Method Article

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של קינאז-המצע יחסים חיונית כדי להשיג הבנה מלאה של הפונקציות של אנזימים אלה ומטרות במורד הזרם שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. CK2 הוא קינאז סרין אבולוציונית שנשמרת/תראונין עם הרשימה המתארכת של מאות סובסטרטים מעורבים תהליכים תאיים מרובים. בשל תכונותיו pleiotropic, זיהוי ואפיון ערכה מקיפה של סובסטרטים CK2 כבר מאתגר במיוחד, נשאר משוכה במחקר של אנזים חשוב זה. כדי לטפל באתגר זה, אנו פיתחו אסטרטגיה ניסיוני רב תכליתי המאפשר את העשרה יישוב וזיהוי של בשם דיאלקטריים CK2. פרוטוקול זה מנצל יחודיות ייחודי מצע משותף כפול של CK2 ומאפשר thiophosphorylation ספציפיים של סובסטרטים שלו בתא או רקמות lysate. חלבונים אלו המצע לאחר מכן alkylated, immunoprecipitated, ו המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). השתמשנו בעבר גישה זו בהצלחה לזהות CK2 סובסטרטים מן השחלות דרוזופילה ולהרחיב כאן אנחנו היישום של פרוטוקול זה לתאים אנושיים גליובלסטומה, הממחישות את יכולת ההתאמה של שיטה זו לחקור התפקיד הביולוגי של קינאז דגם אורגניזמים שונים, מערכות ניסויות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים kinases הם רכיבי מפתח של האות התמרה חושית cascades. זרחון של חלבונים המצע על ידי אנזימים אלה מעורר תגובות ביולוגיות להסדיר אירועים קריטיים שליטה חלוקת התא, חילוף החומרים, בידול, בין היתר. CK2 הוא קינאז ביטוי ubiquitously, acidophilic סרין/טראונין זה חוק של שמרים לבני אדם, זה ממלא תפקידים חשובים רבים תהליכים תאיים ועד תקנה תעתיק מחזור התא התקדמות אפופטוזיס1 ,2,3. האנזים הוא heterotetramer המורכב שני α קטליטי (או α') subunits וβ רגולטוריות שני subunits4. בנוסף להיותו מאוד pleiotropic, CK2 מוצגים שני יוצא דופן מאפיינים אחרים זה לסבך את הניתוח שלה, כלומר פעילות מכוננת5 ו- ירידה לפרטים מצע משותף כפול6. המאפיין האחרון הזה מעניק CK2 עם היכולת להשתמש GTP, כמו גם ATP עבור זרחון של חלבונים המצע.

מחיקת גנטי subunits קטליטי או תקניות של CK2 בעכברים גורמת lethality עובריים המציין כי זה משחק תפקיד מכריע במהלך פיתוח ו-7,organogenesis8. CK2 הוא overexpressed גם כמה סוגים של סרטן ומייצגת ובכך מבטיח מטרה טיפולית9,10,11. אכן, ספציפית מעכבי פעילות קינאז CK2 את היעד הם כעת תחת חקירה זו מטרה12,13,14. בעוד עיכוב של CK2 היא אפשרות מעשית, בהתחשב באופי pleiotropic שלה, חלופה אולי גישה יותר הגיוני יהיה היעד קריטית סובסטרטים CK2 העומדים בבסיס את התקדמות סרטן מסוימים. לכן, מקיף זיהוי ואפיון של חלבונים המצע CK2 יהיה של יתרון משמעותי עבור שחקרתי את function(s) ספציפיים של קינאז בתוך סוג הרקמה או גידול מסוים.

כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית רב-תכליתי לזיהוי CK2 סובסטרטים מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תאים או רקמות lysate. פרוטוקול זה מנצל יחודיות כפול מצע משותף של CK2 על-ידי שימוש אנלוגי GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) guanosine שלא kinases אנדוגני אחרים יכולים להשתמש. דבר זה מאפשר ביעילות את קינאז "לסמן" שלה מצעים בתוך את הדוגמית הזו. עבור הבאים בידוד וזיהוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ודא כי החומרים הדרושים הם זמינים הוכנו כראוי (ראה טבלה של חומרים).

1. הכנה

  1. מכנית lyse דגימת הרקמות (1-2 מ ג של רקמות µL 100 פירוק מאגר, טבלה 1) או תרבותי תאים (10 ס מ זה 80-90% confluent ב µL 350 מאגר פירוק), לוחית עם המטרה היא לאסוף סכום של 900 µL מדגם לניסוי. שימו לב כי נפח זה עודף קל של מה נדרש בשביל הניסוי המתואר להלן.
  2. ספין למטה הדוגמאות על ידי צנטריפוגה ב 17,500 x g במשך 3 דקות ב 4 º C. בגמר, העברה µL 270 של תגובת שיקוע כל אחד שלושה צינורות microcentrifuge החדש של 1.7 mL. יהיו כ 90 µL שנותרו. הסר µL 40 כדי לשמש של "בקרת קלט" ומקום צינור חדש. במקום כל דוגמאות על קרח.

2. קינאז assay: thiophosphorylation, אלקילציה

  1. תווית שלושה צינורות המכיל 270 µL כדלקמן: "rxn קינאז", "GTPγS בלבד", ו "PNBM (p-nitrobezyl מסילייט) בלבד". הכינו את התגובות קינאז.
    1. אל הרכבת התחתית "קינאז rxn", להוסיף µL 2.7 (שקול ל- 1,350 U) של CK2 ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS.
    2. אל הרכבת התחתית "GTPγS בלבד", להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS, ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 פירוק המאגר.
    3. כדי הרכבת התחתית "PNBM בלבד", להוסיף µL 5.4 פירוק המאגר. קפיצי לכל הצינורות כדי לערבב ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.
  2. דגירה כל שלושה צינורות עבור 1 דקות באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס. בעקבות דגירה, להוסיף µL 13.5 של 12 מ"ג/מ"ל PNBM כל שלושה צינורות. ' היפוך ' כדי לערבב דגימות. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר מאובטח.
  3. לאחר תחילת הדגירה בשלב 2.2, להכין את העמודות desalting ברגע ככל האפשר התהליך נמשך כ- 45 דקות.

3. הכנת desalting עמודות

  1. בתחילה הכן עמודות (3 לניסוי הזה למשל) על ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי מחדש להשעות G-25 ספדקס שרף במאגר של אחסון. לאפשר שרף להתיישב על ידי הצמדת כל עמודה עמדה קלאמפ ולתת לזה לשבת ללא הפרעה במשך כ 5 דקות.
  2. בעקבות שיקוע של שרף ספדקס G-25, להסיר את הפקקים הן העליון והתחתון של העמודה כדי לאפשר מאגר אחסון ניקוז על ידי כוח המשיכה, יש לו צינור הממוקמת מתחת הפתח התחתון כדי לאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול.
  3. לאחר אחסון מאגר תיגמר, להוסיף כ- 2.7 mL פירוק המאגר כדי equilibrate את העמודות. לאסוף את הזרימה דרך וזורקים. חזור על 3 פעמים. בעקבות equilibration הסופית, העמודות מוכנים עבור שלב 4.1.

4. הסרת PNBM

  1. לאחר דגירה 1 h (שלב 2.2) והכנת עמודה (שלב 3) הושלמו, להחיל את הדגימות לעמודות. תווית כל עמודה כדלקמן: "קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM בלבד". לטעון את כל כל דגימה על גבי שלה העמודות בהתאמה. אוספים וזורקים את הזרימה דרך.
  2. רחץ דוגמאות על-ידי הוספת µL 420 פירוק מאגר כל עמודה. לאפשר פירוק המאגר לסנן באמצעות המדור ולאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול. בעקבות צעד זה לשטוף, למקם את צינורות במיקום עבור אוסף של דוגמאות.
  3. Elute דוגמאות על-ידי הוספת µL 500 פירוק מאגר כל עמודה. לאסוף את הזרימה דרך המכיל עכשיו thiophosphorylated ותערובות CK2 alkylated.

5. Immunoprecipitation: חלק א'

  1. להכין דגימות immunoprecipitation על ידי הראשון µL 80 הסרת עבור דוגמה "• תנאי קלט שליטה" מכל אחת elutions בהתאמה ("קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM רק") שנאספו בשלב 4.3. בעקבות הסרת µL 80 מ כל דגימה, יהיו כ 420 µL הנותרים עבור דגימה.
    1. לפצל כל מדגם 2 צינורות המכיל 200 µL. תווית כל שפופרת בהתאמה: "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר", "rxn קינאז IgG", "GTPγS אנטי-thiophosphate אסתר", "GTPγS אג", "PNBM אנטי-thiophosphate אסתר" ו- 'PNBM אג'.
  2. הוסף µg 2.8 של נוגדן anti-thiophosphate אסתר לכל אחד הצינורות התווית על-ידי אסתר anti-thiophosphate ואת µg 2.8 של נוגדן שליטה isotype לכל אחד הצינורות התווית על-ידי IgG. במקום צינורות על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
  3. להתחיל הכנה של חלבון A/G חרוז במהלך 15 דקות האחרונות של הדגירה 2 h בשלב 5.2.

6. חלבון A/G agarose חרוז הכנה

  1. בקצרה מערבולת הצינור אחסון כדי להבטיח חרוזים הם לגמרי מחדש על תנאי. לחתוך את סוף P200 עצה פיפטה בעזרת סכין גילוח נקי כדי להגדיל את מד גודל. Pipet 100 µL של slurry חרוז לכל immunoprecipitation לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ ל. עבור דוגמה זו, סכום כולל של 6 צינורות נחוצים.
  2. Centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. מחדש להשעות את החרוזים ב 200 µL של פירוק מאגר, בקצרה מערבולת. חזור על הספין ולשטוף שלבים 3 פעמים.
  3. בעקבות בכביסה הסופי, במקום את החרוזים על הקרח עד הדגירה בשלב 5.2 תושלם.

7. Immunoprecipitation: חלק ב'

  1. לאחר 2 h הדגירה מהשלב 5.2, ספין למטה הדגימות ב x 17,500 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. בעקבות צנטריפוגה להוסיף 200 µL מהדגימה כל הצינורות עם החרוזים שטף. במקום הצינורות על מסובב ב 4 ° C עבור 1 h.
  2. בעקבות הדגירה 1 h, centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הבא להסיר כל מדגם µL 40 של תגובת שיקוע ולשמור ככל "פקד דלדול" (סה כ 6 צינורות). הסר את השארית של תגובת שיקוע, להשליך. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים.
  3. לשטוף את הדוגמאות על-ידי הוספת µL 200 של פירוק מאגר, vortexing בקצרה. צנטריפוגה ואז ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על לשטוף את ולסובב שלבים 3 פעמים. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים במהלך שלבים אלה.
  4. לאחר השלמת השלבים לשטוף, להוסיף 50 µL 2 x מדגם מאגר כל מדגם המכילה חרוזים. כל דוגמאות אחרות, הוסיפו µL 8 של 6 x מאגר מדגם: "בקרת קלט", "בקרות קלט • תנאי" ופקדים "מחסור".
  5. ברגע מאגר נוסף הצינורות, pipet למעלה ולמטה כדי לערבב, מחממים כל דוגמאות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני שתמשיך עם עמודים מרחביות.

8. ניתוח/אימות של תוצאות

  1. אמת thiophosphorylation תלויי-CK2 מוצלחת, אלקילציה.
    1. כדי לקבוע את היעילות של thiophosphorylation בתיווך CK2 בשלב 2.2, מבצעים מרחביות-דף סופג המערבי על-ידי הפעלת µL 15-20 של "• תנאי קלט הפקדים" אסף בשלב 5.1 על ג'ל לזיהוי 12.5%.
    2. בדיקה ממברנות עם נוגדנים הבאים: אנטי-thiophosphate אסתר, anti-CK2α, ו- anti-GAPDH (או פקד הטעינה מתאים אחר). אם שלב זה היה מוצלח, אות אסתר נגד משופרת-thiophosphate צריך להיות לכאורה במסלול "rxn קינאז" לעומת אחרים שני המסלולים (איור 2).
  2. דמיינו דיאלקטריים בשם מועשר של CK2 ולקבוע זהות החלבון.
    1. כדי להעריך אם המדרגות immunoprecipitation היו מוצלחות, הפעל 25-30 µL של הדגימות eluted של החרוזים בשלב 7.4 על ג'ל לזיהוי נפרד 12.5%. ודא כי כל הציוד הוא נקי, לבשו כפפות בכל עת במהלך שלב זה כדי למזער את הזיהום.
    2. מכתים את הג'ל עם Coomassie כחול להמחיש מהחלבונים מועשר בשלבים שונים של פרוטוקול נסיוני (איור 3). משתמש חדש razorblades, בזהירות להקות ייחודי בלו מציגים בנתיב "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר IP", וציין משקולות מולקולרית המשוער שלהם.
    3. להגיש את הלהקות האלה לזיהוי חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) (איור 4). אם נוגדנים נגד החלבונים מזוהה זמינים, לאשר את התוצאות של ספקטרומטר מסה מאת מרחביות-דף immunoblotting של קלט, דלה, שברים IP שנאספו במהלך הקורס של הפרוטוקול (איור 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים כללי של ההליך ניסיוני מסופק באיור1. הבסיס כבסיס של הטכניקה היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP להעברת קבוצה phosphoryl. תוספת של holoenzyme CK2 אקסוגני יחד עם GTP אנלוגי, GTPγS, אל תא lysate גורמת thiophosphorylation של סובסטרטים CK2 אנדוגני. הטיפול הבאים של lysate עם החומר מגיב p- nitrobenzyl מסילייט (PNBM) יוצר moiety אסתר thiophosphate על חלבונים אלה סובסטרט מסוים כי אז ניתן immunoprecipitated באמצעות נוגדן anti-thiophosphate אסתר בסופו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה הביוכימי פשוט יחסית לזיהוי סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיות מורכבות. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מבוססים על מאפייני אנזימטי יוצא דופן CK2 וכוללים CK2 תלוית thiophosphorylation של חלבונים ספציפיים המצע באמצעות GTPוγS ו immunoprecipitation הבאים וזיהוי שלהם. עם התוצאות האלה, הראו את השירות ואת צדדיות של גישה זו כפי שאנחנו עכשיו יישמו אסטרטגיה זו תאים אנושיים גליובלסטומה והן דרוזופילה השחלות18.

מספר מחקרים שפורסמו בעבר שי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק שיפור המחקר אוניברסלי קהיליה מחלקת פנסילבניה הבריאות T.I.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 מ"ג/מ"ל PNBMAbcamab13891040.5 ומיקרו; L
2.5 מ"מ GTPγ Sסיגמא-אולדריץ'G8634-1MG5.4 ומיקרו; L
אנטי-CK2 ואלפא; (E-7) נוגדן חד שבטי לעכברסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-3738941:1000 לנוגדנים
חד שבטיים של עכבר אנטי-GAPDH (6C5) סנטהקרוז ביוטכנולוגיהsc-322331:1000 לנוגדנים רב-שבטיים של ארנב אנטי-נוקלולין
Abcamab227581:1000 לכתמים מערביים
אנטי-תיופוספט אסטר [51-8] נוגדןחד שבטי ארנבAbcamab92570משתנה (ריכוז סופי 2.8 ומיקרו; g עבור כל דגימה)
צנטריפוגה מוגדרת מראש ל-4º CThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete מיני מעכב פרוטאז ללא EDTARoche11836170001
Lysis Bufferראה מתכון למטה ראהמתכון למטה 30מ"ל
נוגדן IgG ארנב רגיל (בקרת איזוטיפ)טכנולוגיית איתות תאים2729S משתנה (ריכוז סופי 2.8 ומיקרו; g לכל דגימה)
PD MiniTrap ColumnGE Healthcare28-9180-103 עמודות
חלבון A/G בתוספת חרוזי אגרוזסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-2003600 ומיקרו; L
הולואנזים אנושי רקומביננטי CK2אינגלנד BiolabsP6010S2.7 ומיקרו; L
RotatorLabnet: מיני Labrollerמיני Labroller מק"ט# H5500
T98G תאי גליובלסטומה אנושייםATCCCRL-1690
אמבט מים מוגדר מראש ל-30º סדרתShel LabH20 דגם # SWB15
ניו האמבטיה C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858(2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460(2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CK2 SubstratesKinase AssayThiophosphorylationLC MS MSImmunoprecipitationGTPgammaS LabelingSephadex G 25Anti Thiophosphate EsterProtein IdentificationWestern Blot

Related Articles