מאמר שיטה

קצב צריכת החמצן וניתוח Cardiomyocytes Neonatal העכבר בתרבית הראשי באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

13 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה נועד להמחיש כיצד להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן של הלב.

תקציר

המיטוכונדריה, מטבוליזם חמצוני הם קריטיים לשמירה על תפקוד שריר הלב. מחקרים הראו שכי תפקוד מיטוכונדריאלי הוא גורם חשוב לתפקוד הלב לקוי נמצא באי ספיקת לב. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי פגומים ייתכן השפעות מועילות לשיפור תפקוד הלב אצל הלב נכשל. לכן, לומד את מנגנוני הרגולציה וזיהוי הרגולטורים הרומן לתפקוד מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה שניתן להשתמש בהם כדי לפתח מטרות טיפוליות חדשות לטיפול מחלת לב. כאן, myocyte לב נשימה מיטוכונדריאלי ניתוח באמצעות מערכת התרבות תאים ייחודיות. ראשית, פרוטוקול מוטבה כדי לבודד במהירות, תרבות גבוהה הכדאיות העכבר neonatal cardiomyocytes. לאחר מכן, מנתח 96-ובכן עיצוב השטף חוץ-תאית משמש כדי להעריך את קצב צריכת החמצן של אלה cardiomyocytes. עבור פרוטוקול זה, אנו ממוטב זריעה תנאים, הפגינו שקצב צריכת החמצן הזה העכבר neonatal cardiomyocytes יכול להידרש בקלות מנתח השטף חוץ-תאית. ולבסוף, נציין כי הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לגודל תרבות גדול יותר, מחקרים אחרים, כגון העברת אותות תאיים ו כויץ לתפקד ניתוח.

מבוא

כדי לקיים את הפונקציה כויץ לב רציפה, cardiomyocytes חייב לשמור על אספקה קבועה של האנרגיה התאית בעיקר בצורת ATP1. בלב, כ- 95% של ATP נוצר על ידי המיטוכונדריה, בעיקר באמצעות זרחון חמצוני, מראה כי המיטוכונדריה תפקיד מכריע bioenergetic תפקוד הלב2,3. תמיכה מושג זה זה dysregulation של הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להוביל4,של שריר הלב, אי ספיקת לב-5. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי הוכח לשפר את תפקוד הלב של הכשל של הלב6,7. לכן, לומד את המנגנון של ביואנרגיה מיטוכונדריאלי וזיהוי הרגולטורים הרומן של פונקציית מיטוכונדריאלי cardiomyocytes יהיה לא רק לחשוף תובנות מכניסטית הפקת האנרגיה הלב אך גם יכולה לספק תובנות אשר תוביל להתפתחות של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות לב6,8.

בהשוואה ל לב שלם, אשר מכיל תערובת של השריר ואת הלא נייטרלים9, cardiomyocyte תרבויות הם מאוד טהור, עם זיהום מזערי של הלא-נייטרלים מהלב, כגון fibroblasts, תאי אנדותל10. בנוסף, בידוד cardiomyocytes מן הגורים neonatal מאפשר culturing מספר גדול של תאים בכמות קטנה של זמן, לעומת תאי בידוד מ לבבות למבוגרים10,11. והכי חשוב, cardiomyocytes העכבר למבוגרים בתרבית הראשי יש הישרדות קצר פעמים (למשל 24 שעות), זמן ארוך יותר נקודות de-להבדיל. העכבר neonatal cardiomyocytes יכול לשרוד, להיות מניפולציה על למעלה מ- 7 ימים בתרבות, הופכות אותה לאידיאלית עבור בחינת השפעת סמים תרכובות ומניפולציה הגן על הפונקציה של המיטוכונדריה cardiomyocytes10. כמובן, ישנם הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין התאים למבוגרים ו- neonatal, אך משך הזמן הארוך זמינים עבור התרבות של תאים neonatal גורם להם המתאים עבור סוגים שונים של מחקרים, כולל אלה של הפונקציה מיטוכונדריאלי.

עד כה, ראשי בתרבית neonatal עכבר ועכברוש, cardiomyocytes שימשו כמודלים ללימודי ביואנרגיה לב12,13. בשנים האחרונות, מחקרים משמש מנתח השטף חוץ-תאית למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ולהעריך קיבולת חמצוני עכבר ועכברוש, neonatal cardiomyocytes14,15. בעוד בהשוואה חולדות, הכדאיות תא של העכבר cardiomyocytes neonatal נמוכה ויש לו השתנות גדולה יותר16. היכולת ללמוד תאים מהונדסים גנטית עכבר מודלים מאפשר גם המודל תא העכבר חשוב מאוד. בהתחשב בכך OCR מחקרים הם כל כך רגיש לתא זריעה צפיפות ומספר, נדרש פיתוח פרוטוקול לשחזור אמין, פשוט כדי להשיג תשואה תא עקבי הכדאיות.

