מאמר שיטה

מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 בפברואר 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנועה stomatal שמתווכת חילוף הגזים צמח, אשר חיוני פוטוסינתזה ועל דיות. פתיחה וסגירה stomatal מוכשרות על ידי עלייה משמעותית או להקטין את נפח התאים משמר, בהתאמה. בגלל הסעה של יונים, מים מתרחשת בין משמר תאים גדול יותר התאים באפידרמיס הסמוכים במהלך התנועה stomatal, התפלגות במרווחים של הפיוניות הצמח נחשב של התפלגות אופטימלית עבור התנועה stomatal. מערכות ניסיוני perturbing התבנית במרווחים של הפיוניות שימושיים לבחון את המשמעות של התבנית המרווח. זוהו מספר גנים מרכזיים המשויכת להתפלגות stomatal במרווחים, הפיוניות clustered יכולה להיגרם השפעול על ידי שינוי גנים אלה. לחלופין, הפיוניות clustered יכולה גם להיגרם על ידי טיפולים אקסוגני ללא שינוי גנטי. במאמר זה נתאר מערכת אינדוקציה פשוטה עבור הפיוניות באשכולות בשתילי תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. השיטה שלנו היא קלה, ישירות החלים על קווים הטרנסגניים או מוטציה. מהכלורופלסט גדול מוצגים כמו סימן היכר התא הביולוגי של סוכרוז-induced תאי המשמר באשכולות. בנוסף, תמונת הנציגה מיקרוסקופיים קונאפוקלית של microtubules קורטיקלית מוצג בתור דוגמה של התבוננות תאיים תאי המשמר באשכולות. בכיוון רדיאלי microtubules קורטיקלית נשמרת בתאי המשמר באשכולות כמו תאי המשמר במרווחים בתנאי בקרה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סטומה רפואית הצמח הוא איבר חיוני עבור חילוף הגזים על פוטוסינתזה ועל דיות, תנועה stomatal מושגת על ידי שינויים משמעותיים בתאי המשמר דרך ספיגת מונחה יון ושחרור של מים. תחת מיקרוסקופ, ניתן להבחין דפוס הפצה במרווחים של הפיוניות של משטחי העלים והגבעולים. הפיזור במרווחים של הפיוניות נחשב כדי לעזור stomatal, תנועה מוסדר על ידי חילופי יון ומים בין תאי המשמר גובלות תאים אפידרמיס1,2. מערכות אינדוקציה ניסיוני הפיוניות באשכולות שימושיים חוקרים את החשיבות של ההתפלגות במרווחים של הפיוניות.

בעבר דווח כי קיבוץ באשכולות המרחבי של הפיוניות יכולה להיגרם על ידי שינוי גנטי של גנים מרכזיים משמר תא בידול3,4 או טיפול עם תרכובת כימית5. אנחנו גם דיווח כי טיפול טבילה עם פתרון בינוני בתוספת סוכרים כולל סוכרוז, גלוקוז, פרוקטוז גרם stomatal קיבוץ באשכולות בפסיגי הזרע של תודרנית לבנה שתילים6. Callose מופחת בקירות התא החדש הפרדת meristemoids תאים אפידרמיס נצפתה האפידרמיס cotyledon שטופלו סוכרוז, רומז כי סוכרוז פתרון טבילה טיפול משפיעה באופן שלילי על דופן התא, המונע את בריחת ו פעולה חוץ רחמי של ג'ין מפתח מוצרים עבור השומר תאית התמיינות (למשל גורמי שעתוק) לכיוון סמוכים עוריות תאים6. מנגנון דומה הוצע ממחקרים על gsl8/chor מוטציות7,8. מערכת הניסוי שלנו עבור אינדוקציה לשחזור של הפיוניות באשכולות באמצעות פתרון בינוני המכילים סוכרוז הוא די קל וזול. זה יכול לשמש גם כדי לחקור מבנים תאיים כגון organelles, את שלד התא בתאי המשמר באשכולות כאשר חל על קווים הטרנסגניים לבטא פלורסנט סמני את תווית מבנים תאיים9, 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון

  1. להוסיף 1.1 גרם של מלחי בינוני Murashige-Skoog ו- 15 גר' סוכרוז גביע.
  2. מוסיפים 490 מ ל מים מזוקקים ומערבבים היטב בעזרת בר מערבבים.
  3. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות קו.
  4. לדלל עד 500 מ"ל מים מזוקקים ולהעביר את הפתרון לתוך בקבוק בינוני.
  5. לחטא את הפתרון על-ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות). אם לא משתמשים מיד, פתרון זה נשמרות ב 4 ° C לאחר עיקור.

