מאמר שיטה

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

DOI:

10.3791/58981

⸱

25 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, אנדוציטוזה ופיתוח. השירות של האורגניזם תלויה הכדאיות של הנדסה גנטית. כאן, אנו מציגים שיטות transfect תאים Dictyostelium discoideum להתגבר על המגבלות הקיימות של תאים culturing בתקשורת נוזלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל מסקרן לחקר תהליכי התמיינות תאים במהלך הפיתוח, התא איתות ושאלות ביולוגיה תאית חשובים אחרים. בטכנולוגיות הזמינות לתמרן גנטית Dictyostelium תאים הם מפותח. Transfections יכול להתבצע באמצעות סמנים שונים לבחירה, סמן מחדש רכיבה על אופניים, כולל רקומבינציה הומולוגית מוטגנזה מכוונת insertional. זה נתמך על ידי הגנום המבואר היטב. עם זאת, גישות אלה ממוטבים עבור שורות תאים axenic גדל בתרבויות נוזלי, קשה להחיל על תאים פראי-סוג הלא-axenic, אשר ניזונים רק חיידקים. מוטציות הנוכחים זנים axenic להפריע Ras איתות, גרימת macropinocytosis מוגזמת הדרושים עבור האכלה, ולפגוע נדידת תאים, אשר מבלבל את הפרשנות של אותות וניסויים כימוטקסיס של זנים אלה. ניסיונות קודמות לתמרן גנטית התאים הלא-axenic יש חסרה ויעילות ההליכים הנדרשים ניסיוני מורכבים. פיתחנו פרוטוקול תרביות תאים פשוטים זה, בפעם הראשונה, מתגבר על מגבלות אלה. אלה סדרה של שיפורים גדולים גנטיקה מולקולרית Dictyostelium מאפשרים פראי-סוג התאים להיות מתומרן כמו זנים מעבדה סטנדרטיים. בנוסף היתרונות לימוד תהליכי איתות, תנועתיות תקינה, מוטציות לשבש צמיחה מבוססי macropinocytosis עכשיו ניתן לבודד בקלות. יתר על כן, שזרימת העבודה כולו תרביות תאים מאוד מואץ, עם תאים רקומביננטי, כי יכול להיווצר בתוך ימים ולא שבועות. יתרון נוסף הוא כי הגנטיקה המולקולרית עוד יותר ניתן לבצע עם פראי-סוג טרי מבודד Dictyostelium דגימות מן הסביבה. זה יכול לעזור כדי להרחיב את היקף גישות בשימוש באזורים אלה מחקר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסוג Dictyostelium הם אדמת-המגורים אמבה חברתית הניזונים בעיקר חיידקים. להציב שלקרוא Amoebozoa, מספר רב של מינים היה מבודד זה ניתן לקבץ ארבע clades שונים1. המין Dictyostelium discoideum (discoideum ד) הפך אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים ו- phagocytosis. כדי לשלוט לתקנן תנאים ניסיוני, axenic תא קווים פותחו מסוגלים לגדול מורכבים או מוגדר בינוני נוזלי בהיעדרו של חיידקים2. חשיבות מיוחדת Ax2, Ax3, Ax4 זנים, אשר היו כל שנוצרו בשנות ה-70, בסופו של דבר נגזר פרוע אחד לבודד NC43. כלים עבור הנדסה גנטית פותחו בזנים אלו axenic, וכתוצאה מכך הסתרה באמצעות הראשון שפורסם בשנת 19874,5. הפרוטוקולים היו נוספים שפותחו באופן מיטבי לשימוש תחת תנאים axenic6,7.

הסתגלות של פרוטוקולים אלה כדי פראי-סוג ד discoideum זנים שלא מסוגלים לגדול מרק נוזלי נוסו על ידי מספר מעבדות. עם זאת, זה לא הפך לגמרי מוצלח מאז הפרוטוקולים תרביות תאים מורכבים, חוסר יעילות, בין היתר בשל הקיבולת של החיידק לפעול כמו כיור עבור ריאגנטים סלקטיבי8,9. כתוצאה מכך, נתונים למעשה כל מולקולרית ד discoideum נובע צאצאי בידוד פראי-סוג יחיד. רצינו להתגבר על מגבלה זו ולפתח שיטה גנטית לשנות תאים discoideum ד עצמאית של היכולת שלהם גדלים במדיום נוזלי. ניתן להסביר את הצורך של השיטה על ידי התצפית כי היא ההנחה היתה בעבר מוטציות המאפשר צמיחה axenic היו בעיקר נייטרלי, לא לפגום פיזיולוגיה של התא. סברה נכונה רק בחלקה. באופן כללי, יש שני הבדלים בולטים; ראשית, בין השונה בודדו זנים axenic, ושנית, כאשר אלה זנים axenic לעומת מבודד פרא-axenic8,9.

אולי הגורם הקריטי ביותר הוא מפתח axenic הגן, גרזןB, שזוהה לאחרונה כמו RasGAP NF1. הפונקציה העיקרית של NF1 בתור RasGAP הוא לרסן את הפעילות ראס3. המחיקה של האנזים ב כל זני axenic מוביל עודף פעילות ראס בא לידי ביטוי בכינויו היווצרות של טלאים גדולים ראס הפעיל. הטלאים ראס מוגדלת לגרום להצטברות של PIP3 קרום הפלזמה. אלה כתמים המופיעים מקרי של PIP3 וראס פעיל הם תבנית להיווצרות קפלים מעגלית בסופו של דבר נסגר, מוביל את היווצרות של macropinosomes10. התוצאה היא עלייה מוגזמת macropinocytic פעילות. Macropinocytosis הוא תהליך מונחה אקטין. תחרות cytoskeletal מרכיבי היווצרות של macropinosomes או pseudopods היא התוצאה. השפעתה על התנהגות תא באה לידי ביטוי כמעט מוחלט למניעת כימוטקסיס של תאי צמח חומצה פולית11. המדבקות PIP3 מוגדל מסיבית הן מאוד עקשן. אפילו בתאים מורעבים, המדבקות PIP3 נשארים, יכול להתפרש בטעות כשייך pseudopods, אשר יכול לגרום לבעיות לפרש מחקרים על כימוטקסיס למחנה.

במקרים מסוימים, המוטציה NF1 שימושית השפעול. זה מוביל אותנו מניע השני לפיתוח שיטה תקנים עבור מבוגר bacterially discoideum ד תאים, מאז העלייה בשיעור macropinocytosis הופך תאים axenic יקר עבור חוקרים ההיבטים הבסיסיים של תהליך זה,12 . עם זאת, מוטציה בגנים הדרושים עבור macropinocytosis, כגון Ras ו- PI3-kinases10, יש כמעט ביטל צמיחה axenic, ולכן יש צורך לתפעל את התאים האלה דרך גידול על חיידקים. סיבה נוספת שמעבדת המבוססת על חיידקים transfections יקר היא השימוש הגובר Dictyostelids לחקור שאלות באבולוציה של13,cellularity מרובה14,15,זיהוי משפחה16, התנהגות הסלולר אלטרואיסטי, אשר תלויים בעיקר השימוש פראי-סוג טרי מבודד מבודד17. כל הזכיר שטחי מחקר ניתן להקל על ידי שיטות יעילות עבור הנדסה גנטית של מבודד פרא, אשר אי-axenic לא צומחים בתוך מרק נוזלי.