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימיזציה אשר פותחה העושה שימוש בעכבר בתרבית cardiomyocytes neonatal יחד עם מאבחן 96-ובכן-עיצוב חוץ-תאית השטף לניתוח OCR. פרוטוקול זה מגדיל מאוד הפארמצבטית של וזמינותו. בנוסף, הפרוטוקול מספקת הרומן שיטה לשחזור לניתוח OCR אלא גם יכול להיות מותאם תרבות גודל גדול יותר למטרות ניסוי אחרים, כגון זו אשר עשוי להיות נחוץ ללמוד פונקציות myofibrillar, תאיים איתות המסלולים.

בפרט, פרוטוקול זה מתאר שגרה יום אחד עבור בידוד והתרבות של העכבר neonatal cardiomyocytes בצלחת תרבות תא 96-ובכן. בנוסף, הוא מתאר את ההליך כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית. כל הפתרונות בשימוש סטרילי או סינון סטרילי. כל הכלים סטריליים על ידי 75% אתנול. אנו מספקים את הטבלה של חומרים עבור חלקים שונים של ההליך. עבור culturing cardiomyocytes, כל ההליכים והשלבים מבוצעים בשכונה תרבות תא סטנדרטי. פרוטוקול זה מפותח עבור בידודו של העכבר neonatal לבבות של המלטה אחת (כ 8-10 הגורים). עם זאת, הפרוטוקול ניתן להתאים גם לבידוד cardiomyocytes של המלטות מרובות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לעבודה עם עכברים neonatal, נא להפנות קבע הנחיות האוניברסיטה המקומית/מכון הלאה על-ידי תוכניות טיפול בבעלי חיים, לדבוק מוסדיים ואחרים רגולציות אחד. כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי UC סן דייגו אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC), לדבוק הפדרלי ואת המדינה.

1. הכנת נוגדנים

  1. להכין 25 מ של פתרון בעיכול: HBSS (בלי Ca2 + ו Mg2 +) בתוספת טריפסין (0.5 mg/mL). לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. להפוך את פתרון בעיכול ביום של הניסוי.
    הערה: זה קריטי להשתמש HBSS ללא Ca2 + , מ ג2 +,2 + Ca ו- Mg2 + יגרום להתכווצות myocyte מות תאים עוקבים במהלך בידוד.
  2. הכנת 30 מ של מאגר עיכול collagenase: collagenase (0.8 מ"ג/מ"ל, כ U/mL 350) מומס מאגר HBSS (ללא Ca2 + ו Mg2 +). לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. להפוך collagenase עיכול פתרון ביום של הניסוי.
  3. הכנת 500 מ"ל של cardiomyocyte תרבות התקשורת (מדיה צמיחה): מערבבים 375 מ של DMEM, 125 מ של M-199, 25 מ של הסוס סרום ו מ"ל של FBS. תוספת עם פניצילין 1%, 1% פתרון סטרפטומיצין.
  4. להכין בדיקה מיטוכונדרית בינוני: להפוך 200 מ ל DMEM המבוסס על בדיקת המאמץ בינונית (DMEM ללא NaHCO3, ראה טבלה של חומרים) בתוספת 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ מגלוטמין, גלוקוז 10 מ מ, ואת 2 מ מ Hepes.
    הערה: להפוך 1 ליטר של מדיום עם DMEM ללא נתרן פירובט, -גלוטמין, גלוקוז, Hepes, במיון סטרילי, ולאחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין המדיום בדיקה ביום של וזמינותו על-ידי הוספת אחרים. שימוש DMEM הבינונית ללא NaHCO3 הוא קריטי.
  5. להתאים את ה-pH של מדיה בדיקה מיטוכונדרית 7.4 ביום של שימוש. מדיה חמים עד 37 ° C לפני השימוש.
  6. הכנת oligomycin: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
  7. הכנת FCCP: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
  8. להכין antimycin A: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
  9. להכין rotenone: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
    הערה: כל ריאגנטים ופתרונות בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1.

