוולנטיות פפטידים fluorogenic zymogram ג'ל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת שכבת ג'ל פתרון
- להכין לזיהוי של 10% פתרון פתרון ג'ל לפי טבלה 1. הוסף את Tetramethylethylenediamine (TEMED) ואת אמוניום Persulfate (APS) מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
- למלא קלטת מיני ג'ל של ריק 1.5 מ מ בחצי הדרך (5 מ"ל) הפתרון ג'ל פתרון 10%.
- הוסף שכבה דקה של אלכוהול איזופרופיל (~ 500 µL) לחלק העליון של הג'ל לזיהוי לייצר ג'ל ברמה, למנוע בועות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 40 דקות).
2. הכנת המולקולה מקשר Azido-PEG3-maleimide
- ואילו השכבה ג'ל פתרון הראשונה היא polymerizing, לאחזר את ערכת azido-PEG3-maleimide אחסון-20 ° C ולאפשר המרכיבים לטמפרטורת החדר. ישנם שני מרכיבים כל ערכה. מבחנה 1 מכיל של אסתר maleimide-NHS, בצבע אופ-וייט גריי מוצק. בקבוקון 2 מכיל azido-PEG3-אמין, שמן מעט צהבהב.
שים לב: המחברים מציע באמצעות ערכת azido-PEG3-maleimide 25 מ ג כפי ניתן לאחסן רק לפרקי זמן קצרים של זמן (1-2 שעות) ב-20 ° C אחרי הכנה לפני שזה מתחיל להתפורר. 25 מ ג מספיקה לייצר 10 פפטיד ג'לים. השתמש ג'לים בתוך 3 שבועות של הכנה. - להמיס את הרכיבים של מבחנה 2 היצרן מומלצת כמות דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואת מערבולת ב-30 s כדי להבטיח לו נוזלים יש מספר טוב.
- העברת תכולת הבקבוקון 1 לתוך בקבוקון סיבוב למטה נקי, יבש 100 מל המכילה בר מערבבים.
הערה: יש לשטוף את הבקבוק עם אצטון, להתייבש לחלוטין לפני השימוש כדי למנוע לחות מתנגש עם התגובה. - מיד להוסיף פקק מחצה גומי עם הדיאפרגמה זה יכול להיות ניקב בעזרת מזרק לתוך הפה של הבקבוק. לעבוד מהר כדי למנוע לחות להזין את הבקבוקון.
- הוספת שני 18 מד מזרק מחטים לתוך הסרעפת וחבר אחד מיכל גז אינרטי (למשל גז ארגון). לאפשר גז אינרטי כדי למלא את הבקבוק במשך 3 דקות לערבב את הרכיבים של בקבוקונים 1 ו- 2 תחת גז אינרטי כדי למנוע תגובה לא רצויה מוצרים.
התראה: מחט מזרק השני נועד לספק אוורור, ובכך לאפשר את האוויר האטמוספרי הכלול בתוך הבקבוק לזרום מתוך הבקבוק כפי הוא ממלא גז אינרטי. אל תשכח לכלול מחט פתח! - מכבים את הגז אינרטי תוך הפרדתה של המחט. באמצעות מזרק, להזריק את התוכן המלא של מבחנה 2 לתוך הבקבוק.
- הסר מחטים והן מזרק ולאפשר את הרכיבים לערבב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
- הסר את פקק הגומי מחצה ולהעביר את התוכן שפופרת צנטרפוגה נקיים מ. הפתרון azido-PEG3-maleimide יש להשתמש בתוך שעה בטמפרטורת החדר.
3. הכנת פפטיד לפתרון שכבת ג'ל
- לאחר השכבה הראשונה ג'ל פתרון כולל polymerized, יוצקים את השכבה אלכוהול איזופרופיל. לשטוף את החלק העליון של הג'ל על ידי pipetting 1 מ"ל של מים יונים על גג הג'ל, ואז לשפוך את המים.
- לאחזר את פפטיד פלורסנט תיול-functionalized-80 ° C אחסון ולאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר.
הערה: פפטיד תיול-functionalized ניתן להכין כפי שתואר לעיל11,12. פפטידים זמינים מסחרית יכול לשמש גם אבל דורשים התוספת של משקע ציסטאין מסוף כדי לאפשר את maleimide-תיול לחץ על התגובה. להמיס את פפטיד כדי ריכוז מניות של 10 מ מ ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots קטן (30 uL) להגבלת מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה. - הכינו 10% פתרון פתרון ג'ל המכיל את המולקולה azido-PEG3-maleimide מקשר את פפטיד פלורסנט לפי טבלה 1. הוסף את TEMED ואת APS מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
- ממלאים חצי החלק הנותר של קלטת ג'ל (3 מ ל) פפטיד פתרון פתרון ג'ל.
