מאמר שיטה

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקפה אלימה חיידקי גנים מוסדרים לעתים קרובות באותה רמת תעתיק על ידי גורמים רבים מגיבים לאותות סביבתיים שונים. כמה גורמים פועלים ישירות על גנים התקפה אלימה; שאחרים שולטים פתוגנזה על-ידי התאמת הביטוי של הרגולטורים במורד הזרם או ההצטברות של הסימנים שמשפיעים מווסת פעילות. אמנם תקנה נחקרה בהרחבה במהלך צמיחה במבחנה , יחסית מעט מאוד ידוע על מה גנים מותאמת במהלך זיהום. מידע זה חשוב כאשר מוצר גן מסוים הוא מועמד התערבות טיפולית. תעתיק גישות כמו RT-PCR כמותי, בזמן אמת, RNA-Seq דרכים רב עוצמה כדי לבדוק ביטוי של גנים ברמה עולמית אבל סובלים אתגרים טכניים רבים כולל שפע נמוכה של RNA חיידקי לעומת מארח ה-RNA, לדוגמה השפלה על-ידי RNases. הערכת תקנה באמצעות עיתונאים פלורסנט הוא קל יחסית, יכול להיות מרובב עם חלבונים פלורסנט עם תכונות ספקטרליות ייחודי. השיטה מאפשרת ניתוח מתא בודד, ייתכן גנים ברקמות כי התערוכה מורכבת תלת מימדי physiochemical ואדריכלות מעברי צבע המשפיעות על רשתות בקרה רגולטריות חיידקי. מידע אובד כאשר הנתונים הם בממוצע באוכלוסייה בצובר. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לכימות ביטוי גנים ב פתוגנים חיידקיים בתוך באתרו. השיטה מבוססת על עיבוד רקמות פשוטה וצפייה ישירה פלורסצנטיות מן הכתב חלבונים. נדגים את התועלת של מערכת זו על ידי בחינת הביטוי של Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), אשר המוצר ג'ין הוא הדרושים לשם התחמקות המערכת החיסונית שיתואר ex-vivo ו ויוו. אנחנו מראים את nuc-gfp מתבטא בחריפות מורסות כליות לחשוף ביטוי גנים הטרוגניות עקב בחלקו לכאורה תקנה מרחבי הפעילות יזם nuc אבצס מעורבת לגמרי עם התגובה החיסונית. השיטה ניתן ליישם כל חיידק עם מערכת גנטית manipulatable, כל דגם זיהום, מתן מידע יקר ערך עבור מחקרים פרה פיתוח תרופות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים להגיב לשינויים בתנאים פיזיולוגיים והשינויים במצב התזונתי של סביבתם בהבעת באופן שונה גנים הדרושים עבור הסתגלות והישרדות. למשל, פתוגנים אופורטוניסטים ליישב גוף משטחים-יחסית נמוך צפיפות, הם לעתים קרובות לא מזיק. עם זאת, ברגע החיידק חודר חסמים הכימי והפיסי, זה חייב להתמודד עם המארח תא החיסון הגנות נגד וזמינות מזון מוגבלת1. לדוגמה, Staphylococcus aureus והצנרות בערך שליש מאוכלוסיית asymptomatically אבל הוא גם הגורם של העור הרסנית, רקמות רכות זיהומים, דלקת עצם מוגלתית, דלקת פנים הלב, בקטרמיה2. ההצלחה של S. aureus כמו. חיידק מיוחס לעתים קרובות את הגמישות מטבולית שלה, כמו גם ארסנל של גורמים הקשורים השטח, המופרש התקפה אלימה המאפשרים החיידק להימלט למחזור הדם. וישכפלו ברקמות היקפיים 3,4,5. כי המארח למוות בשל מחלת staphylococcal היא אבולוציונית מבוי סתום ו לתחום השידור מארחים החדש6, המחויבות התקפה אלימה גורם הייצור חייב להיות נשלט היטב.