הפרוטוקולים שלנו מאפשרים להתגבר על המגבלות המתואר. יחדיו, את האפשרות של ביצוע מניפולציות גנטיות עם בקטריאלי גדל discoideum ד תאים חסימות הטבות עבור כל החוקרים Dictyostelium , אפילו אם זה רק מהירות מוגברת של תהליך הבחירה בשל מהר יותר הצמיחה של אמבה (4 שעות זמן ההכפלה) על חיידקים לעומת צמיחה בתקשורת axenic (10 h הכפלת זמן).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תאים וחומרים

  1. הכנת מאגר SorMC
    1. הכן 100 מ של 100 x SorMC (מאגר סורנסן כולל MgCl2 CaCl2) מאגר על ידי המסת 20.36 g של ח'2PO4 (15 מ מ) ו- g 5.47 נה2HPO4·7 H2O (2 מ מ) ב- 100 מ של ddH2O מים. מערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר (RT) ולהביא את אמצעי האחסון 100 מ ב- dH2O.
      הערה: המאגר וכתוצאה מכך יש pH של 6 והוא אינו חייב עוד יותר התאמת.
    2. לייצר 1000 מ ל 1 x עובד פתרון ב- ddH2O. להוסיף 50 µL כל של MgCl2 CaCl2 כדי להשיג ריכוזים הסופי של 50 מיקרומטר. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: תמיד מוסיפים MgCl2 CaCl2 אל המאגר 1 x כדי להימנע משקעים של המלחים 100 x פתרון מניות.
    3. לחלופין, להכין KK2 מאגר (2.2 גר'2פו ח'4 ו- 0.7 g K2HPO4 1 ליטר של המאגר) בתוספת 50 מיקרומטר MgCl2 ו- 50 מיקרומטר CaCl2 (המכונה בזאת KK2MC). השתמש המאגר ברחבי במקום SorMC.
  2. הכנה של חיידקים כמקור מזון discoideum ד
    1. השתמש מושבה בודדת של ק' aerogenes , לחסן L 1 LB-בינוני (lysogeny מרק). השתמש בקבוקון 2 ל'. תן חיידקים לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-220 סל"ד.
      הערה: אם נדרשות כמויות גדולות של חיידקים, להשתמש במדיה עשירה יותר כמו 2xTY (שמרים לחלץ טריפטון בינוני) או בכי (מרק סופר אופטימלית) במקום ליברות. למקרה השימוש של חיידקים ק' aerogenes אסורה בשל מגבלות בטיחות, ניתן להשתמש במקום זאת BL21 e. coli .
    2. לקצור את התאים למחרת על ידי מסובב אותם למטה שני צינורות צנטריפוגה 500 מ"ל ב x ~ 6,600 g לחיידקים שטיפת מינימלית 20 פעם אחת עם 500 מ"ל SorMC מאגר.
    3. Resuspend בגדר ב- 20 מ של SorMC. בדוק את יתר600 (צפיפות אופטית על 600 ננומטר) באמצעות photometer של. לדלל עם המאגר אותו יתר600 של סביב 100.
      הערה: Aerogenes ק. חיידקים הם שקשה גלולה, אז במהירות יחסית גבוהה עבור מסתובב למטה החיידקים יש צורך למנוע אובדן של מזון חיידקים. הפתרון שיתקבל מניות חיידקי ניתן לאחסן עד 4 חודשים במקרר ב 4 ° C ולתחזק את השירות שלה כמקור מזון עבור discoideum ד. 1 ליטר של לילה ההשעיה ק' aerogenes גדל LB בינוני בדרך כלל מניבה 20 מיליליטר יתר600 של סביב 100.
      התראה: כדי להבטיח כי החיידק מוכן גידולי תעשייה של ק' aerogenes, לבצע את כל הצעדים ברדס.
  3. הכנת מאגר אלקטרופורציה H40
    1. להכין 100 מ של בופר, להמיס 0.952 גר' HEPES במים2O ddH ולהוסיף µL 100 MgCl2 פתרון 1 מ' מניות. להתאים את ה-pH 7 באמצעות קו עבור טיטור. לעקר את המאגר באמצעות מיקרומטר 0.22 מסנן או אוטוקלב. השתמש HEPES חומצה חינם לא מלח נתרן.
  4. לבצע הכנה פלסמיד ע פ הפרוטוקול של היצרן ושימוש ערכות לסכם את הטבלה של חומרים. השתמש את פלסמידים מסוכמים בטבלה1.
    הערה: האיכות של ה-DNA משמש תרביות תאים היא קריטית. הבחירה של transfectants discoideum ד גוברת על חיידקים יש דרישות ספציפיות של היזמים נהיגה בקלטת בחירה וביטוי (ראה דיון).
פלסמיד שםהתנגדות/בחירה של חיידקיםהתנגדות/בחירה ב- Dictyosteliumתג
הביטוי extrachromosomal פלסמידים
pDM1203AmpicilinG418לא
pDM1207AmpicilinG418N-מסוף GFP
pDM1208AmpicilinG418MCherry N-מסוף
pPI159AmpicilinG418MNeon N-מסוף
pPI437AmpicilinG418MScarlet N-מסוף
pPI54AmpicilinG418MTurquoise2 N-מסוף
pDM1209AmpicilinG418C-מסוף GFP
pDM1210AmpicilinG418MCherry ג-טרמינל
pPI143AmpicilinG418MNeon ג-טרמינל
pPI459AmpicilinG418MScarlet ג-טרמינל
pPI142AmpicilinG418MTurquoise2 ג-טרמינל
הסעות פלסמידים
pDM344Ampicilinלאלא
pDM1019AmpicilinלאN-מסוף GFP
pDM1018AmpicilinלאMCherry N-מסוף
pPI152AmpicilinלאMNeon N-מסוף
pPI418AmpicilinלאMScarlet N-מסוף
pPI150AmpicilinלאMTurquoise2 N-מסוף
pDM1021AmpicilinלאC-מסוף GFP
pDM1020AmpicilinלאMCherry ג-טרמינל
pPI153AmpicilinלאMNeon ג-טרמינל
pPI457AmpicilinלאMScarlet ג-טרמינל
pPI151AmpicilinלאMTurquoise2 ג-טרמינל
הביטוי extrachromosomal inducible פלסמידים
pDM1038AmpicilinHygromycinלא
pDM1047AmpicilinHygromycinN-מסוף GFP
pDM1046AmpicilinHygromycinMCherry N-מסוף
pPI450AmpicilinHygromycinMNeon N-מסוף
pPI452AmpicilinHygromycinMScarlet N-מסוף
pPI449AmpicilinHygromycinMTurquoise2 N-מסוף
pDM1049AmpicilinHygromycinC-מסוף GFP
pDM1048AmpicilinHygromycinMCherry ג-טרמינל
pPI470AmpicilinHygromycinMNeon ג-טרמינל
pPI460AmpicilinHygromycinMScarlet ג-טרמינל
pPI469AmpicilinHygromycinMTurquoise2 ג-טרמינל
act5 מבטחים מיקוד פלסמידים
pDM1501AmpicilinHygromycinלא
pDM1513AmpicilinHygromycinN-מסוף GFP
pDM1514AmpicilinHygromycinMCherry N-מסוף
pPI231AmpicilinHygromycinMNeon N-מסוף
pPI419AmpicilinHygromycinMScarlet N-מסוף
pPI228AmpicilinHygromycinMTurquoise2 N-מסוף
pDM1515AmpicilinHygromycinC-מסוף GFP
pDM1516AmpicilinHygromycinMCherry ג-טרמינל
pPI230AmpicilinHygromycinMNeon ג-טרמינל
pPI458AmpicilinHygromycinMScarlet ג-טרמינל
pPI229AmpicilinHygromycinMTurquoise2 ג-טרמינל
רמי ביטוי פלסמידים
pDM1220AmpicilinHygromycinלא
pDM1351AmpicilinHygromycinN-מסוף GFP
pDM1259AmpicilinHygromycinMCherry N-מסוף
pPI465AmpicilinHygromycinMNeon N-מסוף
pPI468AmpicilinHygromycinMScarlet N-מסוף
pPI466AmpicilinHygromycinMTurquoise2 N-מסוף
pDM1352AmpicilinHygromycinC-מסוף GFP
pDM1305AmpicilinHygromycinMCherry ג-טרמינל
pPI471AmpicilinHygromycinMNeon ג-טרמינל
pPI467AmpicilinHygromycinMScarlet ג-טרמינל
pPI472AmpicilinHygromycinMTurquoise2 ג-טרמינל
ממוקד מסגרת פלסמידים
pDM1355AmpicilinHygromycinC-מסוף GFP
pPI461AmpicilinHygromycinMCherry ג-טרמינל
pPI462AmpicilinHygromycinMNeon ג-טרמינל
pPI464AmpicilinHygromycinMScarlet ג-טרמינל
pPI463AmpicilinHygromycinMTurquoise2 ג-טרמינל
פלסמידים הנוק-אאוט
pDM1079AmpicilinBlasticidinלא
pDM1080AmpicilinNourseothricinלא
pDM1081AmpicilinHygromycinלא
pDM1082AmpicilinG418לא
CRE ביטוי פלסמידים
pDM1483AmpicilinNourseothricinלא
pDM1489AmpicilinHygromycinלא
pDM1488AmpicilinG418לא