הערה: בגישה ג'ל פתרון רב-שכבתית מפחיתה את כמות פפטיד, מקשר הכרחי עבור כל ג'ל. יכול להיות מותאם לגודל השכבה ג'ל פפטיד פתרון כדי להתאים מגוון גדול יותר של משקולות מולקולרית כנדרש. - Pipette שכבה דקה של אלכוהול איזופרופיל (~ 500 µL) לחלק העליון של הג'ל לזיהוי לייצר ג'ל ברמה, למנוע בועות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 40 דקות).
הערה: פפטיד פלורסנט הוא רגיש אור. שמור את ג'לים מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching במהלך הכנת ג'ל אלקטרופורזה, כביסה, פיתוח. - יוצקים את השכבה אלכוהול איזופרופיל ולשטוף העליון של פפטיד פתרון ג'ל עם מים יונים כמו שלב 3.1.
- אם משתמש את ג'ל באופן מיידי, להמשיך לשלב 4, אחרת, לטבול את ג'לים מוכן ב- 100 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C בתוך קופסת פלסטיק כדי למנוע את ג'לים ממנו להתייבש. לעטוף את תיבת בנייר אלומיניום כדי למנוע photobleaching. ג'לים ניתן לאחסן PBS עד 3 שבועות לפני השימוש.
4. הכנה של הג'ל הערימה
- להכין פתרון ג'ל הערימה 5% לפי טבלה 1. הוסף את TEMED ואת APS מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
- למלא את החלק הריק הנותר של קלטת ג'ל (~ 2 מ"ל) הפתרון ג'ל הערימה.
- להוסיף במהירות מסרק ג'ל 1.5 מ מ אל שכבת ג'ל הערמה, מוודא שאין בועות נשארים לכודים תחת הבארות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 10 דקות).
- הסר בעדינות את המסרק, והקלטת מהחלק האחורי של קלטת ג'ל.
5. הכנה של דגימות ביולוגיות אלקטרופורזה
- להכין מדיה תאים ממוזגים, lysates תא, רקמה homogenates ותקני MMP כמתואר תחת תנאים שאינם בהפחתת2. לא לא מחממים את הדגימות.
- לדוגמה, להכין מדיה תאים ממוזגים כמפורט להלן:
- צלחת 40,000 תאים/cm2 תאים צלחת 6-ובכן בתקשורת תרבות סרום שור עוברית (FBS) 10%. דגירה תאים בתוך תא humidified (5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות, לאפשר להם להגיע למפגש 70-80%.
הערה: אם התאים לא הגיעו את confluency הרצוי לאחר 24 שעות, לאפשר להם לגדול ב- 10% FBS תרבות המדיה 24 שעות נוספות. - לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל של סרום ללא תרבות המדיה. דגירה התאים בתוך תא humidified (5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס) 24 שעות נוספות.
- באמצעות פיפטה סרולוגית, לאסוף את המדיה ממוזגים מכל קידוח. Centrifuge התקשורת-1200 סל ד במשך 3 דקות להסיר את כל שאריות תאים. קח את תגובת שיקוע, להתרכז באמצעות a 15 מ"ל, יחידת מסנן צנטריפוגלי סף משקל מולקולרי 10 kDa. Centrifuge היחידות מסנן ב 4000 x g למשך 15 דקות רוטור דלי מתנדנדים או g x 5,000 למשך 15 דקות רוטור זווית קבועה.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך ניתן לשפר את עוצמת הלהקות הפרוטאוליטי של ג'לים zymography פפטיד. - להעביר את פילטרט מרוכז של שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים. Aliquot מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שלושה מחזורים ההקפאה-הפשרה.
- צלחת 40,000 תאים/cm2 תאים צלחת 6-ובכן בתקשורת תרבות סרום שור עוברית (FBS) 10%. דגירה תאים בתוך תא humidified (5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות, לאפשר להם להגיע למפגש 70-80%.
- לכמת את תכולת החלבון שימוש assay כימות של חלבון סטנדרטית (למשל BCA, ברדפורד Assay, וכדומה).
6. אלקטרופורזה של הביולוגיה דוגמאות בפפטיד Zymography ג'ל
- להמיס הדגימות במאגר מדגם zymography קונבנציונלי (62.5 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, bromophenol 0.01% 25% גליצרול, 4% מרחביות, כחול). עבור דגימות תאים ורקמות, מומלץ ~ 30 µg של חלבון סה כ ליום טוב, ו- 50-100 ננוגרם של חלבון עבור MMP סטנדרטים.
- להוסיף 400 מ של 1 x טריס-גליצין מרחביות הפעלת מאגר למכשירים ג'ל. לטעון µL עד 35 מדגם לכל טוב. הפעל את הדגימות-120 V ב 4 ° C 1.5 שעות או עד המידה משקל מולקולרי מציינים כי פרוטאזות עניין נמצאים במרחק פפטיד לפתרון שכבת ג'ל (בעל צבע כתום גלוי).