2. האיסוף, בעיכול הלבבות של עכברים Neonatal (יום 1)

  1. אוטוקלב מספריים, מלקחיים, כפית מוריה לחטא.
  2. ביצוע כל הצעדים למכסה תרבות תא בשביל בעקרות.
  3. Aliquot 5 מ"ל של HBSS (ללא Ca2 +, Mg2 +) עד כל טוב של צלחת תרבות תא 6-טוב; מניחים על קרח. Aliquot 10 מ של HBSS לתוך תבשיל תרבות תא 10 ס מ.
  4. להכין 20 מ של טריפסין בעיכול פתרון צינור חרוטי סטרילי 50 מ. שמור כל הפתרונות על קרח.
  5. במהירות לטבול היילוד (יום 0) עכברים בפתרון אתנול 70% עבור עיקור.
  6. לערוף הגורים באמצעות מספריים סטרילי (ישר) ללא הרדמה, ולאחר מכן פתח את החזה לאורך עצם החזה כדי לאפשר גישה בחלל החזה ואת הלב. (איור 1 א')
    הערה: 1) זה קריטי להשתמש עכברים neonatal P0 להשגת תא גבוהה הכדאיות. 2) שיטה. זו המתת חסד מותרת עבור neonates על פי הנחיות של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית ו- NIH- 17.
  7. תמצית לבבות מהגוף עם מספריים בסדר, העברה מיידית לתוך המנה תרבות עקרה תא המכיל HBSS (ללא Ca2 +, Mg2 +) (איור 1B).
  8. להסיר את כל רקמת הריאה שיורית, כלי גדול, וכו ' (ואת אטריה, במידת הצורך). רחץ לבבות בפתרון HBSS תסיסה עדינה.
  9. חותכים כל לב עם מספריים בסדר 8 חתיכות ולהעביר את רקמת הלב כל עם מלקחיים לבאר אחת של צלחת תרבות תא 6-טוב עם HBSS (איור 1C ו ד 1).
  10. לשטוף את ליבם על ידי העברת את הלבבות טוב טוב בצלחת 6-ובכן מלא HBSS, באמצעות כפית מוריה (איור 1D).
    הערה: העברת את הלב טוב טוב הוא מספיק כדי לשטוף את הדם. מאז דם מפריע עיכול אנזימטי חשוב לשטוף את הלבבות עם HBSS ולהסיר את הדם.
  11. להעביר את הלבבות עם כפית מוריה לתוך צינור חרוטי המכיל 20 מ של טריפסין (0.5 mg/mL), דגירה עם עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות (איור 1E).

3. מכינים צלחת 96-ובכן תרבות (יום 1)

  1. להכין 5 מ של ציפוי פתרון: PBS המכילה ג'לטין 0.5% (אוטוקלב לפני השימוש) והפתרון fibronectin 1%. (למשל פתרון ג'לטין מ ל בתוספת 50 µL של פתרון fibronectin)
  2. Aliquot 50 µL של ציפוי פתרון לבאר כל צלחת תרבות 96-ובכן תא (ראה טבלה של חומרים). אם בועות קיימות, להסיר אותם באמצעות פיפטה 20 µL למצוץ בועות החוצה.
    הערה: חשוב לכסות את כל שטח הפנים של כל טוב עם ציפוי פתרון.
  3. דגירה את הצלחת ב חממה התרבות התא 37 ° C 1 h או יותר כדי לאפשר ייבוש של ציפוי מטריקס.
  4. תשאף כל פתרון ציפוי שיורית לפני זריעה cardiomyocytes.

4. אנזימטי לעיכול, ציפוי של תאים (יום 1)