טבלה 1: רשימת פלסמיד עבור transfections axenic.

  1. הגדרת התאים Dictyostelium עבור תרביות תאים
    1. לגדול ק' aerogenes הנהרות במדיום SM (עשירות בינוני) לילה במלון RT. תרבויות ניתן לאחסן עד 2 שבועות ב 4 º C.
    2. להוסיף כ-400 µL של ההשעייה חיידקי על צלחת אגר SM (peptone 10 גרם/ליטר; שמרים לחלץ 1 g/L; גלוקוז 10 גרם/ליטר; ח'2PO4 1.9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1.3 g/L; MgSO4 נטול מים 0.49 g/L; 1.7% אגר) ולהתפשט באופן שווה. קח לולאה סטרילי, לחסן עם תאים Dictyostelium . מורחים את התאים בקצה אחד של הצלחת.
    3. דגירה את הצלחת ב 22 מעלות צלזיוס במשך יומיים להבטיח אזורי צמיחה גדול מספיק עבור תרביות תאים.
      הערה: עבור זנים Dictyostelium לא להפוך את אזורי צמיחה גדולה (למשל, Ax3, DH1 או JH10), או עבור ניסויים לא מנוסים, להשתמש ניקוי לוחות במקום. לשם כך, בצע את ההוראות בשלבים 1.5.4 כדי 1.5.6.
    4. קח לולאה סטרילי, לחסן עם תאים Dictyostelium (כ 2-4 x 105 תאים). להעביר את התאים µL 800 של צפופה ק' aerogenes ההשעיה בתאים SM. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    5. העבר 400 µL, 200 µL, 100 µL ו- 50 µL על פלטות אגר SM טריים. להוסיף כל µL צלחת 400 של השעיה SM ק' aerogenes נוספים, נמרח בקלות, יבש.
    6. דגירה הלוחות ב 22 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים עד הלוחות הופכים לשקופים.
      הערה: בשל קצב צמיחה מהיר יותר שלהם, החיידק לייצר בתחילה מדשאה confluent, amoebae לאחר מכן "נקה" את הצלחת של החיידקים. הזמן הנדרש עבור תהליך זה יכול להשתנות בהתאם רקע המתח ואת היכולת של מוטציות בתאים גדלים על חיידקים.