רשת רגולטוריות מורכבות של חלבונים ללא קידוד RNAs מגיב מגוון רחב של גירויים סביבתיים, לרבות תא צפיפות, שלב הצמיחה, גורמים הקשורים נויטרופילים וזמינות חומר מזין, כדי להבטיח כי התקפה אלימה גנים מבוטאים זמן מדויק ובמיקום מארח רקמות7,8,9,10,11,12,13. למשל, מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS) מסדיר ביטוי של מספר גורמים התקפה אלימה באמצעות את חיישן קינאז (SaeS), הרגולטור (SaeR) בתגובה14. SaeS הוא autophosphorylated על משקע היסטידין שנשמרת בתגובה מארח אותות (למשל, האנושי נויטרופילים פפטידים [HNPs], calprotectin)8,15,16. קבוצת phosphoryl הוא הועבר לאחר מכן שאריות אספרטט על SaeR, הפיכתו כמו חלבון ה-DNA מחייב (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S מסדיר מעל 20 גנים לתרום בפתוגנזה כולל fibronectin מחייב חלבונים (FnBPs), leukocidins ו coagulase14,18,19,20. ניתן לסווג מטרות יעדים ג'ין גבוה-זיקה ואהדה נמוכה, אשר צפויים המושרה ככל שרמת SaeR ~ P עולה כאשר הם נחשפים רמזים שלה21. הפעילות SaeR/S נשלטת על ידי הרגולטורים אחרים של ביטוי גנים כגון מערכת חישה quorum Agr, מדכא. שבולם רעלים חלבון (רוט), את פקטור סיגמה חלופה ב' (SigB)22,23,24.

nuc ג'ין התקפה אלימה Sae תלוית ב Staphylococcus aureus ו מקודד thermonuclease (Nuc), אשר חיוני עבור בריחה מן neutrophilic extracellular tראפ (רשתות), הפצת במהלך קורס של זיהום25,26. הביטוי של nuc גם בחום עקיף מודחקים מאת CodY בנוכחות חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP27, מודחקים ישירות על ידי החלבון staphylococcal הרגולטור אביזר שרה28,29 , שפעילותם היא מושפעת חמצן (מצב חמצון-חיזור) ו- pH30. בהתחשב בכך sae ו- nuc המוטציות הן הקלוש במודלים של העכבר של זיהום, יש עניין בפיתוח התערבויות כימי המעכבות שלהם26,המקביל פעילויות31. למרות זאת, אין מידע שלהם מנשר במהלך זיהום.

כתבים פלורסנט שימשו כדי לפקח ולכמת ביטוי גנים ברמה תא בודד. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לכימות S. aureus ביטוי גנים במהלך זיהום זה, כאשר יחד עם transcriptome הפרייה analysis, טכניקות הדמיה חזקה כמו הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית (MRS), יכול לחשוף כמה חיידקים פיזיולוגיה מוסדר vivo, את abundances היחסית של חומרים מזינים בתוך נישות מסוימות. השיטה ניתן ליישם כל פתוגן חיידקי עם מערכת גנטית צייתן.

סקירה של הווקטור אינטגרטיבית הגנום.

PRB4 וקטור אינטגרטיבית הגנום מכיל 500 בסיסים כל אחד מהאזורים ויוצאת של פסאודוגן S. aureus USA300 SAUSA300_0087 כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית. pRB4 נגזרת עמוד השדרה וקטור הרגיש pMAD המכילות את קלטת ההתנגדות אריתרומיצין (ermC) ואת הגן ביתא thermostable-galactosidase bgaB להקרנה כחול/לבן של ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים32. הבונה כתב מהונדס מכיל גם סמן ההתנגדות כלורמפניקול (חתול) לבחירה לאחר הגנום אינטגרציה פלסמיד חיסול, כמו גם אתרי EcoRI ולא מרק פורטנוי שתתיך האזור רגולטוריות לעניין superfolder ירוק חלבון פלואורסצנטי (sGFP) (איור 1). ידוע כי הבחירה של אתר קישור הריבוזום (RBS) משפיע על הפעילות של הכתב, לעיתים קרובות דורש אופטימיזציה אמפירי33. לפיכך, ה-RBS לא מסופק. כאן, באתר איגוד של ריבוזום יליד משמש כדי לספק עבור תבנית יותר טבעי של ביטוי גנים, אך באתרים אחרים עשוי לשמש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ג'ורג'טאון.