  1. לחמם collagenase פתרון עיכול באמבט מים 37 º C.
    הערה: זה צעד חשוב להשיג יעילות עיכול אנזימטי.
  2. להזיז את הצינור חרוט המכיל לבבות והפתרון בעיכול של 4 ° C כדי ברדס תרבות תא. (איור 1F)
  3. תן הלבבות לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את הפתרון בעיכול באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל (1-2 מ"ל של המדיום בידוד עשויה להישאר בצינור).
  4. להוסיף 10 מ של HBSS לתוך הצינור. להשעות מחדש את הלבבות עם HBSS 2 - 3 פעמים כדי לשטוף טריפסין באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל. האחות HBSS (1-2 מ ל עשויים להישאר בצינור).
  5. להוסיף 10 מ של פתרון מערכת העיכול collagenase ומחוממת מראש לתוך הצינור עם לבבות. (איור 1 ג'י)
  6. דגירה ברכבת התחתית עם לבבות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בלי עצבנות (1 עיכול).
  7. לאחר עיכול 1, להעביר את הצינור למכסה התרבות תאים. Triturate לבבות בעדינות על ידי השעיית מחדש את הלבבות בתוך הצינור בעדינות 10 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ. זה יאפשר לבבות לפיזור ותאים להשתחרר מרקמות ללב. (איור 1 H)
    הערה: מאז cardiomyocytes שברירי, עדין trituration חשוב להשיג את הכדאיות גבוהה.
  8. תן את הרקמה מעוכל כיור, העברת פתרון מתעכל המועשר cardiomyocytes (כ 9-10 מ"ל) אל צינור חרוטי, ולהוסיף מיד כמות שווה של התא תרבות המדיה כדי לעצור את העיכול collagenase.
  9. להוסיף 10 מ של פתרון מערכת העיכול collagenase לתוך הצינור המכיל את רקמת הלב מעוכל הנותרים.
  10. דגירה ברכבת התחתית עם רקמת הלב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (2nd עיכול).
  11. חזור על הליך 4.7 ו- 4.8.
    הערה: אם יש עדיין הרבה מעוכל רקמות, חזור על עיכול עוד פעם אחת. עם זאת, ברוב המקרים, שני digestions הם מספיק כדי לפזר את רוב התאים של רקמת הלב.
  12. מקום סטרילי תא-מסננת (100 מיקרומטר רשת ניילון) צינור חרוטי סטרילי 50 מ. טרום רטוב מסננת את התא עם 2-3 מ"ל של התא תרבות מדיה ולהעביר תאים דרך התא-מסננת. יש לשטוף את התא-מסננת עם 2-3 מ"ל של התא תרבות המדיה. (איור 1I)
  13. צנטריפוגה חרוט שפופרת המכילה cardiomyocytes למשך 5 דקות ב x 180 גרם (איור 1J). וארוקן את תגובת שיקוע (איור 1 K), אשר מכילים שאריות רקמת תאים, מחדש להשעות בגדר תא ב- 10 מ"ל של התא תרבות המדיה (איור 1 L).
  14. בעדינות resuspend תאים ותאים צלחת על גבי צלחת תרבות תא 10 ס מ (פלסטיק ללא כל סוג של ציפוי), תקופת דגירה של 1 h בחממה תרבות התא (ציפוי מראש-1) (איור 1 מ'). שלב טרום ציפוי זה מאפשר הלא-cardiomyocytes, כגון fibroblasts ותאי אנדותל, לדבוק המנה תרבית תאים ללא ציפוי.
    הערה: בשלב זה, cardiomyocytes הם בדרך כלל עגול, יופיעו נוצץ מתחת למיקרוסקופ. (איור 1N).
  15. לאחר הדגירה 1 h, בעדינות להתסיס את הצלחת תאים שאינם מחסידי (מועשר cardiomyocytes) מתוך קערה תרבות 10 ס מ, וקונטה מחדש להשעות תאים על-ידי שוב ושוב pipetting המדיום התרבות התא מעל המנה באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ. לאחר מכן, להעביר תאים שאינם מחסידי (מועשר cardiomyocytes) לתוך 10 ס מ תא תרבות תבשיל חדש (פלסטיק ללא ציפוי כלשהו), תקופת דגירה של h 1 נוספים בחממה תרבות התא (ציפוי טרום 2).
    הערה: תאי לצרף לצלחת מצופה שאינם נמצאים דומיננטית שאינם cardiomyocytes: fibroblasts ותאי אנדותל, זה להיות visualized תחת מיקרוסקופ (איור 1O).
  16. לאחר ציפוי טרום 2, בעדינות להתסיס את הצלחת, לשטוף. תאים שאינם מחסידי (cardiomyocytes) המנה תרבות 10 ס מ ולאחר מכן להעביר את cardiomyocytes לתוך צינור חרוטי 50 מ.

5. ספירת תאים ותאי ציפוי לצלחת תרבות 96-ובכן תא (יום 1)

  1. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  2. צלחת התאים לתוך צלחת תרבות 96-ובכן תא מטריצה חוץ-תאית מצופה ב צפיפות בין 10 – 30 x 103 תאים/היטב באמצעות פיפטה רב ערוצית בנפח סופי של 200 µL (איור 1 P). השתמש בארות A1, A12, H1 ו H12 על רקע: הוסף µL 200 בינוני תרבות אחרים בארות בארות אלה (ללא תאים). דגירה את הצלחת ב חממה התרבות התא 37 ° C.
    הערה: במחקר זה, צריכת חמצן נבחנה על-ידי שימוש צפיפויות תא שונים כגון310 x 10, 20 x 103או 30 x 103 תאים/טוב. (איור 2 א). כמו כן, כאמור לעיל, cardiomyocytes מיד לאחר בידוד הם בדרך כלל עגול ומופיעות נוצץ מתחת למיקרוסקופ. התאים קיימא מתיישר בתוך 16-24 h של תרבות.

