הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59016

⸱

12 במרץ 2019

 , 
1Graduate Institute of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Anatomy, School of Medicine, Kaohsiung Medical University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, College of Medicine, National Cheng Kung University

במאמר זה

סיכום

ההורמון מופרש על ידי קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות החולדה הראשית תאי בלוטת יותרת הכליה. זה יכול להיות פלטפורמה במבחנה טוב עבור חוקרים את המנגנונים מהתרכובת עניין steroidogenesis בלוטת יותרת הכליה, ביוסינטזה השומנים.

תקציר

ההורמון מפריש קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. השיטה המתוארת כאן היא ההליך העיקרי עכברוש בתרבית תאים בלוטת יותרת הכליה, קשורים מבחני פונקציונלי (immunofluorescence צביעת של השומנים droplet הדם, כמו גם ניתוח corticosterone). בניגוד מודל ויוו, הווריאציות של interexperiments בתרבויות טפט יותרת הכליה הוא פחות ואת התנאי ניסיוני הוא קל לשלוט בהם. חוץ מזה, המקור של חולדות יציב גם יותר חיות אחרות, כמו שור אלה. ישנם גם שורות תאים אנושיים יותרת הכליה מספר (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, וכו ') יכול לשמש במחקרים בלוטת יותרת הכליה. עם זאת, ייצור הסטרואידים שורות אלה עדיין תושפע גורמים רבים, אשר כוללים מספר הרבה בסרום, מעבר מספר, חשבונאי/הפסד של גנים שונים, וכו '. פרט חסר 17α-hydroxylase, התרבות העיקרי של תאים adrenocortical חולדה היא טכניקה יותר טוב ונוח יותר עבור לימודי פיזיולוגיה של הכליה. לסיכום, תרבויות האדרנל החולדה הראשית יכולה להיות פלטפורמה במבחנה טוב לחוקרים לחקור את המנגנונים מהתרכובת של עניין במערכת בלוטת יותרת הכליה.

מבוא

המערכת האנדוקרינית אחראי על ויסות פעילות פיזיולוגית והומאוסטזיס1. יותרת הכליה ממוקם בקוטב הגולגולת של הכליות הן אחד האיברים האנדוקרינית הגדולות אשר מפרישים mineralocorticoids, glucocorticoids ו-2,אנדרוגן3. ישנם שני חלקים ברורים של בלוטת יותרת הכליה: קליפת המוח, לשד. קליפת יותרת הכליה מורכבת משלוש שכבות: את glomerulosa החיצוני של fasciculata ביניים, את reticularis הפנימי3. Glomerulosa zona הוא אתר מפרישים המקורי של אלדוסטרון, מינרלוקורטיקואידים, אשר מסייע להתפתחות reabsorbing יון נתרן ומים של הכליות3. Fasciculata zona מייצרת בעיקר לרמת הבסיס glucocorticoids נורמלי בתנאים פיזיולוגיים3. קורטיקוסטרואידים בחולדות, קורטיזול אצל בני אדם לפעול כדי לסייע לגוף להתמודד עם הלחץ על ידי ויסות גלוקוז בדם3. במידה מסוימת, הם יכולים לעכב תגובות דלקתיות, לווסת את המערכת החיסונית4,5. בניגוד יונקים אחרים, עכברים וחולדות אין reticularis zona פונקציונלי בשל היעדר ביטוי 17α-hydroxylase ב6,7בלוטת יותרת הכליה. לפיכך, האנדרנלין של עכברים וחולדות אין ההפרשה של סטרואידים C-19 יותרת הכליה (קורטיזול ואנדרוגנים האדרנל).

ראשי בתרבית תאים adrenocortical הוכחו להיות שימושי עבור חוקרים מנגנוני שליטה על פיזיולוגיה של הכליה8. כמו רקמות אחרות שחלת בקר, כל אזור בלוטת יותרת הכליה מסנתז שלה סטרואידים כולסטרול חינם9. על גירוי הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (זינק), רמת הכולסטרול חינם הוא שוחרר מן פירוק השומנים טיפות, לפיכך, מגביר את ייצור הסטרואידים ב- fasciculata ו- reticularis10.