2. תקנים של תאים Dictyostelium בהתבסס על הבחירה חיידקי

figure-protocol-1
איור 1 : תהליך עבודה תרביות תאים שגודלו חיידקים תאים Dictyostelium . השלבים עבור תרביות תאים מפורטים כדלקמן. לגדל תאים discoideum ד על צלחת SM עם חיידקים ק' aerogenes (אדום). קציר תאים רק מהחזית האכלה (ירוק), הימנעות התאים כבר מפתחים (ירוק כהה). לשטוף את התאים ב- H40. Resuspend לתאים צפיפות הסופי של 2-4 x 107 תאים למ"ל. מערבבים התליה תא עם 1-2 µg של ה-DNA. להעביר את התערובת cuvette אלקטרופורציה ותאי דופק. העבר את התאים ישירות לאחר אלקטרופורציה מאכל עם SorMC וחיידקים. לאפשר את התאים להתאושש במשך 5 שעות לפני הוספת הסמן לבחירה. עבור extrachromosomal פלסמידים, הוסף את הבחירה ישירות לצלחת. Transfectants הם בדרך כלל גלויים לאחר ~ 2 ימים. עבור בונה ליניארית אשר מטרתם לשילוב יחיד לתוך הגנום, להגדיר שלושה דילולים כמצוין ולהוסיף את הבחירה. חיידקים נלקחים מן ה OD600 = פתרון 100 מניות. מערבבים היטב את הצינורות ולהעביר את התאים לוחות תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה. השתמש שתי צלחות לכל דילול. פיפטה 150 µL תא השעיה בכל טוב. זה לוקח כ- 5 ימים עד מושבות חזק גלויים. הבארות אדום להראות דוגמה של הסכום הרגיל של תאים בהצלחה טרנספורמציה שהושג (לוח העליון שונה הפרסום הקודם22). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. כדי להכין צלחות עם השעיה ק' aerogenes , להוסיף 10 מ ל SorMC מאגר המכיל חיידקים ק' aerogenes צפיפות של יתר600 = 2 (להוסיף 200 µL של ה OD מוכן600 = 100 ק' aerogenes מניות פתרון הרצוי ריכוז חיידקים) לתוך 10 ס מ תרביות רקמה מטופלים פטרי.
    הערה: הצלחת הזו מאוחר יותר יש צורך לטפח את transfected תאים discoideum ד . לחלופין, ניתן להשתמש צלחת 6-ובכן רקמות-תרבות. במקרה של תרביות תאים של פלסמידים extrachromosomal, הצלחת 6-ובכן רקמות-תרבות יעיל יותר משאבים. השתמש מ 2 ל SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) השעיה לכל טוב.
  2. הכנה של תאים Dictyostelium
    1. באמצעות לולאה חיסון חד פעמיות 10 µL, לגרד תאים אזורי צמיחה (כ 3 ס מ) של לוח תרבות (קצה האזור שנוקה) או ניקוי צלחת. העברת תאים לתוך צינור 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מאגר H40 קר כקרח.
      הערה: העיתוי של קציר תאים ניקוי לוחות חיוני. הסיכון של מניב חלקית לקצירת תשואות מוקדם מדי מעט מדי כמות תאים, במטע מגביר מאוחר פיתחו תאים.
    2. לשטוף את התאים על ידי ספינינג למטה למשך 2 דקות ב 1,000 x g או פלאש-ספינינג 2 s ב x 10,000 ג'י. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאים במאגר H40 כדי צפיפות הסופי של 2-4 x 107 תאים למ"ל. שמור את התאים קר במהלך ההליך כולו תרביות תאים. השתמש slurry קרח-מים כדי להבטיח מגע ישיר של צינורות, קרח.
  3. אלקטרופורציה
    1. להוסיף 100 µL של תאים צינור עם 1-2 µg של ה-DNA. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    2. להעביר את התערובת תא/DNA cuvette אלקטרופורציה טרום מקורר (מרווח 2 מ מ).
    3. . דופק את התאים באמצעות ההגדרות הבאות כיכר-גל: 350 V, 8 מילי-שניות, פולסים 2 ו 1 s דופק מרווח.
      הערה: אל תוסיף יותר מ 2 µg של ה-DNA. סכומים גבוהים יותר הם רעילים לתאים ולהקטין תרביות תאים יעילות. סה כ הוסיף נפח ה-DNA לא יעלה על 5 µL.
    4. להעביר תאים מיד מוקדם יותר מוכן 10 ס צלחת פטרי עם ק' aerogenes SorMC ולאפשר את התאים להתאושש במשך 5 שעות.
      הערה: בדוק את התאים בצלוחית הפטרי תחת מיקרוסקופ הפוכה. התאים יופיעו עגול ישירות לאחר אלקטרופורציה אך יחזיר את צורתם amoeboid לאחר כ- 30 דקות, כאשר יש להם מספיק זמן כדי לצרף כראוי אל פני השטח.
  4. מבחר transfectants: תלוי אם תרביות תאים מיועדת ליצירת של הנוק-אאוט, טוק-in, או act5 טוק-in, או כדי לבטא חלבון כתב פלורסנט מ פלסמיד extrachromosomal, לבצע את תהליך הבחירה באחד להלן תיאר שיטות.
    הערה: בניגוד תאים בוגרים axenically, תאים bacterially מבוגר הם עמידים מאוד בפני blasticidin. בחירה, לכן, תמיד מתבצעת באמצעות G418 או hygromycin (ראה דיון).
    1. אאוט טוק, טוק-in ו act5 טוק-in
      1. לנתק את התאים בזהירות צלחת פטרי יכפו שוב ושוב את הנוזל מן פיפטה על גבי המשטח.
      2. הגדרת שלוש דילולים ההשעיה SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) ולהוסיף את הסוכן סלקטיבי בהתאם ההתנגדות בשימוש (ראה איור 1).
      3. נמוך דילול: מערבבים 9 מ של השעיה תא עם 20.4 מ של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      4. דילול בינוני: מערבבים µL 900 של השעיה תא עם mL 28.5 של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      5. דילול גבוה: מערבבים µL 90 של השעיה תא עם mL. 29.3 של SorMC ו- 600 µL של פתרון מניות ק' aerogenes .
      6. להוסיף 30 µL של סמן לבחירה (100 x פתרון מניות).
      7. הפץ את דילולים מוכן תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה לוחות pipetting µL 150 של השעיה תא לבאר כל.
        הערה: הליך זה נועד שיבוטים יחיד מסך מאשר אוכלוסיות. הבחירה לוקח בערך 5-7 ימים, בהתאם הבונה בשימוש.
    2. פלסמידים extrachromosomal
      1. הוספת הסמן לבחירה ישירות לצלחת 10 מ"ל (ראה איור 1).
        הערה: יש צורך להגדיר דילולים, מכיוון שאין שום רצון לאוכלוסיות המשובטים. תהליך הבחירה עבור פלסמידים extrachromosomal נובע מהר למספרים העתק גבוהה, נוכח בתאים discoideum ד . Transfectants ניתן לצפות לאחר 32 h כדי 2 ימים.
        התראה: אנטיביוטיקה משמש סמן לבחירה רעילים. ללבוש כפפות.
  5. מסך שיבוטים שהושג עבור tranfectants חיובי. עבור נסיונות מעלף או בטוק, בצע את ההוראות בשלב 2.5.1. בדוק להצלחה תקנים עבור פלסמידים extrachromosomal תוך שימוש בהוראות בשלב 2.5.2.
    1. אאוט. טוק, טוק-in של act5 טוק-in, לבצע את המסך הראשוני באמצעות PCR כדי לאשר שילוב הבונה לוקוס גנומית הנכון.
      הערה: כדי להגדיל את הסבירות של אוכלוסיות המשובטים, שימוש אפשרי דילול הגבוהה ביותר המניבה transfectants לאחר הבחירה. המטרה עבור הצלחות כי הם מקסימום שליש בארות הכבושה.
      1. כדי להרחיב את אוכלוסיות המשובטים, העברה שיבוטים שצמחו לאחר הבחירה מהצלחת 96-ובכן-תרביות רקמה לתוך צלחת 12-ובכן רקמות-תרבות לגדול מספיק תאים עבור הבידוד של דנ א גנומי. לספק כל טוב עם 1 מ ל SorMC ק aerogenes (OD600 = 2) וסמן לבחירה טריים.
        הערה: 1 יום מספיקה בדרך כלל לקבל confluent מתאים היטב עבור בידוד של דנ א.
      2. כדי לבצע מיני בידוד דנ א גנומי, לקצור תאי של באר confluent ובידוד הדנ א באמצעות ערכת חילוץ DNA מיני ההוראות של היצרן.
      3. ה-DNA גנומי מבודד יחד עם תחל מתאימים ולהשתמש Taq-פולימראז (ראה טבלה של חומרים) עבור integrands חיובי מסך ה-PCR.
        הערה: לאחר אישור של השתלבות חיובית מיקומה גנומית נכונה, לבצע ניתוח תספיג דנ א. הדבר מבטיח ביטחון רב יותר לא התרחשו אירועים נוספים ההכנסה באזורים גנומית לא ספציפי.
    2. כתב פלורסנט חלבונים, חזותית לזהות תאים פלורסנט חיובי, לבדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. לחלופין, לבצע את תספיג חלבון עם נוגדנים מתאימים לזיהוי הביוכימי.
תוכנית ה-PCR
שלבטמפרטורהזמן
דנטורציה הראשונית94 ° C30 s
מחזורים94 ° C15-30 s
42 ° C15-60 s
68 מעלות צלזיוס1 דקות/kb
סיומת הסופי68 מעלות צלזיוס5 דקות
. תחזיק4-10 ° C
תגובת הרכב
רכיבתגובה 25 μLריכוז סופי
פריימר לפנים 10 מיקרומטר0.5 ΜL0.2 ΜM
פריימר הפוכה 10 מיקרומטר0.5 ΜL0.2 ΜM
תבנית ה-DNAמשתנה (ca. 5 µL)< 1,000 ng
2 x מיקס מאסטר עם מאגר סטנדרטי כולל פולימראז (ראה טבלה של חומרים)12.5 ΜL1 x
נוקלאז ללא מיםכדי 25 µL< 1,000 ng