6. חמצן צריכת Assay באמצעות 96-ובכן-עיצוב חוץ-תאית השטף מנתח (יום 2)

הערה: Assay צריכת חמצן יכול להתבצע יום לאחר ציפוי התאים או מאוחר יותר. Cardiomyocytes neonatal תרבותי באמצעות פרוטוקול זה יכול לשרוד עד 7 ימים פוסט בידוד.

  1. מימה מחסנית חיישן מנתח השטף (ראה טבלה של חומרים) לפחות 3 שעות, אבל באופן אידיאלי ליום מלא, לפני וזמינותו. להוסיף 200 µL של פתרון Calibrant (ראה טבלה של חומרים) לתוך הבאר כל צלחת השירות, להחזיר את מחסנית חיישן לצלחת השירות, דגירה ב חממה 37 ° C ללא CO2 או תוספת של2 O.
  2. לשנות תא תרבות המדיה המיטוכונדריה בדיקת המאמץ בינונית שעה אחת לפני וזמינותו. Cardiomyocytes הם שבירים. לכן, בעדינות להסיר התקשורת התרבות התא באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לשטוף את התאים עם µL 200 אמצעי בדיקה מיטוכונדרית מראש ומחוממת פעמיים. לאחר השטיפה השנייה להוסיף µL 175 של המיטוכונדריה מראש ומחוממת בדיקת המאמץ מדיה, התרבות התאים חממה 37 ° C ללא CO2 או תוספת של2 O.
  3. הכנת תרכובות מבחן מרוכז. לבדיקה מתח המיטוכונדריה, להכין 3.0 מ ל כל אחד של oligomycin מיקרומטר 16, 9 מיקרומטר FCCP תערובת של 20 מיקרומטר rotenone 20 antimycin מיקרומטר A, כל בדיקה מיטוכונדרית בינוני.
    הערה: כל המתחם-ריכוז תיאר נבדקו. אולם, titrating את הריכוז של כל המתחם במעבדה של כל אחד הוא הכרחי.
  4. לטעון µL 25 של כל המתחם לתוך מזרק היציאות של מיכל הדיו חיישן באמצעות פיפטה רב-ערוצי (איור 1Q). בטבלה 2מתוארים את העוצמה ואת הריכוז הסופי.
  5. להגדיר את פרוטוקול assay השטף חוץ-תאית. התוכנית זו מתוארת טבלה 3-
  6. הפעלת התוכנית. ראשית, לשים את מחסנית חיישן לתוך המכונה לצורך כיול (איור 1R). להחליף את calibrant על הלוח assay ברגע נעשה הצעד כיול.
    הערה: שימוש בתוכנה שסיפק יצרן, מצביעים על קבוצות של וולס, כל המתחם והנמל.
  7. אם רצונך בכך, לאחר וזמינותו, בזהירות למחוק כל מדיום assay באמצעות פיפטה רב ערוצית ולאחסן את microplate התרבות התא ב-20 ° C עבור נרמול תא בעתיד באמצעות שיטת.
  8. למדוד את תכולת החלבון. להוסיף µL 50 בפתרון פירוק התא ריפה רגיל (ראה טבלה של חומרים). דגירה על הלוחית קרח למשך 30 דקות מלא lyse תאים. העברת כל החומר צלחת חדשה בתחתית שטוח ברור 96 assay היטב.
  9. למדוד ריכוז החלבון על ידי BCA assay לפי הפרוטוקול של היצרן.
    הערה: ציפוי הבאר עם מטריצה חוץ-תאית גורמת ריכוז חלבון גבוה בכל טוב. לכן, הפחת את כמות well(s) רקע (ללא תאים) כדי לקבל ריכוז חלבון התא בפועל. ריכוז חלבונים שמקורם תאים הוא נמוך בצלחת 96-ובכן תרבות. בנוסף, ריכוז חלבון יכול להשתנות לובכן בשל ציפוי מטריצה חוץ-תאית. לכן, באמצעות מספר הטלפון הנייד כדי לנרמל OCR הוא הציע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול המתואר, לבבות הם בודדו אותנו מהמתרחש הגורים neonatal יום 0. 5 x 105 תאים/גור התקבלו, cardiomyocytes היו נזרע על צפיפות של 10 x 103, 20 x 103או 30 x 103 תאים/טוב, ב- 96 טוב צלחות (איור 2 א). לאחר לילה תרבות, נמצאו cardiomyocytes מחובר היטב אל פני השטח פלסטיק מצופה והיו מעט מאוד תאים כעיגולים בצבע (התאים כעיגולים בצבע עדיין מופיע כמו עגולות ונוצצות, לעומת התאים בריאים, מצורף אשר נתפזר) (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, הקמנו פרוטוקול פשוט עבור בידוד ו culturing cardiomyocytes neonatal העכבר. באמצעות cardiomyocytes האלה, אנחנו גם אופטימיזציה התנאים כדי למדוד את קצב צריכת החמצן באמצעות מערכת מנתח השטף חוץ-תאית. הפרוטוקול מאפשר להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן בתאים העבודה העיקרי של הלב, דומה מה ניתן למדוד באיבר שלם. פרוטוקול שלנו שונה פרוטוקולים שפורסמו בעבר16,18. ראשית, כדי להשיג גבוהה הכדאיות, הגורים היחידה מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

