Method Article

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

DOI:

10.3791/58975

⸱

June 11th, 2019

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine, Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכבד מטהר חומרים מזיקים, מפריש חלבונים חיוניים, ומבצע פעילויות מטבולית מפתח, ובכך לקיים חיים. כתוצאה מכך, אי ספיקת כבד-אשר יכול להיגרם על ידי צריכת אלכוהול כרונית, צהבת, הרעלה חריפה, או עלבונות אחרים-הוא מצב חמור שיכול להגיע לדימום, צהבת, תרדמת, ובסופו של דבר מוות. עם זאת, גישות לטיפול בכישלון בכבד, כמו גם מחקרים של תפקוד הכבד ומחלות, היו מעטים בחלקם על ידי חוסר אספקה בשפע של תאי הכבד האנושיים. למטרה זו, פרוטוקול זה מפרט את הבידול היעיל של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך תאים של hepatocyte, מונחה על ידי מפת דרכים התפתחותית המתארת כיצד מצוין גורל הכבד על פני שישה צעדי בידול רצופים. על ידי מניפולציה מסלולים התפתחותיים איתות כדי לקדם בידול הכבד, כדי לדכא במפורש את היווצרות של גורלות תא בלתי רצויים, שיטה זו מפיקה ביעילות אוכלוסיות של ושלתי הכבד האנושי ניצן ו hepatocyte-תאים כמו יום 6 ו -18 של PSC בידול, בהתאמה. הדבר מושג באמצעות שליטה מדויקת באופן זמני של משעולים אותות התפתחותיים, המופעל על ידי מולקולות קטנות וגורמי גדילה במדיום תרבות ללא סרום. הבידול במערכת זו מתרחשת במונאולאיירס ומניב תאים הירופציט המבטאים אנזימים מאפיינים מאופיינים ובעלי יכולת לעבור מודל עכבר של אי ספיקת כבד כרונית. היכולת לייצר ביעילות מספר גדול של תאי כבד אנושיים בתוך מבחנה יש השלכות לטיפול בכשל בכבד, לסינון תרופות, ולמחקרים מכניסטיים של מחלות כבד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להבדיל ביעילות בתאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך אוכלוסיות מועשר של הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים2. גישה לאספקת מוכן של הכבד האנושי ושלתי ו hepatocyte תאים להאיץ את המאמצים לחקור את תפקוד הכבד ואת המחלות יכול לאפשר טיפולים חדשים השתלת תאים לכשל בכבד3,4, 5. המשך זה הוכיח מאתגרת בעבר מאז hPSCs (אשר כוללים מעובריים והמושרה תאים גזע pluripotent יכול להבדיל לכל תא-סוגי הגוף האנושי; כתוצאה מכך, היה קשה להבדיל באופן בלעדי לאוכלוסיה טהורה של סוג תא אחד, כגון תאי כבד6.

כדי ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת בידול מדיה

הערה: עיין בטבלה של חומרים לקבלת מידע אודות היצרן בנוגע לחומרים וריאגנטים בשימוש.

  1. הכנת מדיה בסיסית המוגדרת כימית (CDM)
    הערה:     CDM2, CDM3, CDM4 ו-CDM5 הם מדיה המוגדרים כימית המשמשים כאמצעי הבסיס להבדיל בין hPSCs תאי הכבד בשלבים שונים. הרכב של מדיה אלה ניתן למצוא בטבלה 1.
    1. כדי להפוך CDM2 או CDM3, להכין פתרון מניות המכיל אלכוהול פוליוויניל (PVA). התמוססות 0.5 g של אבקת PVA ב 50 מ ל של Iscove שונה של בינונית של המדיום (IMDM) כדי ליצור 10 מ"ג/mL מניות PVA.
      הערה: מאז PVA אינו מתמוסס בקלות, להכין את התערובת PVA/IMDM בבקבוק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר 24 שעות של בידול APS, המושבות בדרך כלל לאמץ מורפולוגיה שונה מאשר מושבות מובחן במקביל עם אובדן של גבול בהיר כי בדרך כלל להקיף המושבות hPSC. מורפולוגית, בתאי פס פרימיטיבי בדרך כלל יש גבולות משונן והם התפשטה יותר ופחות קומפקטי מ hPSCs-זה מעורר המעבר אפיתל-to-mesenchal כמו בתאי הפיצוץ epiuriבתאים להבדיל וכניסה לתוך פרימיטיבי רצף בvivo. אם גודל המושבה של הhPSCs לפני הבידול היה גדול מדי, יהיה מרכז גלוי לעין הכוללת תאים מובחן. יש להיפטר מתרבויות המכילות גושים גדולים כאלה, מכיוון שמרכזי המוש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מאפשרת את הדור של אוכלוסיות מועשר של ושלתי הכבד ניצן, ולאחר מכן התאים של hepatocyte, מ hPSCs. היכולת ליצור אוכלוסיות מועשר של תאי כבד אנושיים חשובה לניצול מעשי של תאים כאלה. השיטות הקודמות להפקת hepatocytes מ hPSCs הניבו אוכלוסיות תאים טמא המכיל הן הכבד והן תאים שאינם בכבד, על השתלת לתוך מכרסמים, הניבו עצם וסחוס בנוסף לרקמת הכבד15. מכאן שדיכוי מפורש של בידול שאינו כבד הוא קריטי להפקת אוכלוסיות כבד מועשר שעשויות להתאים למגוון יישומים.

בעיקר, ציפוי מבוקרת של hPSCs.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בינג Lim לדיונים ומכון סטנפורד עבור ביולוגיה של תאי גזע & רפואה רגנרטיבית לתמיכה בתשתיות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית (DISC2-10679) ואת סטנפורד-UC ברקלי מכון תאי גזע של המכון (ל L.T.A. ו K.M.L.) ואת סטנפורד בקמן המרכז לרפואה מולקולרית וגנטית, כמו גם אנונימי, משפחות בקסטר ודיג'נובה (ל-K.M.L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  GeltrexThermofisher ScientificA1569601
1:1 DMEM/F12Gibco11320033
0.2  μ m מסנן קרום נקבוביותMilliporeGTTP02500
mTeSR1טכנולוגיות תאי גזע5850
ThiazovivinTocris Bioscience3845
  AccutaseGibco או Millipore גיבקו A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ תוסףתזונה Thermofisher Scientific31980030
תערובת התזונה F-12 של Ham, GlutaMAX ו-trade; תוסףThermofisher Scientific31765035
KOSR, תחליף סרום נוקאאוטThermofisher Scientific10828028
פולי (אלכוהול ויניל)Sigma-Aldrich   P8136
טרנספרין סיגמא-אולדריץ'   
תרכיז שומנים מוגדר כימיתThermofisher Scientific11905031
Human ActivinR& D338-AC
CHIR99201Tocris4423
PI103Tocris2930/1
Human FGF2R& D233-FB
DM3189Tocris6053/10
A83-01Tocris2939/10
Human BMP4R& D314-BP
C59Tocris5148
TTNPBTocris0761/10
ForskolinTocris1099/10
Oncostatin MR& D295-OM
DexamethasoneTocris1126
Ro4929097Selleck ChemS1575
AA2PCayman chemicals16457
אינסולין רקומביננטי אנושיסיגמא-אולדריץ'   ברקוד 11061-68-0
10652202001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsLiver Cell DifferentiationHepatocyte like CellsDevelopmental Signaling PathwaysSmall Molecules Growth FactorsSerum free Culture MediumLiver Bud ProgenitorsDay 6 DifferentiationDay 18 DifferentiationPVA Stock Preparation

Related Articles