בטבלה 2: קומפוזיציה התוכנית, דוגמת ה-PCR עבור ההגברה של Discoideum ד הדנ א.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלסמידים extrachromosomal משמשים כתב מחקרים, אשר שואפים לזהות הלוקליזציה של חלבונים מסוימים בתוך תא או שינויי המבנה התאי של תאים מוטציה. עבור גישות רבות, כגון ניטור של מחזור התא, זה הכרחי להביע את שני הכתבים באותו זמן. . זה עכשיו אפשרי באמצעות מערכת פלסמיד extrachromosomal שלנו כתב כפול (טבלה 1). יום 1, התאים היו transfected לפני הוספת הסמן לבחירה G418 לאחר 5 שעות (איור 1). לדוגמה, NC4, DdB, Ax2 ו מבודד פראי נגזר באופן עצמאי V12M2 ו- WS2162 (משלים טבלה 1) היו transfected עם pPI289 פלסמיד, שמקודד עבור GFP-TubulinA, סמן microtubules, mCherry-PCNA, חלבון זה משמש לניטור מחזור התא (איור 2א). לאחר 32 h, נצפו התאים במיקרוסקופ. הרוב המכריע של תאי ביטא שני חלבונים פיוז'ן התווית על-ידי פלורסנט, עקבי עם הקודם דוחות את הביטוי הזה של שני עיתונאים מכל לאותו פלסמיד מראה דומה הביטוי רמות, וזה כמעט בלתי אפשרי בעת שימוש בשני פלסמידים שונים 18,19. תא נציג עבור כל קו תא (NC4, DdB, Ax2, V12M2 ו WS2162) המבטאת הכתב כפול הרצוי מוצגת באיור 2B. היעילות תרביות תאים מסוכמות באיור2 ג. שורות תאים נגזר NC4 להראות את היעילות תרביות תאים הטוב ביותר. עם זאת, עבור שורות תאים V12M2 ו- WS2162, מספר גבוה במידה ניכרת של transfectants היה מתקבל.

figure-results-1
איור 2 : ביטוי פלסמיד extrachromosomal. (א) Extrachromosomal פלסמידים הן ישירות transfected בצורה מעגלית. כדוגמה, pPI289 כתב כפול מוצג. האתרים MIV העמותותמצביעות על ההכנסה של הכתבת השנייה לתוך פלסמיד הביטוי extrachromosomal. (B) Z-ההקרנה של תא נציג לבטא GFP-TubulinA (cytoplasmic) ו- mCherry-PCNA (בעיקר גרעינית) עבור חמישה תאים פראי-סוג שונות קווים המשמשים (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) תרביות תאים יעילות עבור שורות תאים חמש בתמונה (ב') חושבו. המוצג הוא הממוצע של שני ניסויים. קווי שגיאה לציין ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

השתלבותם של הווקטור מיקוד לוקוס גנומית שצוין הוא יותר מאתגרת ודורשת ניתוח זהיר יותר של קו התא שנוצר. איור 3, נעשה ניסיון של act5- mCherry "קי" NC4. ראשית, פלסמיד חייב להיות לליניארית להגדיל את תדירות אירועי רקומבינציה. בעקבות תרביות תאים. בשביל זה, pDM1514 פלסמיד נחתך עם העמותותMIV. שתי להקות מתקבלים לאחר שהתמודדו digest ג'ל agarose. הלהקה 4127 bp מכיל הבונה הרצוי (איור 3). תרביות תאים, ה-DNA מתעכל חייב להיות מופק הג'ל, לטהר על-ידי ערכת חילוץ ג'ל ההוראות של היצרן.

figure-results-2
איור 3 : הכנת act5 טוק-ב, ה-DNA על תרביות תאים. דוגמה של השימוש של תוספת פועלים5 לדפוק pDM1514 פלסמיד מוצג. השלבים להכנה מפורטים כדלקמן. (א) לפני אלקטרופורציה, linearize את פלסמיד באמצעות האתרים MIV המצוין של העמותות. (ב, ג) להפעיל את פלסמיד לחתוך על ג'ל agarose עד שתי הלהקות הצפוי מופרדים כראוי. לגזור את הלהקה bp 4127 המכיל הזרועות רקומבינציה, mCherry וההתנגדות-הקלטת, ג'ל לחלץ את ה-DNA. ה-DNA מוכן כעת על תרביות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ה-DNA מטוהרים שימש תרביות תאים של תאי NC4. אחרי 5-6 ימי בחירה, התקבלו שיבוטים. תרביות תאים נציג היעילות ואת כמות חיובית שיבוטים מזוהה עבור מספר act5 טוק-אין נסיונות מסוכמים בטבלה3. שני שכפולים של תרביות תאים NC4 באופן אקראי, וכיום נותחו על ידי ה-PCR (איור 4א), והראתה שני הדפוסים הלהקה החזוי הצפוי של יישום טוק-in ואומת היו עוד יותר עם ניתוח תספיג דנ א כדי להבטיח שילוב יחיד אירוע של הבונה לתוך הגנום20. האבן החשופה מציג שילוב יחיד ברור מיקומה הרצוי act5 (איור 4B). הקו תא NC4::act5-mCherry שנוצר כעת ניתן להשתמש בניסויים.