ברצוננו להודות כל מעבדה רוס ואנשי המעבדה מרפי. עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקאי (14SDG17790005) NIH ווי. סי (HL115933, HL127806), VA ערך (BX003260) R.S.R.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטימיצין ASIGMAA8674מעכב קומפלקס III של מסננת התאים המיטוכונדריה
100 μ m נקבוביותFALCON352360כדי ללכוד רקמות לא מעוכלות
קולגנאז סוג IIוורת'ינגטוןLS004176להכנת תמיסת עיכול קולגנאז
D-גלוקוזSIGMA75351כדי להפוך את מדיום בדיקת המאמץ המיטוכודניאלי
DMEM גלוקוז גבוהטכנולוגיות חיים11965-092כדי להפוך את תרבית התאים למדיום
DMEM ללא NaHCO3, גלוקוז, פירובט, גלומנין ו-HepesSIGMAD5030-10X1Lכדי להפוך את מדיום בדיקת המאמץ המיטוכודניאלי
FCCP (קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)SIGMAC2920Unpairs נשימה מיטוכונדריאלית
סרום בקר עוברי (FBS)טכנולוגיות חיים26140-079כדי להפוך את תרבית התאים למדיום
פיברונקטין מ פלזמת בקרSIGMAF1141-5MGלהכנת תמיסת ציפוי ללוחות תרבית רקמות
מספריים עדיניםFine Sciences Tools14060-10לדיסקציה של לבבות
ג'לטין מעור חזירSIGMAG-1890להכנת תמיסת ציפוי ללוחות תרבית רקמות
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק, ללא Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVלשטוף לבבות ולהכין תמיסת עיכול ועיכול קולגנאז
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630080להכנת מדיום בדיקת מאמץ מיטוכודנריאלי
סרום סוסיםטכנולוגיות חיים26050-088להפיכת תרבית תאים למדיום
L-גלוטמיןSIGMAG-3126לייצור מדיום בדיקת מאמץ מיטוכודנריאלי
M-199Cellgro10-060-CVלהכנת מדיום תרבית תאים
כפית מוריה פישרNC9190356 מדעילשטיפת לבבות 
אוליגומיציןSIGMA75351-5MGמעכב את המיטוכונדריה ATP סינתאז
RIPA bufferפישר סיינטיפיק89900כדי ליז את התאים לבדיקת חלבון
רוטנוןSIGMAR8875מעכב קומפלקס I של המיטוכונדריה
סוסון ים XFe96 Extracellular Flux
Analyzer Agilent		מכשיר המשמש לניתוח קצב
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100חבילה של צלחות תרבית מנתח שטף, מחסניות חיישנים וקליברנט
נתרן פירובטSIGMAP2256להכנת מדיום בדיקת מאמץ מיטוכודריאלי
מספריים ישריםכלים למדעים עדינים91401-12לדיסקציה של
לבבות מסנן מזרק 0.2 μ גודללסינון סטרילי של מדיום עיכול
TrypsinUSB Corporation22715 25GMלהכנת פתרון קדם עיכול
צריכת החמצן m

מקורות

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96FCCP

מאמרים קשורים