קבוצות רבות ניסו ליצור שורות תאים יציבה מן adrenocortical קרצינומות. עם זאת, מספר חששות מוגבלת השימוש של שורות תאים adrenocortical כמו דגמים חוץ גופית8. התגובות סטרואידים של שורות תאים עשויים להיות שונים בין הקטעים, מספר גדול של סרום איכות סרום, וכו '. יתר על כן, שורות תאים בלוטת יותרת הכליה מסחרי (Y1 ו- SW13) לא מפרישים corticosterone, וכך קשה יותר ללמוד האדרנל steroidogenesis8. באמצעות האדרנלים שור, הרכיבה כפי שמחוץ מודלים עשוי להיות בחירה טובה, אף-על-פי רקמות מן בשווקים אלה עשוי לטשטש כמה סיכונים לא ידועים. בהשוואה אליהם, ניהול עכברוש יותרת הכליה קל והוא המקור יחסית יותר יציבה ונטולת הפתוגן. יחדיו, נוכח השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לחקור את מנגנון הקשור של סינתזה corticosterone בתאי בלוטת יותרת הכליה fasciculata חולדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה של המשחקים העולמיים האוניברסיטה הרפואית.

1. ניתוח ניסיוני

  1. להקריב את החולדות SD נקבה/זכר בוגר (8-12 בת שבוע) על ידי CO2 המתת חסד.
  2. החלת 70% אתנול ולתת לו להיספג לתוך העור ולאחר מכן לנגב את העור עם נייר טישו.
  3. לשים את החולדה על צלחת פלסטיק נקי במצב פרקדן.
  4. להרים את העור עם מלקחיים מעוקל "חיצוניים" בקו האמצע ולבצע ניתוח בוטה על-ידי יצירת צורה "Y" (מן הרמה של הירך לזווית subcostal).
    1. לשטוף מספריים עם 70% אתנול, ואז לחתוך את השריר, גם יצירת צורה "Y".
  5. למצוא את בלוטת יותרת הכליה השמאלית מאחורי הקיבה.
    הערה:     האדרנל נכון יכול להימצא עמוק מאחורי הכבד.
    1. השתמש זוג מלקחיים להרים את הבטן או הכבד ולבודד ריגושים עם מלקחיים מעוקל עוד.
  6. לאחר הצבת בלוטות האדרנל לתוך תבשיל סטרילי, הסר בזהירות את הקפסולה יותרת הכליה עם מלקחיים משובחים.
  7. עם זוג מספריים עדין, לחתוך את האנדרנלין לחתיכות קטנות עם קצת קצת Dulbecco ללא סרום המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) / F-12 בינונית.
  8. להכין שלוש pipets פסטר שונים בגודל נקבובית ולהשתמש pipet הראשון את פסטר לרוקן את כל החלקים האדרנל לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכילות בינוני עם collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
    1. בעדינות triturate הרקמה חתיכות 10 x. להשתמש בשאר pipets, חזור על השלבים שלעיל עד כל החלקים מצטמצמות.
      הערה: גודל הנקבוביות שונים pipets פסטר יכולים להיווצר על-ידי חימום אותם באש. Pipet הראשון הוא הגודל המקורי (בערך 1 מ מ), גודל הנקבוביות השני הוא כ- 0.8 מ מ, pipet פסטר שלישית כ 0.5 מ מ. במהלך העיכול, החלקים של יותרת הכליה יהיו קטנים. לכן, באמצעות ההליך מכני, ריגושים יכול להיות מתעכל יותר מוגמר. דגירה הצינור באמבט מים (ב 37 מעלות צלזיוס), לנער את זה כל 5 דקות, 4 x סה כ.
  9. לאחר הדגירה 20 דקות, להוסיף בינוני צח וקריר (sixfold נפח; לדוגמה, 5 מ של רקמות + 25 מיליליטר מגניב בינוני DMEM/F-12) המכילה 2.5% עוברית שור סרום (FBS) ו 5% סרום סוס כדי להפסיק את האפקט אנזים.
  10. לאסוף את כדורי התא על ידי צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 10 דקות.
  11. הוסף אמצעי אחסון המתאים של מדיום להשעות את התאים.
    הערה: כל בלוטת יכול לעשות כ ~ 3 x 105 ~ 4 x 105 תאים.
  12. צלחת את התאים הרצויים צלחות או מנות עם מדיום הגידול (1:1 [וי/v] תערובת של בינוני F-12 של DMEM וחזיר, בתוספת פניצילין HEPES ו 1% 25 מ מ, סטרפטומיצין) לילה (יום 0) ב 37 מעלות צלזיוס, בסביבה humidified של 95% אוויר ו-5% CO2.
    הערה: בדרך כלל, אנחנו צלחת בתאים. ובכן 24 צלחות (ארבע בלוטות צלחת) עבור וזמינותו corticosterone, 35 מ"מ מנות (אחד בלוטת/כ 1-2 מנות) המערבי כתם ניתוח.
  13. לשטוף היטב את התאים 2 x DMEM/F-12 ללא סרום חמים בינונית (יום 1). החלף את מדיום הגידול החדש.