figure-results-3
איור 4 : אימות של act5- mCherry KIs ב- NC4. (א) הערכה ובקרה מותני לשם האימות של שילובי חיובי לתוך לוקוס act5 . צבעי בסיס המצוין שימשו כדי לנתח שני שכפולים עצמאית ועל ההורה. שני שכפולים להראות הלהקות הצפוי של התנגדות-מגרות, במורד הזרם (P1) או פריימר נגד הזרם (P2), אשר אינם נוכח המתח הורים. השילוב פריימר (P1/P2) מאשרת את השילוב הנכון של קלטת mCherry והתנגדות לתוך מיקומה act5 . NC4 פראי-סוג מראה הלהקה bp 2800 הצפויה, בעוד שני שכפולים קי חוסר הלהקה הזאת ולהציג במקום מוצר ה-PCR על 1400 בסיסים גדולים יותר. סכימת (B) כדי להפוך את תקציר הגבלה בשימוש תספיג דנ א. שני שכפולים טוק-in הראה הלהקה bp 3400 קטנים יותר, אשר הוא התוצאה של שילוב הבונה לוקוס פועלים5, במיוחד נוספים Bclאני לאתר הקלטת ההתנגדות hygromycin. פראי-סוג הפקד מציג kb 5.8 צפויות הנובעות שני ממוקם במורד הזרם Bclאני אתרים. האבן החשופה שנחתכו, משולבים עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לבנות יישוב לתוך מיקומה act5פלסמיד שםמספר בארות כבושמספר שיבוטים בדקשיבוטים חיובישיבוטים הנכון (%)זן Dictyostelium בשימושתרביות תאים יעילות (transfectants / עונה 2 פרק 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherrypPI22677114.2AX23.5 x 10 ^-6
LifeAct-GFPpPI2271212541.6AX26 x 10 ^-6
GFPpDM151333266.6AX21.5 x 10 ^-6
mCherrypDM151433133.3AX21.5 x 10 ^-6
GFPpDM1513669555.5AX23.3 x 10 ^-5
mCherrypDM1514221121083.3AX21.1 x 10 ^-4
ויזת עבודה H2B-mCherrypPI42033133.3AX21.5 x 10 ^-6
ויזת עבודה H2B-mCherrypPI42077685.7AX23.5 x 10 ^-6
mCherrypDM15141010770DdB5 x 10 ^-6
mCherrypDM1514240121191.6DdB1.2 x 10 ^-4
mCherrypDM15143201212100NC41.6 x 10 ^-4

טבלה 3: תקנים היעילות ואת הכמות השיג transfectants חיובי עבור הדור של act5 KIs ברקעים זן שונה 22 .

מיקומה פועלים5 מציע ביטוי יחסית הומוגנית של הכתב משולבת21. התאים NC4::act5-mCherry שנוצר אפשר לערבב ניסויים כדי לבצע עם act5 טוק-in אחרים באמצעות חלבון שונה פלורסנט כגון ה-GFP. כדי להדגיש את היתרון הגדול של שיטה זו, מוצגים ניסויים ערבוב עם Ax2::act5-GFP . בשל חוסר היכולת transfect-axenic פראי-סוג תאים, סוג זה של גישה לא ניתן היה לבצע קודם. מיקס ניסויים הם כלי חשוב לנתח בהתנהגות התא, כי הם מאפשרים השוואה ישירה בין שורות תאים שונים חווה ניסיונית בתנאים זהים. NC4 תאים גדלים מהר יותר על מדשאות חיידקי מאשר Ax2 תאים (איור 5א). זה יכול להיות בגלל קיבולת גבוהה יותר כדי phagocytose חיידקים או שיפור היכולת להעביר ולהראות כימוטקסיס לכיוון מקור מזון. שימוש assay כימוטקסיס של חומצה פולית תת אגר, השוואה ישירה של אוכלוסייה של NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP בוצעה, מראה כי NC4::act5-mCherry הם הרבה יותר יעיל בחומצה פולית חישה. לאחר 4 שעות, יותר תאים NC4::act5-mCherry היו מסוגלים לזחול מתחת agarose מ- Ax2::act5-GFP תאים (איור 5B). ניתוח מדדים סטנדרטיים של כימוטקסיס עבור התאים נודדים תחת agarose גילה כי תאים NC4::act5-mCherry היו יותר מהר, הראו תגובה חזקה יותר chemotactic מאשר Ax2::act5-GFP תאים (איור 5C-E ).

figure-results-4
איור 5 : שימוש פועלים5 קילו לניסויים מיקס כימוטקסיס מבוססת תמונה. (א) NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFP המביעות החלבון הניאון המצוין מ מיקומה פועלים5 נותחו על היכולת לגדול על הדשא חיידקי. אחרי ארבעה ימים, נמדדו הקוטר פלאק שהתעוררו כתוצאה תאי Dictyostelium מצופה בידוד. Non-axenic act5:: NC4 תאים להפוך הפלאק גדול יותר באופן משמעותי מאשר תאים Ax2::act5-GFP axenic (זאת אומרת ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 3, גודל בר 5 מ מ). (B) עבור השימוש כימוטקסיס חומצה פולית תחת-agarose assay22 להשוות ישירות את היכולות chemotactic של NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFP בשימוש (א), חיידקים-גדל amoebae של שני זנים מעורבים על יחס 50: 50. תאים הורשו לזחול מתחת agarose. לאחר 4 שעות, התאים היו מעביר את המילוי ההדרגתי חומצה פולית היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר מכן נקבע את מספר תאי NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP . תאים NC4::act5-mCherry היו יותר יעיל בהערכת חישה חומצה פולית. על יותר 10-fold NC4::act5-mCherry נמצאו תאים בהשוואה Ax2::act5-GFP תאים (זאת אומרת ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 6, סולם בר 100 מיקרומטר). (C, D) התאים צולמו במשך 60 דקות, אינדקס chemotactic ומהירות שלהם חושבו. לאחר מיון מוקדם של התאים מגיבים ביותר chemotactically (רק אלה אשר נדד תחת agarose), Ax2::act5-GFP תאים הראה ערכים נמוכים יותר עבור מהירות התא והן כימוטקסיס. תאים חמישים לשורה תא נותחו. (חציון ± SD, * 0.01 < p, n = 3). (E) הרצועות של NC4::act5-mCherry , Ax2::act5-GFPact5 טוק-in מותוות מעל 60 דקות, מציג את התנועה מכוונת יותר לכיוון המקור chemoattractent של תאי NC4::act5-mCherry (חציון ± SD, * * * 0.0001 < p, n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הקווים טוק-in תא act5 יכול לשמש גם עבור cytometry זרימה. כמו עם גידול על חיידקים, ישנם הבדלים מהותיים בהתפתחות בין זנים axenic בר-axenic-סוגים. לאחר פיתוח, הגופים fruiting NC4 תאים גדולים כ פעמיים כמו אלה נגזרים מתאי Ax2. אם התאים מעורבבים, גוף fruiting בגודל ביניים מתקבל. כדי לנתח את התרומה של שני הקווים תא יותר באופן כמותי, שימש cytometry זרימה. ניתוחים אלה הראו בבירור כי הגופים fruiting בגודל בינוני בשל רמות שונות של התרומה של שתי שורות תאים. בזמן NC4::act5-mCherry תאים מורכב על 75% של נבגים נמדד, Ax2::act5-GFP תרם רק 25%, חושף יתרון כושר פוטנציאליים עבור זנים שאינם axenic (איור 6). מאז הניתוח אינו מפקח על האוכלוסייה תא ' גבעול ', קיימות שתי אפשרויות להסביר את חוסר האיזון בהתפתחות בין Ax2 NC4. אפשרות אחת היא כי תאים Ax2 לתרום בעיקר האוכלוסייה תא ' גבעול ', ולא נכנס האוכלוסייה תא נבג. לחלופין, יותר NC4 תאים רשאים להיכנס מחזור התפתחותית, עם Ax2 יחסית מושהית, והם כתוצאה מכך אין אפשרות לתרום מכלול של גוף fruiting. האפשרות transfect-axenic פראי-סוג תאים נוספים מפתחת גישות אחרות, מפשטת במידה ניכרת את הליכי ניסיוני.