2. אינדוקציה של הפיוניות באשכולות מאת המכילים סוכרוז טיפול טבילה פתרון בינוני

  1. לחטא את הזרעים.
    1. להכין את הפתרון עיקור על-ידי הוספת µL 500 של 5% כלור פעיל פתרון NaClO µL 1 של 10% טריטון X-100 ל 500 µL במים סטריליים.
    2. מקום ca. 50 הטרנסגניים זרעים לבנה א נושא סמן פלורסנט כגון CT-GFP11 -GFP-TUB612 לתוך צינור 1.5-mL.
    3. להוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול פתרון, לערבב היטב על ידי היפוך חמש פעמים. יוצאים 1 דקות.
    4. הזרעים ישקעו לתחתית הצינור. על ספסל נקי, בעדינות להסיר האתנול 70% שימוש של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של עיקור פתרון. מערבבים היטב בעזרת היפוך חמש פעמים ולהשאיר למשך 5 דקות.
    5. לשטוף את הזרעים. עדיין עובד בתנאים aseptic על ספסל נקי, בעדינות להסיר הפתרון באמצעות של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים. חזור על שלב זה חמש פעמים.
  2. להוסיף 1.5 מ של סטיריליים 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון כל טוב של צלחת 24-טוב על ספסל נקי.
  3. להוסיף שני זרעים סטיריליים כל טוב. סרט הדבקה המכסה על צלחת 24-ובכן באמצעות שתי שכבות של מצלמות-מיקרוסקופים.
  4. להעביר את הצלחת. ובכן 24 סדרה קאמרית הצמיחה ב 23.5 ° C עם מחזור בהירה-כהה 12-h/12-ה באמצעות 100 µmol מ'−2 s− 1 לבן אור, תקופת דגירה של 14 ימים.

3. מיקרוסקופיים התבוננות הפיוניות באשכולות

  1. מקום 30 µL של 3% המכילים סוכרוז 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון מהבאר של צלחת 24-ובכן במרכז זכוכית (גודל: 76 × 26 מ מ, עובי: 1.0-1.2 מ מ).
  2. להסיר cotyledon של שתיל בת 14 יום באמצעות מספריים ויבתר. לצוף על cotyledon עם הצד תצפית כלפי מעלה על המסירה פתרון.
  3. הכינו את הדגימה cotyledon על פי השיטה הקודמת שלנו13. בעיקרו של דבר, במקום 30 µL של הפתרון על המרכז של כיסוי זכוכית (גודל: 18 × 18 מ מ, עובי: 0.12-0.17 מ מ). הפוך את הזכוכית המכסה ומניחים אותו על cotyledon בעדינות. . תנגב את מאגר עודף באמצעות רקמה נטולת מוך.
  4. להגדיר טיפוס על הבמה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ובחר באשכולות תאי המשמר להשגחה באמצעות תאורה שדה בהיר.
  5. לרכוש תמונות קונאפוקלית של מבנים תאיים fluorescently עם תוויות ברורות על פי הוראות היצרן מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. הנה, הוצגו הפרוטוקול עבור שיטה פשוטה של גרימת קיבוץ באשכולות stomatal המכילים סוכרוז פתרון בינוני ב לבנה א שתילים. תאי המשמר באשכולות גדלו ב פתרון בינוני המכילים סוכרוז (איור 1B) יש מהכלורופלסט גדול יותר מאשר תאי המשמר גדל בתנאי בקרה ללא סוכרוז (איור 1א'). ההגדלה של מהכלורופלסט אושר עם CT-GFP11, סמן משתית כלורופלסט, כלורופיל autofluorescence (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוצגו פרוטוקולים עבור אינדוקציה של הפיוניות באשכולות בשתילי לבנה א על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. כמוצג להלן, שיטה זו היא פשוטה מאוד ולא דורש שום מיומנות מיוחדת אבל יכול לגרום ביעילות הפיוניות באשכולות. יותר מ- 45% תאי המשמר מקובצים עם 3% סוכרוז המכילות בינוני פתרון (כלומר ערכים של יותר מ- 20 תצפיות עצמאיות)6. יתר על כן, מערכת ניסויית זו ניתן ישירות להחיל שורות הטרנסגניים או מוטציה כמוצג לקווים הטרנסגניים CT-GFP (איור 1) או GFP-TUB6 (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים על פרופסור Seiichiro Hasezawa בשל תמיכתו סוג העבודה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגודה יפן KAKENHgrant של קידום המדע (JSPS) מספרים 17K 19380, 18 H. 05492, מקרן מענק לפרויקטים מחקר מדעי בסיסי Sumitomo להעניק מספר 160146, ואת קרן Canon תוצרת הארץ מערכת ניסויית זו פותחה תחת התמיכה הכספית של המספר JSPS KAKENHgrant 26891006 ק. א אנו מודים רובי לואיס, MSc, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 24 בארותסומיטומו בקליטMS-0824R
488 ננומטר לייזרפורוקאווה דנקוHPU-50101-PFS2
488 ננומטר לייזראולימפוסספיר 488-20/O
510 ננומטר מסנן מעבר ארוךאולימפוסBA510IF
524 - 546 ננומטר מסנן מעבר פסSemrockFF01-535/22-25
530 ננומטר מעבר קצר מסנןאולימפוסBA530RIF
561 ננומטר לייזרCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 ננומטר מסנן מעבר פסSemrockFF01-624/40-25
ראש סריקת לייזר קונפוקליYokogawaCSU10
ראש סריקת לייזר קונפוקליאולימפוסFV300
מצלמת CCD מקוררתפוטומטריהתוכנת רכישת תמונות CoolSNAP HQ2
מכשירים מולקולרייםMetaMorph גרסה 7.8.2.0
תוכנה לרכישת תמונותOlympusFLUOVIEW v5.0
שמן טבילהשמן טבילה אולימפוסType-Fne = 1.518 (23 מעלות)
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX-70
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX-71
תערובת מלח צמחי Murashige ו-SkoogFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T and Skoog F (1962) מדיום מתוקן לצמיחה מהירה ובדיקות ביולוגיות עם תרביות רקמת טבק. פיזיולוגיה פלנטרום 15(3), 473-497.
עדשת אובייקטיב אולימפוסUPlanApo 100x / 1.35 NA קשתית שמן 1.35NA = 1.35
עדשת אובייקטיבי אולימפוסUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
סוכרוזFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Murashige Skoog

מאמרים קשורים