1. דור של המתח כתב פלורסנט

  1. לעכל את הווקטור pRB4 אינטגרטיבית הגנום ברצף עם אנזימי הגבלה EcoRI, מרק פורטנוי. הפרוטוקול של היצרן, להגדיר לילה עיכול עם מרק פורטנוי בעזרת µg 1 של pRB4 ב- 25 ° C, ולאחר מכן המשך עם העיכול השני עבור h 1 ב 37 ° C על-ידי הוספת EcoRI לתערובת התגובה. בטל האנזימים מאת המקננת ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. PCR להגביר את האזור הרגולציה של עניין מ- DNA גנומי (במקרה זה, זוג בסיסים ~ 350 DNA רסיס המכיל את האזור יזם thermonuclease [nuc]), שילוב 5' EcoRI הגבלת אתר ואתר 3' מרק פורטנוי ההגבלה. הרצף זיהוי מרק פורטנוי חייב להיות במסגרת עם codon translational התחלה. במחקר זה, ה-PCR בוצעה באמצעות פריימר לפנים oRB015 אמינות גבוהה DNA פולימראז בהתאם להמלצות היצרן (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') הפוכה (פריימר oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). הטמפרטורה מחזק היתה 53 ° C. לטהר את המקטע הנוצרת בעזרת ערכת ניקיון PCR ההוראות של היצרן.
  3. לעכל ובמוצר PCR עם EcoRI, מרק פורטנוי כפי שבוצע בשלב 1.1, מאתרים ומפסיקים את המקטע דנ א מתעכל לאתרים זהה של pRB4 באמצעות T4 DNA ליגאז המומלצים ע י היצרן לייצר הבונה אינטגרטיבית. להציג את התערובת מצדו לתוך החיידק ואשר לבנות רצף.
  4. Electroporate הבונה לתוך S. aureus זן RN4220 תיאר כאמור34. בקצרה, להשתמש µg 1 של פלסמיד עם 70 µL של תאים אלקטרו-מוסמך (100 Ω, 25 µF, ו- 2.3 kV) ב- B2 מרק (1% [w/v] קזאין hydrolysate, 2.5% [w/v] תמצית שמרים, 2.5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K2PO4, 0.5% [w/v] גלוקוז). בחרו ' ההתנגדות אריתרומיצין (אמר) בטמפרטורה מתירניות (30 ° C) על אגר סויה tryptic (TSA) בתוספת אריתרומיצין (5 µg מ ל-1) ו 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל; µg 80 מ ל-1). Transformants וכתוצאה מכך הם כחול בגלל פעילות β-galactosidase פלסמיד מקודד.
    הערה: העברה של ה-DNA לתוך מבודד קלינית קשה מאוד עקב מכשול הגבלה חזקה-שינוי35 לפיכך, RN4220 S. aureus שימש נמען ביניים של הבונה פיוז'ן כי זה הגבלת לקוי ולא מאוד מודולרי.
  5. העברה פלסמיד S. aureus זן USA300 עניין באמצעות אלקטרופורציה או התמרה חושית בתיווך phage36 בטמפרטורה מתירניות. בקצרה, להפיץ באופן כללי11 bacteriophage חלקיקים על המתח התורם באמצעות לוחות TSA המכיל 5 מ מ CaCl2 לילה ב 30 ° C ולאחר מכן לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר אצטט תאית. השתמש lysates כדי מגלי S. aureus זן LAC ל Emr.
    הערה: לאק נמצא בידוד קליניים בשימוש נרחב שנעשה בעבר Em רגיש על ידי מעבר סדרתי במדיום TSB לרפא את המתח של pUSA03 פלסמיד מקורי זה מקנה Emr 37,38.
  6. שילוב הבונה על ידי שני, אירועים רצופים רקומבינציה הומולוגית כרומוזום כפי שתואר לעיל32. ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים הם עמידים כלורמפניקול (ס מr) על צלחות TSA המכיל μg 5 מ ל-1 כלורמפניקול, אריתרומיצין, רגישים (Erms) וכחול עוד אין.
    הערה: כאשר הדבר אפשרי, מחדש מציגים הפיוז'ן מסומן לתוך USA300 ויה בתיווך phage התמרה חושית כדי למנוע הצטברות מוטציות המשויך זן מתורבת מעבר39 ואת הטמפרטורה משמרות.

2. בעלי חיים זיהום: הכנה של Inoculum, זיהום סיסטמי, עיבוד רקמות

  1. הכנה של חיידקי inoculum
    1. פסים S. aureus זנים של עניין בידוד על אגר דם צלחות של מניה גליצרול קפוא. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 h לאשר פנוטיפים היילוד בהתבסס על היכולת שלהם lyse תאי דם אדומים (RBCs) ונקה טופס אזורים שקופים.
    2. ליזום תרבויות לילה על ידי מזריקים מושבות יחיד של כל זן 4 מ ל מרק סויה tryptic (TSB) צינורות זכוכית סטריליים. לסובב את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 h בגלגלת צינור שוכן בגובה כ זווית 70° ו- 70 סיבובים לדקה [RPM].
    3. להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של התרבויות מהשלב 2.1.2. להשתמש בבסיס, אמצעי סטרילי הפניה אופטי (ריק). לדלל לתאים אלו יתר600 של 0.05 ב 25 מ של עקר Tryptic סויה מרק (TSB) נפרדים, 125 מ ל DeLong מבחנות (5:1 הבקבוק יחס נפח), דגירה תרבויות באמבט מים (עבור המתאים להעברת חום התרבויות), רועד ב 280 RPM והגדר 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: צמיחה של inoculum יכולה להתבצע בדרכים שונות; אחת השיטות לגידול תאים לשלב מעריכי מוצג. בכל מקרה, חשוב באופן עקבי להשתמש באותה השיטה להכנת תאי חיסון.
    4. בבית יתר600 ~ 1, מחדש לדלל את התאים לתוך בינוני טריים ההתחלה OD600 של 0.05 כדי להבטיח שהתאים להשיג שלב מעריכי כי גורמים המצטבר במהלך הדגירה לילה שיצומצם לרמות שלב מעריכית.
    5. לקצור את התאים בשלב מעריכית (OD600 ~0.6–0.8) על ידי צריך שתוציאו ב 3000 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף את החבילות פעמיים בהיקף שווה ערך של עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; pH 7.4).
    7. להשעות את התאים 1 x PBS (pH 7.4) כדי ריכוז של המושבה8 עונה 1 פרק 10 ויוצרים יחידות (CFUs) מ ל-1 או לפי הצורך הרצוי הניסוי.
      הערה: זה חשוב לקבוע את היחס בין OD600 מ"ל CFU-1 עבור כל זן של עניין מאחר שינויים תלויי-מתח של תא גודל וצורה יכולים להשפיע על מאפייני פיזור אור, ובסופו של דבר, מינון זיהום.
  2. הכנה של בעלי חיים, זיהום חיידקי
    1. חבל עכברים במשך 7 ימים בדיאטה מטוהרים לימור-93. הדיאטה מנוסחת לספק תזונה נאותה תוך צמצום רקמות אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית הקשורה לצריכת של מרכיבים על בסיס צמחי בשימוש בעכבר רגיל צ'או40.
      הערה: C57/BL6 הנשי עכברים (בן 6-8 שבועות) משמשים כאן, אבל העכבר זן ומין תלויות המחקר.
    2. לפני ההדבקה, להתרחב ורידים זנב העכבר עם מים פושרים.
    3. להדביק בעלי חיים על ידי שהזרקת µL 100 של inoculum חיידקי דרך הזנב-ורידים לייצר זיהום מערכתי. לשמור על aliquot של inoculum הראשונית אם ביצוע cytometry זרימה (ראה סעיף 4).
    4. יפקח חיות מדי יום ולהעריך את מצב הבריאות שלהם באמצעות מערכת ניטור נבדקו ואושרו על-ידי אחד אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.
    5. לאפשר הזיהום על התקדמות עבור משך הזמן הרצוי. . הנה, הניסויים הם הסתיים 3 ימים לאחר הפגיעה.
      הערה: בתנאים אלה, מורסות מורכבות של קהילה האבצס staphylococcal של חיידקים, המוקפים משקעי פיברין, ומוקף שכבות קונצנטריות של תאים חיסוניים5,41.
  3. קצירת איברים ועיבוד רקמה
    1. המתת חסד החיות על ידי שאיפת2 CO נקע בצוואר הרחם כשיטה משנית ולבצע necropsy.
    2. הקציר כליות (מימין) ואיברים חיוניים אחרים (לב, כבד, ריאות, טחול), להעביר לתוך צינורות פוליפרופילן 15 מ"ל, המכיל 10% [וי/v] buffered פורמלין. להמשיך עם האיברים האלה לצעוד 2.3.4 להלן.
    3. להעביר את הכליה השמאלית צינור באימפקט mL 2 סטרילי המכיל ~ 500 µL של חרוזים סיליקה 2 מ מ, PBS עקר 1 x 1 מ"ל (pH 7.4). המשך עם איבר זה לשלב 4.2.
    4. לאפשר איברים מ שלב 2.3.2 לתקן בחושך בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים או רוטציה לפחות 24 שעות אך לא יותר מ- 48 שעות.
    5. להטביע את האיברים ברקמת ברור קפוא בינוני ולאחסן את הרקמות ב-80 מעלות צלזיוס.
    6. באמצעות a cryostat, בסעיף רקמות לפרוסות של עובי 10 מיקרומטר.
    7. יבש הסעיפים בשקופית זכוכית נקי מראש, טעונה כעשרים דקות בחשכה, להחיל בינוני קשה הרכבה עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) הכתם, ולהחיל coverslip. לרפא את השקופית הממוסגרת בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ולהעביר עד 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.

3. סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית ועיבוד תמונה לייזר

  1. בדוק השקופית הממוסגרת לאיתור נגעים באמצעות לייזרים המתאים עבור הכתבת פלורסנט בשימוש. התיק הזה, ירוק (GFP), אדום (tdTomato), וכן כחול קרינה פלואורסצנטית (דאפי) משמשים אותות.
  2. לרכוש את התמונה באמצעות המטרה המתאימה ליצירת אפקטים של תאים בודדים (למשל, בדרך כלל 20 x או 40 מטרות x משמשות).
  3. למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של תמונות קונפוקלי.
    1. פתחו את התמונה קונאפוקלית ב J התמונה ולהתאים בהירות/ניגודיות כראוי להמחיש את האות זריחה של הנגע.
    2. להגדיר את האזור של עניין, ועל -ידי שימוש באפשרות קביעת סף , מציבה את הגבולות פלורסצנטיות העליון והתחתון לפי הצורך.
    3. להגדיר את centroid על-ידי בחירה אזור ← הערך הממוצע אפור ← Centroid ← להגביל לסף תחת הכרטיסיה ניתוח תמונה ג'
    4. תמצית בערך העוצמה זריחה centroid או למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ב פגיעה נתון ליחידת שטח (עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע, MFI) עבור ה-GFP ו- tdTomato. . הנה, שימשו תחומי מיקרומטר אחד2 .
      הערה: ניתוח השני עיוור ממזער הטיה כאשר זהותו של המדגם ידוע.
    5. התווית הנתונים ולבצע את הבדיקות הסטטיסטיות המתאימות עבור כל השוואה.