  14. לשמור על התאים ב 37 ° C בסביבת humidified של 95% אוויר ו-5% CO2 עד ליום 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות ההליך המתואר כאן, ראשי בתרבית תאי בלוטת יותרת הכליה יכול להבחין במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1 א'). כדי נוספת לאשר כי השלפוחיות המוגלתיות בתוך הציטופלסמה הם השומנים טיפות, ההכתמה immunofluorescence של אדיפוז הקשורות בידול חלבון (ADRP) יכול להתנהל על תרבויות היום-3 (איור 1B). התאים גדלו על coverslips זכוכית דקה. התאים היו שלוש פעמים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) שטופים קבוע עם 4% paraformaldehyde. לאחר כביסה שלוש פעמים עם PBS, ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בלוטת יותרת הכליה לשחק תפקיד מפתח הסתגלות סביבתית3. שבו קליפת יותרת הכליה מפרישה את ההורמון יכול לווסת ולהתאים פונקציות פיזיולוגיים והומאוסטזיס3. המודל ויוו משקף את ההשפעות הפיזיולוגיות מאוד בגוף. עם זאת, זה עדיין מושפע על ידי גורמים מורכבים רבים, גרימת תופעות לא יציב בניסויים. לעומת זאת, המודל תא במבחנה יש יתרונות שהופכים אותו לילדם בבעלי חיים. ראשית, התנאי סביבתי הוא קל לשלוט במערכת במבחנה. הורמונים נוטים להיות מושפעים על ידי גירוי כלשהו. ניסויים in vivo בדרך כלל תוצאה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של טייוואן המועצה הלאומית למדע (NSC102-2320-B-037-008-MY3) ואת הלאומית צ'נג קונג אוניברסיטת בית החולים במענק מחקר (NCKUH-10102045).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נקבה/זכר, חולדות SD/Wistar (8-12 שבועות)BioLASCOחולדות זכר או נקבה מתאימות לניסויים. בלוטות יותרת הכליה של הנקבה גדולות יותר מחולדות זכרים, עם זאת, חולדות נקבות מחזיקות במחזורי אסטרוס שעשויים להשפיע על הניסויים
קולגנאז, סוג IISigmaC-6885בידוד של תאי יותרת הכליה
DMEMThermoFisher12800-017אמצעי אבקה לתאי יותרת הכליה
Ham's F12ThermoFisher21700-075אמצעי אבקה לתאי יותרת הכליה
HEPESJT.baker4018בופר (אבקה)
NaHCO3JT.baker3506-1
סרום סוסיםHyclone16050014
סרום בקר עובריSAFC12103C
פניצילין (10,000 U)-סטרפטומיצין (10,000 ug/mL)קורנינג30-002-Clאנטיביוטיקה
מלקחיים מעוקליםBRAUNBD343R
מלקחייםBRAUNBD331R
מספרייםBRAUNBC224Rחותכים עור ושריר עכברוש
מספריים עדיניםBRAUNBC101Rחותכים בלוטות יותרת הכליה
חלבון הקשור להתמיינות שומןAbcamab108323נוגדן לחלבון הקשור לטיפות שומן
קורטיקוסטרון ערכת ELISAקיימן 500655בדיקה לסינתזה של קורטיקוסטרון
מיקרוסקופ אור הפוך מיקרוסקופפלואורסצנטי Leica
Nikon
Triton X-100JT.bakerX198-07לצביעה אימונופלואורסצנטית
נגד ארנב עיזים IgG Alexa 488 נוגדן משני פלואורThermoFisherA-11034לצביעה אימונופלואורסצנטית
Anti-ADFPAbcam108323לצביעה אימונופלואורסצנטית
ProLong Gold Antifade mountantThermoFisherP36935לצביעה אימונופלואורסצנטית

מקורות

  1. Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
  2. Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
  3. Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
  4. Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
  5. Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
  6. Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
  7. van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
  8. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
  9. Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
  10. Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24(2016).
  11. Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
  12. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
  13. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
  14. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
  15. Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
  16. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  17. Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
  18. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרבית ראשונית של בלוטת העלבדיקות תפקוד סטרואידוגניעיכול רקמהCollagenase IIצביעה אימונופלורסצנטיתניתוח קורטיקוסטרוןהורמון אדרנוקורטיקוטרופיזיהוי טיפות ליפידיםמיקרוסקופיה בניגודי פאזה
תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.