figure-results-5
איור 6: מעשה5 קילו לאפשר ניתוח של מיקס ניסויים באמצעות cytometry זרימה. (א) NC4::act5-mCherry ו- Ax2::act5-GFP פותחו בנפרד או בתערובת 50: 50 על פלטות אגר שאינם התזונתי. תאים NC4::act5-mCherry טופס גופות fruiting גדול יותר מאשר Ax2::act5-GFP. המיקס במקום מראה את גודל ביניים של (גודל בר 5 מ מ). מיקרוסקופ אור זריחה קונאפוקלית מרמזת על סכום גבוה יותר של NC4::act5-mCherry נבגים בראשיהם נבג נגזר מתערבב. (B) לכמת התבוננות זו, הכמויות של נבגים ב נבג שנקטפו ראשי מן הניסוי ערבוב ב (א) נותחו על ידי cytometry זרימה. כ-75% מתוך הנבגים שמקורם תאים NC4::act5-mCherry , רק ב-25% מתאי Ax2::act5-GFP . (ג) הפצה נציג של נבגים של שני הקווים התא המוצג פיזור cytometry זרימה. כ- 0.05% להראות חיובי mCherry ו- GFP אותות, מציע פיוז'ן parasexual תהליכים התרחשו או נבגי דבוקים אחד לשני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תא קורקע גנטיתמספר סימוכיןפורסם לפניסוג
AX2 (קה)DBS0235521בלומפילד et al., 2008פראי סוג
NC4 (S)בלומפילד et al., 2008פראי סוג
act5::mCherry 5 שיבוטNC4HM1912Paschke et al., 2018act5 טוק-
act5::GFP גומי 2AX2HM1930Paschke et al., 2018act5 טוק-
V12M2בלומפילד et al., 2008פראי סוג
WS2162בלומפילד et al., 2008פראי סוג

משלים טבלה 1: זנים שונים של Dictyostelium למד.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש הלא-axenic, פראי-סוג תאים Dictyostelium הוגבלה מאוד עד כה במחקר מולקולרי. השיטות הזמינות עבור הנדסה גנטית זנים אלה יש חסר אמינות, יעילות23, מניעת אימוץ כללי שלהם. החומרים המופקים והפרוטוקולים המובאת כאן יכול לשמש עבור כל זן discoideum ד עצמאית של יכולתו לגדול במדיום נוזלי. יצוין, כי פרוטוקול זה ממוטב עבור שורות תאים נגזר NC4. תרביות תאים יעילות עבור זנים טרי מבודד מן הטבע נבדלים NC4, כאשר הבחינו לפני מוצגות כאן8,V12M2, WS21629. התנאים אלקטרופורציה נראה בפרט יש השפעה ניכרת על היעילות תרביות תאים, מחייבים נוספים מיטוב עבור זנים מסוימים. באופן כללי, כמות מספקת של transfectants נצפו כל זני נבדקו עד כה, מראה כי שיטות אלה הם מעשי. מספר חיובי transfectants תוך שימוש NC4-derived זנים הוא גבוה יותר בהשוואה זנים אחרים-פראי-סוג הלא-axenic, אך בכל המקרים, מספר מספיק של transfectants מתקבלים כדי לאפשר לניסויים נוספים. זה, וגם את הפשטות של הפרוטוקול שלנו הוא שיפור משמעותי לעומת ניסיונות קודמת8,9.

פרוטוקולים אלה שאינם axenic חדש לכסות את כל נהלי גנטי ולהוסיף יתרונות נוספים, כיוון transfections יכול להתבצע במהירות וביעילות במקביל. ניתן להשיג שיבוטים חיובית בתוך ימים ולא שבועות, מאז גידול על חיידקים חצאים הזמן החטיבה. פלסמידים שהוקם גם לעבוד תחת התנאים axenic, יכול להיות בשימוש שגרתי תחת שני תנאים צמיחה, וזה עוד לקידום הזה methology22. כפי הוצג הפרוטוקול, פלסמיד משמש בחירה על חיידקים יש דרישות מיוחדות, חיוניות להצלחת תרביות תאים. בפרט, היזמים נהיגה הקלטות הביטוי והתנגדות חשובים עבור תקנים מוצלחת. יזם שמרבים להשתמש בו act6 (אקטין 6)24 נהיגה הקלטות התנגדות או ביטוי חסר יעילות כאשר התאים גדלים על חיידקים. במערכת שלנו פלסמיד, האמרגן פעיל ביותר act15 (אקטין 15) כונני קלטות כל ביטוי, בזמן הקלטות ההתנגדות נמצאים תחת השליטה של מקדם coA (coactosin A), שניהם אשר פעילים תחת תנאים axenic תאים גדל על חיידקים. דרישות עבור הביטוי של הכתב בונה כמו גם בטוק, הנוק-אאוט בונה את הצורך להשתמש הרפרטואר שלנו פלסמיד, אך למרבה הצער מגביל את השימוש וקטורים כבר יצרת שימוש זה האמרגן לא יעיל act6 .

מקדם היעילות הם קריטיים במיוחד עבור transfections תלויים אירוע יחיד אינטגרציה לתוך מיקומה גנומית הנכון. עקב השיפור שלנו של היזמים נהיגה בביטוי הגן ההתנגדות, מספיק חלבונים ההתנגדות מופק שילובים לוקוס בודד. הדאגה העיקרית הייתה העדפה של שילובי מרובים לתוך הגנום בעת שימוש hygromycin או G418 כמתואר. אין העדפה של שילובי מרובים נצפתה כה, כפי שדווח בעבר עבור בחירות G418 בעזרת מבוגר המקדם מערכות25. משמעות הדבר היא כי הן hygromycin ו- G418 הם סמנים לבחירה מתאימה לדור של נקי שירותי. טוק, טוק-חברה למרבה הצער, blasticidin סמן לבחירה לא עובד בתנאים שאינם axenic. זהו חיסרון גדול של השיטה שלנו, שכן בקלטת ההתנגדות blasticidin משמש באופן שגרתי כדי לייצר מעלף בונה ב discoideum ד. בונה זה נוצרו כבר עם קלטות ההתנגדות blasticidin צריך להיות rederived באמצעות אחד הסמנים ניתן לבחירה עביד. אפשרות אחרת כדי להתגבר על מגבלה זו היא לשלב את הוקמה לאחרונה axenic discoideum ד CRISPR טכנולוגיה עם פרוטוקול זה תרביות תאים26. הדור של המדריך מתאים, יחיד RNAs (sgRNAs) הוא פשוט יותר ומהירה יותר מאשר מחדש של המבנים הנוק-אאוט מוחלט. עבור כיוונים לעתיד, האפשרות של יצירת טוק מרובים-outs באמצעות CRISPR/Cas9 בשילוב עם פרוטוקול תרביות תאים זה מושך, עשוי לסלול את הדרך עבור חוקרים רבים בקהילה Dictyostelium . עם זאת, עבידות של המערכת הוקמה ביטוי ארעי משמש CRISPR/Cas9 axenic תאים בוגרים צריך בזהירות להיבדק.