הערה: רוב MMPs ואת גירסאותיהם ליפול בטווח של 35-100 kDa. כאשר הסטנדרטים משקל מולקולרי לציין כי משקולות אלה נמצאים במרחק פפטיד לפתרון שכבת ג'ל, ניתן לעצור אלקטרופורזה. ניתן להחיל את אותו עיקרון מעמדות אחרים של פרוטאזות עם משקולות מולקולרית ידוע. אם יש אינטרס גילוי פרוטאזות מרובים על טווח גדול יותר של משקולות מולקולרית, להקטין את הגודל של שכבת ג'ל פתרון ולהגדיל את הגודל של השכבה ג'ל פפטיד פתרון. - בעקבות אלקטרופורזה, להסיר את ג'לים בקלטת פלסטיק ולשטוף ג'לים שלוש פעמים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת עדין עצבנות במאגר renaturing המכילים 2.5% טריטון X-100, 1 מיקרומטר ZnCl2ו- 5 מ מ CaCl2 ב- 50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5.
- העברת ג ' לים כדי לפתח פתרון מאגר המכיל 1% טריטון X-100, ZnCl 1 מיקרומטר2 ו CaCl 5 מ מ2 ב- 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 15 דקות להחליף עם פיתוח טריים מאגר פתרון דגירה ג'לים ב 37 ° C תחת עצבנות עדין למשך 24 שעות , מוודא ג'לים הם submersed באופן מלא בפתרון.
7. הדמיה של פפטיד Zymography ג ' לים
- לאחר 24 שעות, ג'לים התמונה באמצעות פלורסנט ג'ל סורק/imager באמצעות את המסננים המתאימים עירור, פליטה. לדוגמה, ג'לים פפטיד המוצג בתוצאות נציג הם מצומדת עם Fluorescein ' היו עם תמונה באמצעות מסנן עירור של 488 ננומטר, מסנן פליטה של 521 ננומטר. שימוש את המסננים המתאימים עבור fluorophore שלך יהיה למקסם את הגילוי של פעילות הפרוטאוליטי.
הערה: תמונות יכולות להילקח גם עם imager ג'ל מצוידים transilluminator UV, המשמשת לעתים קרובות ההדמיה של ה-DNA ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. תמונה של ג'לים באמצעות את transilluminator UV (365 ננומטר) הגדרת ואת מסנן פליטה של 590 ננומטר. - לבצע הערכה densitometric של הלהקה עוצמות באמצעות ImageJ כמתואר13.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות השיטה המתוארת כאן, שני ניאון פפטידים פרוטאז-מתכלים אוחדו ג'לים לזיהוי: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (באופן מקוצר כ- QGIW לאורך הטקסט ואת המספרים) ו GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (באופן מקוצר כ- LACW לאורך הטקסט ואת המספרים). ↓ מציין האתר של המחשוף. QGIW הוא קולגן-אני נגזר רצף תוכננה לאתר collagenases הסלולר14. LACW הוא רצף מוטבה איתור MMP-14 ו- MMP-1115. פפטידים מסומנות עם dabcyl (כ'חטיף), fluorescein (fluorophore)...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקות zymographic הנוכחיים מסתמכים על שילוב של סובסטרטים יליד לתוך לזיהוי ג'לים איתור proteolysis. ואילו טכניקות אלה משכו השימוש הנרחב, הם עדיין מוגבלים במספר של פרוטאזות שהם יכולים לזהות. . הנה, פרוטוקול תוארה בפפטידים פלורסנט, פרוטאז-מתכלים אשר משולבים של לזיהוי פתרון ג'ל. קוולנטיות צימוד באמצעות מולקולה מקשר azido-PEG3-maleimide מאפשר את הפרדה וזיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות יותר הוא כיום השגה עם מצעים מקורית. הטבע מאוד tunable של ניאון פפטידים מעניק חוקרים את היכולת לעצב סובסטרטים שיכולות היעד שלהם פרוטאזות ענ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מימון מסופקים על ידי אוהיו סטייט אוניברסיטת להנדסה, המחלקה להנדסה ביו-רפואית של מקיף במרכז לחקר הסרטן - ארתור ג ג'יימס סרטן החולים ו ריצ'רד ג' Solove מכון מחקר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"מ קלטות ג'ל ריקות | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 מ"מ, 10 באר מסרקי קלטת ג'ל ריקים | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x פוספט חוצץ מלח | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) אקרילאמיד/ביס (19:1) | אמביון | AM9022 | |
| 6 צלחות תרבית רקמות באר | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 יחידת מסנן צנטריפוגלי (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | קליק כימיה כלים | AZ107 | |
| סידן כלוריד | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| דימתיל סולפוקסיד | פישר סיינטיפיק | BP231 | |
| איזופרופנול | פישר סיינטיפיק | A416P | |
| ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N 'N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac ספק כוח בסיסי | Bio-Rad | 1645050 | |
| דיוק פלוס חלבון צבע כפול סטנדרטי | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide מחטים היפודרמיות | פישר סיינטיפיק | 14-826 | |
| בקבוק תחתון עגול (100 מ"ל) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| פקק גומי מחיצה | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| מזרק קצה החלקה סטרילי (1 מ"ל) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| טייפון 9410 הדמיה מולקולרית | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| אבץ כלוריד | סיגמא-אולדריץ' |
מקורות
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