4. לזרום Cytometry ניתוח

  1. (אופציונלי) לקבוע ודוקטורנט של inoculum ביום של הזיהום (מתוך בסעיף 2.2.3)
    1. כדי µL 899 של 1 x PBS סטרילי (pH 7.4) להוסיף 100 µL של כל inoculum, 1 µL של חומצות גרעין permeant ממברנה כתם (ראה טבלה של חומרים). כפקד, הקפד לכלול דוגמה חסר הכתם חומצת גרעין.
    2. מבצע cytometry זרימה כל הדגימות.
      הערה: עבור הניסוי הראשון, זה שימושי לכלול פקד וקטור היחידה עבור הפיוז'ן עניין כדי לקבוע את המתח ראוי לשימוש. הפרדה ברורה בין דגימות חיוביות ושליליות הוא חיוני עבור ניתוח נתונים, המציינת את הכתב הוא מעל האות רקע.
    3. כדי לזהות את אוכלוסיית חיידקים, מגרש אירועים באמצעות חומצות גרעין כתם (ציר y) והעבירו פיזור (ציר x).
    4. לצייר דרך שער הכללה סביב אירועים שתי חומצות גרעין כתם חיובית ואת הגודל הנכון של החיידק בהתבסס על הפיזור קדמי (בין 0.5 ל 2.0 מיקרומטר עבור S. aureus).
      הערה: להיות קפדני בעת זיהוי אוכלוסייה זו כפי שהוא קריטי כדי לכלול אירועים בבירור בתוך הפרמטרים האלה. ודא ששער זה אינו כולל כל האירועים עבור הפקדים שלילי בתנאים אחרים. במחקר זה, בערך 70% האוכלוסייה תא פגש את דרישות אלה בניתוח.
  2. ניתוח של דגימות רקמה לאחר ההקרבה:
    1. המתת חסד החיות לקצור את הכליות השמאלי (ראה שלב 2.3), העברת לתוך חרוז-מכות צינורות המכיל 1 מ ל 1 x PBS סטרילי (pH 7.4), 250 µL של 2 מ מ בורוסיליקט חרוזים.
    2. לשבש את רקמות לשחרר תאים חיידקיים. כליות, להשתמש מהמגן כדי לשבש את התאים. כאן, שלוש 30 s לפרצי ב 6800 סל ד עם 1 דקות קירור תקופות על קרח רטוב בין מחזורי שימשו כדי למזער את דגימות חימום.
    3. צניפה ההריסות רקמות גדולות יותר על-ידי צריך שתוציאו ב x 250 g למשך 3 דקות ב- microcentrifuge שולחן מקורר עד 4 ° C.
      הערה: בדרך כלל, יש גלולה תא בתחתית הצינורית ושכבה של פסולת צפים למעלה. השכבה האמצעית מימית מכיל תאים חיידקיים.
    4. העברת 10 µL מהשכבה מימית לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 נקי המכיל 1 µL של חומצות גרעין כתם בשנת 989 µL ל- PBS (נפח כולל 1 מ"ל).
    5. לבצע cytometry זרימה באמצעות רכישת נתונים אותם פרמטרים של gating באשר inocula הראשוני.
      הערה: ספירת חיידקים תהיה נמוכה כי המדגם בעיקר מכילה פסולת רקמות. ניתן להשתמש באפשרות "שער חיים" גם אם התאים נמצאים הכתם חומצת גרעין חיובי, ממותגת גודל כאשר הנתונים נטענים לתוך היישום. זה יעזור גם כדי לנתח יותר של האירועים במטרה להקטין את גודל הקובץ. כמעט מיליון אירועים עבור דגימה נספרים, אך נחשב אירוע נוסף עשוי להיות נחוץ בהתאם לחומרת הזיהום ולגודל של רקמות מנותח.
    6. ניתוח נתונים: לקבוע מתכוון פלורסנט בעוצמה (MFI) על כל fluorophore במדגם נתון באמצעות השערים הכללה נקבע בסעיף 4.1.4. לנרמל את דגימות זרימה בתוכנת ניתוח אירוע ספירות. 10,000 ספירות הן בדרך כלל מספקות הניתוח.
      הערה: . זה לא נדיר למצוא דוגמאות המכילים פחות ממספר אירועים מאחר וזה תלוי סיכון היווצרות ולדלקת מורסה. שימוש בגישה זו, 500-40,000 אירועים נמצאים בדרך כלל בתוך הרקמה הנגועה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו על פלסמיד נגזר pMAD32 שיכולים לספק שום כתב פיוז'ן לבנות לתוך הכרומוזום מאת רקומבינציה הומולוגית מוצלב כפול (איור 1). מבנה זה מאפשר ניתוח כמותי בכל אזור רגולטורית שתומכת הייצור של חלבון ה-GFP ושידור פלורסנט מעל הרקע. פלסמיד מקנה עמידות אמפיצילין (Apr) עבור תחזוקה והתפשטות ב e. coli ו מקנה עמידות אריתרומיצין (אמר) ב- S. aureus. הבונה גם מקנה כלורמפניקול ההתנגדות (ס מr), אשר מאפשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות זיהומיות חיידקים הם בעיה בריאות גדל והולך ברחבי העולם עקב הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה גורמים46. בגלל הסתגלות לסביבות מארח חיונית לצמיחה ההישרדות במהלך זיהום, אסטרטגיות מיקוד תוכניות ביטוי גנים המגבירים את הפתוגן כושר יוכיח שימושי רפואית. אחת מהתכניות היא ערכה של גנים נשלט על ידי מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS), שהוצג בעבר כדי לשחק תפקיד חיוני התחמקות המערכת החיסונית47. SaeR/S הנגרמת על ידי מגוון של גורמים, בעיקר אלה הקשורים נויטרופילים8,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אלכסנדר Horswill על המתנה של PsarAP1- tdTomato פיוז'ן, וכן קרן קרסוול לעזרה עם ניתוח cytometry זרימה. אנו מודים גם המלך אליסה לקבלת ייעוץ על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי פרס מחקר Exploratory/התפתחותית NIH (גרנט AI123708) וקרנות הפעלה סגל כדי SRB. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, פרשנות או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5% דם כבשיםHardy Diagnostics (סנטה מריה, קליפורניה)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 עכבריםצ'ארלס ריברNA
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C-0378
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissNA
cryostat microtomeThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (קורלוויל, איווה)NA
DNA Ligaseניו אינגלנד BiolabsM0202S
אריתרומיציןסיגמא-אולדריץ'E5389
מנתח זרימהבקטון דיקינסוןNA
חרוזי זכוכיתסיגמאZ273627
Miniprep, פלסמידPromegaA1220
אמבט מים רועד מסלוליניו ברונסוויק InnovaNA
טיהור PCRQIagen28106
מאגר פוספט מלח (PBS)Cellgrow46-013-CM
קורא צלחותTecanNA
Precellys 24 הומוגנייזרמעבדות ברטיןNA
pUC57-KanGenScript (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי)NA
Q5 Taq DNA פולימראזניו אינגלנד ביולאבס (איפסוויץ', MA)M0491S
אנזימי הגבלה חדשים אנגליה ביולאבס (איפסוויץ', מסצ'וסטסR0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
טרנסקריפטאז הפוךניו אינגלנד BioLabsE6300L
Sanger SequericingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero מדיום הקפאת רקמות שקופותמרצדס מדיקלMER5000
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
סופרלופGE Lifesciences18111382
מזרק, מסנןVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351כתם חומצת גרעין ממברנה
טטרציקליןSigma-AldrichT7660
מרק סויה טריפטיVWR90000-376
ספקטרופוטומטר גלוי UVבקמן קולטר-DU350NA
מדיום הרכבה Vectashield Antifade עם DAPIVector LaboratoriesH-1500
)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescent Reporter AssayConfocal MicroscopyFlow CytometryStaphylococcus aureusTissue SectioningFluorescence Intensity MeasurementSpatial Gene ExpressionIn Situ AnalysisGFP Fusion Protein

מאמרים קשורים