Act5 טוק-אין המערכת הציג מציע מערכת אמינה ובטוחה אינטגרציה לדור של שורות תאים יציב ב discoideum ד, עם היתרון של אתרים דומים נוסדה בשנת אורגניזמים אחרים22. זה גם תלוי אירוע יחיד אינטגרציה הגנום, ומציע אפשרויות רבות עבור כיווני מחקר שונים. יזם act5 פעילה בחום ומבטיחה ביטוי הומוגנית כמעט27 עצמאית של התנאים הטיפוח. ניתן לשלב חלבונים כתב פלורסנט בקלות לוקוס זה מבטחים באמצעות של פלסמידים מיקוד מהונדסים. אפשרות זו שימושית, לדוגמה, למטרות מעקב תא, כפי שמוצג כאן ניסוי מיקס. התאים מראים השתנות מינימלית-לתא ביטוי, אשר יכול לסייע בתא אוטומטי מעקב. חשוב, החדרת רצף הרצוי לתוך מיקומה פועלים5 מופיע phenotypically נייטרלית28,29. כמו הביטוי אינו תלוי בסמן לבחירה כדי לשמור על ביטוי חלבון, כפי שניתן לראות integrants אקראית או שורות תאים וקטור מניבי extrachromosomal, מערכת act5 יכול להיות שימושי עבור חילוץ ניסויים, כמו גם. מאז הקווים תא הומוגנית, ניתן לנתח כל התאים. . זה לא אפשרי באמצעות פלסמיד extrachromosomal של הביטוי, בהם יש הטרוגניות ניכר בביטוי.

בנוסף שיפורים כלליים אלה עבור כל זנים, היכולת להשתמש הלא-axenic פראי-סוג תאים למחקר מולקולרית מאפשרת הערכה של ההשפעות של מוטציות שהצטברו זנים מעבדה העדכני. Rearrangements גנטי מרובים נמצאה מאז האימוץ של המתח Ax2 בשנת 1970, כפי שמוצג על ידי microarray שפורסמו בעבר ניתוחים26. סינתטי פנוטיפים שנצפו עקב הנוכחות של מוטציות אלו. לדוגמה, מוטנט שדווחה phg2 מציג אדהזיה ירד רקע זן אחד של מעבדה והצמדות מוגברת עוד3. נתונים סותרים כאלה עכשיו הקרניו לחזור על הניסוי בנימה אב קדמון משותף (במקרה זה, DdB). הכוח של גישה זו הוכח לאחרונה עבור30,רז GTPase קטן31.

היכולת לבצע ניסויים גנטיים בתוך כל זן discoideum ד מרחיב את הפוטנציאל של כיווני מחקר חדשים שתלויים השימוש מבודד פראי, ובפרט אלה מעורבים אבולוציה חברתית ותרבותית, זיהוי משפחה, מיניות מחזור22.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה למעבדה קיי עבור קלט לשיטה זו LMB מיקרוסקופ לזרום cytometry במתקני לתמיכה מדעיים וטכניים מעולים. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר רפואי מענק MC_U105115237 ר ר קיי, BBSRC (ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה) מענק BB/K009699/1 לקיי רבי רבי, לחקר הסרטן בבריטניה להעניק A15672 ר ה Insall, Wellcome אמון מלגת בכיר 202867/ת/16/Z ג'ונתן R צ'אב ולאחר MRC מימון (MC_U12266B) ליחידה אוניברסיטת LMCB MRC ב UCL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
אפנדורף מיקרוצנטריפוגות 5424/5424RThermoScientific05-400-002
Eppendorf 5702R צנטריפוגות עם A-4-38 דגם רוטורThermoScientific12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal CyclersSigma AldrichEP6331000025
Gene Pulser X Cell, כולל CE & מודולי PCBioRad1652660
ארון בטיחות פורונה - SCANLAFLabogene
BioPhotometer PlusEppendorf
CLSM 710Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo בינוניFormediumLF0501
Seakem GTG AgaroseLonza50071
Low EEO AgaroseBioGene300-200
מטוהר אגראוקסואידLP0028
מרק SMFormediumSMB0102
2x LB מרקFormediumLBD0102
<חזק>כימיקלים
SYBR בטוח DNA ג'ל כתםThermoScientificS33102
1 Kb Plus DNA סולםThermoScientific10787018
1 Kb סולם DNANEBN3232L
חומצה ללא HEPESסיגמא אולדריץ'/Merck391340 EMD
KH2PO4VWRP/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2OVWR10028-24-7
MgCl2 * 6 H2OSigma Aldrich/Merck5982 EMD
CaCl2 * 2 H2Oסיגמא אולדריץ'442909
חומצה פוליתסיגמא אולדריץ'F7876
KOHVWR26668.263
<חזק>תרבות
96 אשכול תרבית תאים באר, תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוך, קורנינג מטופל בתרבית רקמותמשולב3595
אשכול תרבית תאים 6 באר, תחתית שטוחה עם מכסה, תרבית רקמות מטופלתקורנינג משולבת3516
צלחת תרבית רקמות בסגנון 100 x 20 מ"מ, קורנינג מטופל בתרבית רקמותמשולב353003
50 מ"מ תחתית זכוכית Microwell צלחות מס' 1.5MatTek CorporationP50G-1.5-30-F
<חזק>אנטיביוטיקה
גנטיצין G418-סולפטGibco מאת Life Technologies11811-023
Hygromycin B זהבInvivoGenant-hg-1
<חזק>חומרים מתכלים נוספים
2 מ"מ קובטות אלקטרופורציה מרווחות, אלקטרודה ארוכהGeneflow LimitedE6-0062
10 ומיקרו; L לולאת חיסון, כחול 10 מיקרו ליטרThermoScientific129399
מפזר, בצורת L,גריינר סטרילי bio-one730190
Combitips מתקדם 5 מ"לEppendorf BIOPUR30089669
<חזק>ערכות
ZR פלסמיד Miniprep קלאסיZymoresearchD4016
DNA מהיר ערכת MiniprepZymoresearchD3025
ערכת שחזור DNA ZymocleanZymoresearchD40002
<אנזימים חזקים>
אנזימי הגבלהNEB
OneTaq 2X מאסטר מיקס עם מאגר סטנדרטיNEBM0482L
T4 DNA LigaseNEBM0202S
PrimeSTAR Max DNA פולימראזTakaraBioR045A

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75(2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809(2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471(2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294(2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים