מאמר שיטה

הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

DOI:

10.3791/59068

⸱

26 בינואר 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים את פרוטוקול לבנות מעבורות מולקולרית, היכן חלבונים מנוע קינזין דבקה משטח להניע microtubules צבען מתויג. אינטראקציות חלשות של kinesins עם המשטח מאפשר ההחזקה הפיך שלהם אליו. זה יוצר מערכת ננו אשר מוצגים דינמי הרכבה ופירוק של מרכיביו תוך שמירה על הפונקציונליות שלו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מאפיק קינזין הסעות מולקולרית עם קובץ מצורף חלשים ובלתי הפיך של kinesins השטח. בניגוד פרוטוקולים הקודמים, במערכת זו, microtubules לגייס מהחלבונים מנוע קינזין הפתרון ולמקם אותם על משטח. Kinesins, בתורו, יקל את לגלש של microtubules לאורך פני השטח לפני desorbing חזרה אל הפתרון בתפזורת, ובכך להיות זמין בכדי להתגייס שוב. זה מתמשך הרכבה ופירוק מוביל בולט התנהגות דינמית במערכת, כגון היווצרות של שבילים קינזין זמני על ידי גלישה microtubules.

מספר שיטות נסיוניות יתוארו לאורך כל הניסוי הזה: ספקטרופוטומטר UV-Vis ישמש כדי לקבוע הריכוז של פתרונות מניות של ריאגנטים, coverslips יהיה קודם האוזון, אולטרה סגול (UV) התייחסו ולאחר מכן silanized לפני נטענת לתוך תאי זרימה, זריחה גמורה מיקרוסקופ (TIRF) שישמש בו-זמנית בתמונה קינזין מוטורס microtubule חוטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציות המסדירים את אופן הפעולה של פעיל nanosystems תמיד יש מתאפיינת מאריכים, כמעט בלתי הפיך אג ח1,2,3,4,5,6 7, ,8. דוגמה למד היטב של זה היא מערכת microtubule-קינזין, איפה הדאייה microtubules מונעות על ידי בלתי הפיך משטח מכורך קינזין מוטורס1,2,3,4, 5. מערכות שבו הרכיבים הפיכה מחוברים אחד לשני כבר למד באופן תיאורטי9,10 , בתאריך11,macroscale12, אך קנה מידה של מערכות אלה למטה ננו כבר מאתגר. אחת הסיבות המרכזיות לכך היא שבירת הזה, רפורמה הקשרים בין רכיבי לעיתים קרובות דורשת שינוי גדול בתנאי הסביבה. למרות שינויים אלו יושמו14,13,האחרונות15, הם סומכים על שינוי המערכת עצמה ולא על התאמתה לסביבה שלה. תכנון מערכות בקנה מידה מולקולרי שבו הרכיבים ללא הרף להרכיב ולארגן לתוך מבנים מבלי להפריע לסביבה הכוללת שבה מתקיימים הניסויים יפתח את הדלת אל חקר מגוון רחב של התנהגויות דינמיות 16 , 17.

כאן, אנו מתארים ומדגימים את פרוטוקול מפורט ליצירה באופן דינמי וההספק של פירוק מערכת תפקוד ננו. את המערכת ואת כללי ההתנהגות שלה כבר הציג קודמת18: חוטים microtubule מונעות על ידי רצועות של הפיכה במשטח מכורך קינזין-1 מוטורס. חלבונים אלה קינזין מוטוריים הן גויסו הפתרון כדי לסייע להניע microtubules לפנים, לפני desorbing שוב זמן קצר לאחר מכן. לאחר חזרה בפתרון, הם יכול להיות גויסו שוב כדי להניע microtubule חדש. העבר13,14,15, מבזק, רפורמה של איגרות החוב הנדרש שינויים סביבתיים; לעומת זאת, הסביבה של התא הזרימה שלנו יישאר ללא שינוי, בעוד לרוורס קינזין אינטראקציה עם פני השטח.

פרוטוקול זה יעזור גם לחוקרים (1) להמחיש את כל השלבים של הפרוטוקול, ו- (2) לסייע בפתרון בעיות מסוג זה וזמינותו. אותו יש כבר נגזר בהליכים המתוארים תחת הווארד et al. 199319.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון הכנה

התראה: שלושה ריאגנטים בשימוש פרוטוקול זה (טולואן, dimethyldichlorosilane ו dithiothreitol) נמצאים רעיל מאוד. נא עיין גליונות נתונים בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. יתר על כן, חלקים של פרוטוקול זה צריך להתבצע תחת רמה גבוהה יותר של הגנה, לובש בטיחות משקפיים, שני זוגות כפפות מגן כמצוין. אלא אם אחרת, שימו לב, ניתן לבצע את הניסויים על ספסלים המעבדה תוך שימוש כל את המתאים ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, באורך מלא מכנסיים ונעליים סגורות).

הערה: ריכוז של ATP, קינזין, microtubules כי נמצאים בשימוש פרוטוקול זה יכול להיות שונה ניתנה על הצרכים של כל ניסוי. עם זאת, אם שינוי, נא ודא כי ריכוז סופי נוגדנים אחרים נשארים זהים שניתנו להלן. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר, (~ 25 ° C).

  1. אופן ההכנה של פתרונות מניות
    הערה: להכין, aliquot הפתרונות הבאים מראש. ניתן להכין כל aliquots בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C).
    1. מאגר BRB80
      הערה: המאגר עבור רוב הפתרונות בשימוש פרוטוקול זה הוא BRB80. BRB80 יכול להיות מוכן בכמויות גדולות ומאוחסנים במקפיא-20 ° C.
      1. להמיס 24.2 g של piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (צינורות) 3.1 גרם אשלגן הידרוקסידי (KOH) ב- 800 מ ל מים יונים לעשות 800 מ של צינורות 100 מ מ. להוסיף 100 מ של 10 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), 100 מ של 10 מ מ אתילן גליקול tetraacetic חומצה (EGTA) כדי לקבל נפח סופי של 1 ל' להרים ה-pH 8 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH) יכול לעזור להיעלמותו של צינורות, EGTA.
        הערה: ריכוזי כימיקלים במאגר BRB80 הסופי הם צינורות 80 מ מ, מ מ 1 MgCl2ו- 1 מ מ EGTA.
      2. התאם את רמת החומציות של המאגר כדי 6.9 באמצעות קו וחומצת מימן כלורי (HCl).
    2. ATP
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 100 מ מ ATP במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-80 ° C.
    3. GTP
      1. להכין פתרון μL 500 של 25 מ מ GTP במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 5 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-80 ° C.
    4. MgCl2
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 100 מ מ MgCl2 במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    5. קזאין
      1. שוקל 1 גר' קזאין יבש, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. להוסיף 35 מ של מאגר BRB80 צינור כדי להמיס את האבקה קזאין.
      2. מקם את הפתרון לוליין בחדר קר להתמוסס במשך הלילה. בשלב זה, הפתרון ייראה צמיגה ועבה.
      3. להשאיר את הצינור זקוף במקרר 4 ° C כדי לאפשר כל גושים גדולים undissolved להתיישב. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
      4. לסובב את הצינור ומפרידה ב x 1,000 g ל הצניפה החוצה יותר פוחת משקעים. שוב, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
      5. שוב ושוב לסנן את הפתרון באמצעות מסננים μm (7 אטמוספרות המרבי) 0.2. הפתרון להיות עבה, מסננים רבים לקבל סתומים אז חזור על שלב זה עד המסנן נקי, מתפנה.
      6. לקבוע את הריכוז קזאין בפתרון הנוצרת באמצעות ספקטרופוטומטר UV/וויס, באמצעות מקדם הכחדה של קזאין של 19 מ מ-1∙cm-1 ב 280 nm20. בהנחה משקל מולקולרי של 23 kDa לנוכחות קזאין, לדלל את הפתרון ריכוז של mg∙mL 20-1 ב- BRB80.
      7. Pipet הפתרון לתוך 20 μL aliquots ולאחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    6. D-גלוקוז
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 2 מ' ד'-גלוקוז במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    7. גלוקוז אוקסידאז
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 20 mg∙mL-1 גלוקוז אוקסידאז ב- BRB80. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    8. קטלאז
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 0.8 קטלאז-1 mg∙mL ב BRB80. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      הערה: מאז DTT הוא הפכפך מעט רעילים, נא בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume.
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 1 מ' DTT מדולל במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    10. פקליטקסל
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 1 מ מ פקליטקסל מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    11. דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)
      הערה: דימתיל סולפוקסיד שימוש בניסויים אלה הוא טהור.
      1. Pipet 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד טהור לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    12. קריאטין פוספט
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 0.2 מ' קראטין פוספט במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    13. קריאטין phosphokinase
      1. להכין פתרון 1 מ"ל של 200 units· L-1 קריאטין phosphokinase במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C.
    14. (II) ניקל סולפט
      1. הכנת 500 מ"ל של פתרון של 50 מ מ ניקל (II) סולפט במים הנדסה גנטית. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C).
    15. פתרון Poly(ethylene glycol)-בלוק-poly(propylene glycol)-בלוק-poly(ethylene glycol) (פג-PPG-יתד)
      1. שוקלים לצאת 2 מ ג של פג-PPG-יתד (משקל מולקולרי ממוצע מספר: 14,600 g∙mol-1)-נ. ת. אבקה על שקילה נייר. פג-PPG-פג-נ הוא קופולימר triblock functionalized עם קבוצת nitrilotriacetic (נ) חומצה. עיין בטבלה של חומרים לקבלת פרטים נוספים אודות פג-PPG-פג-נ. ת.
      2. להעביר את האבקה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון סולפט ניקל (II) מניות ברכבת התחתית. מערבולת עד אבקה היא התפרקה ובתצורות גלוי לא נשארים.
      3. חנות עד לחודש בטמפרטורת החדר.
  2. לפני תחילת הניסוי
    1. למלא דלי עם קרח.
    2. לקחת aliquot אחד מכל אחת ריאגנטים 13 שמתואר בסעיפים 1.1.1 כדי 1.1.13 מעל ולהוסיף אותן לדלי, ובכך להשאיר אותם על קרח. הפשרת כל אחד ריאגנטים לפני השימוש.
  3. הכנה microtubule
    הערה: Microtubules היו polymerized מ aliquot 20 μg של התווית על-ידי צבע טובולין lyophilized. אורך הגל עירור של לצבוע היא של 647 ננומטר.
    1. הכנת המאגר צמיחה microtubule
      1. Pipet 21.8 μL BRB80 מאגר לתוך microcentrifuge קטן (0.6 מ"ל) הצינור. להוסיף 1 μL של הפתרון מניות של2 MgCl, 1 μL של הפתרון מניות GTP ו- 1.2 μL של הפתרון מניות דימתיל סולפוקסיד.
        הערה: כך, ריכוזי הסופי ריאגנטים במאגר BRB80 הם 4 מ מ MgCl2, 1 מ"מ GTP ו 5% (v/v) דימתיל סולפוקסיד.
    2. Microtubule פלמור
      1. להוסיף μL 6.25 microtubule צמיחה המאגר ישירות לתוך aliquot 20 μg של טובולין lyophilized עם תוויות. מערבולת aliquot עבור 5 s ב 30 rps.
      2. להתקרר את aliquot על הקרח במשך 5 דקות לפני המקננת זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות והמשך סעיף 1.3.3.
    3. Microtubule מייצב
      1. להוסיף 5 μL של הפתרון פקליטקסל aliquoted μL 490 מאגר BRB80. מערבולת הפתרון עבור 10 s ב 30 rps.
      2. לאחר 45 min של דגירה עבור microtubules למעלה, להוסיף 5 μL של הפתרון polymerized microtubule הפתרון BRB80/פקליטקסל.
        הערה: פתרון microtubule מדולל, התייצב, 100-fold זה להיות ןלהל MT100. ניתן להשתמש עד 5 ימים, זה יכול להיות מדולל כדי להשיג צפיפות microtubule הרצויה עבור כל ניסוי.
  4. תנועתיות פתרון
    1. Antifade אנזימטיות, ATP נוצר מחדש מערכת ו- ATP
      1. להוסיף μL 9.0 של הפתרון קזאין aliquoted μL 291 מאגר BRB80.
      2. אם ריכוז ATP הרצוי עבור הניסוי הוא נמוך מ 1 מ"מ, pipet 83 μL של הפתרון BRB80/קזאין לתוך צינור microcentrifuge החדש של 0.6 מ"ל. אחרת, pipet 85 μL של פתרון זה לתוך צינור microcentrifuge החדש של 0.6 מ"ל.
      3. להוסיף 1 μL של D-גלוקוז, 1 μL של גלוקוז אוקסידאז, μL 1 של קטלאז μL 1 של DTT השפופרת הזאת.
        הערה: כימיקלים אלה מהווים אנזימטי של קוקטייל antifade21 תפחית photobleaching על-ידי הסרת התפרקה רדיקלים תגובתי חמצן, שכבתה. זה מפחית התפוררות photobleaching ו microtubule הנגרמת על ידי ההארה עירור במהלך פלורסצנטיות הדמיה22,23.
      4. לניסויים שבהם ריכוז ATP הוא נבחר להיות נמוך משמעותית מאשר 1 מ מ, להוסיף ריאגנטים הבאים את הפתרון ליצירת מערכת ATP-רגנרציה: 1 μL של הפתרון aliquoted קראטין פוספט, μL 1 של קריאטין aliquoted פתרון phosphokinase.
      5. להוסיף 1 μL של הפתרון ATP מניות הפתרון תנועתיות. פליק או מערבולת aliquot למשל הפצת הכימיקלים.
        הערה: כך, הריכוז הסופי של כימיקלים בפתרון הם 10 μM פקליטקסל, 0.5 mg·mL− 1 קזאין, 20 מ מ D-גלוקוז, 200 μg·mL− 1 גלוקוז אוקסידאז, 8 μg·mL− 1 קטלאז, dithiothreitol 10 מ מ, 2 מ מ קריאטין פוספט (אם נוסף), 2 units· L− 1 קריאטין phosphokinase (אם נוסף), 1 מ מ ATP. פתרון זה להיות ןלהל הפתרון תנועתיות.
    2. קינזין
      הערה: הפתרון קינזין מניות שימוש בניסויים אלה שהוכנו על ידי G. Bachand במרכז על ננוטכנולוגיה משולב במעבדות סנדיה הלאומי והוא זמין תחת הסכם המשתמש (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php)-המאגר המשמש כאן מורכב 40 מ מ imidazole, 300 מ"מ NaCl, 0.76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 סוכרוז, 0.2 מ מ TCEP ו 50 μM מ ג-ATP. עבור סדרת ניסויים, שימש הבונה קינזין rkin430eGFP. . זה קינזין המורכב מחומצות האמינו תחילה 430 של עכברוש קינזין שרשרת כבדה דבוקה eGFP ותג C-מסוף שלו-התחום הזנב24... זה בא לידי ביטוי ב- Escherichia coli ו לטהר על-ידי עמודה Ni−NTA. הריכוז של הפתרון מניות GFP-קינזין היה 1.8 μM ± 0.3 כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר UV/וויס, באמצעות מקדם הכחדה של GFP של 55 מ מ-1·cm-1 nm 48925, לוקח בחשבון את קינזין דיימר.
      1. לקבוע קינזין הרצוי ריכוז או משטח הצפיפות של הניסוי. עבור מבחני טיפוסי, הריכוז הזה הוא 20 ננומטר. אם ריכוז קינזין צריך לדלל יותר hundred-fold, למהול אותו בריכוז של BRB80 המכילה 0.5 mg·mL-1 של קזאין.
      2. להוסיף 1 µL של פתרון קינזין הפתרון תנועתיות כדי לקבל ריכוז סופי של 20 שנהנתם ננומטר.
    3. Microtubules
      1. להוסיף 10 μL של הפתרון MT100 מוכן בסעיף 1.3 לפתרון של תנועתיות.
        הערה: פתרון תנועתיות זה יכול לשמש עד 3 שעות. לאחר מכן, מערכת antifade מאבדת את האפקטיביות שלה מפני שהגלוקוז בפתרון תיגמר על ידי התגובה אנזימטיות.

2. בניית תאי זרימה

  1. לשטוף את coverslips
    1. עבור תאים זרימה, השתמש coverslip גדול (ממד: 60 מ"מ x 25 מ"מ) וקטן (מידות: 22 מ"מ x 22 מ"מ)19.
    2. לשטוף כל coverslips פעמיים עם אתנול, פעמיים עם מים הנדסה גנטית. Sonicate על coverslips במים הנדסה גנטית עבור 5 דק לייבש אותם בתנור בטמפרטורה של 50-75 מעלות צלזיוס.
    3. באמצעות UV/אוזון מנקה (ראה טבלה של חומרים , הוראות היצרן), לטיפול בצד אחד של כל coverslip במשך 15 דקות לבצע שלב זה ניתן בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C), במצב נורמלי אטמוספרי (לחץ של 1 atm).
    4. בזהירות להפוך כל coverslip על הצד השני שלו (באמצעות פינצטה), UV/אוזון להתייחס גם את הצד הזה.
    5. Sonicate על coverslips במים הנדסה גנטית שוב למשך 5 דקות לפני ייבוש אותם שוב בתנור בטמפרטורה של 50-75 מעלות צלזיוס.
  2. בטיפול על coverslips כדי לאפשר ציפוי פג-PPG-יתד
    הערה: את dimethyldichlorosilane, את טולואן להשתמש בחלק זה של הפרוטוקול להיות רעיל מאוד, בצע את השלבים הבאים ברדס fume, בעודם סופגים את אמצעי הזהירות הבאים: ללבוש שני זוגות כפפות מגן וחולצה עם שרוולים ארוכים תחת במעבדה שלהם את המעיל. מתיחת הקצוות של הכפפות פנימה השרוולים של החולצה כך אין העור מן האמות חשוף ישירות הכימיקלים במקרה של דליפה. משקפיים מגן.
    1. לדלל 25 מ של dimethyldichlorosilane טהור ב- 475 מ של טולואן. לטבול כל coverslip ב הפתרון dimethyldichlorosilane, טולואן למשך 15 שניות.
    2. לשטוף את coverslips פעמיים טולואן, שלוש פעמים מתנול. יבש את coverslips באמצעות חנקן בלחץ.
  3. בהרכבת coverslips לתוך תאים זרימה
    1. ברגע coverslips יבשים, תחתכי 2 ס"מ x 2.5 ס"מ נייר-דבק דו צדדי לאורך לרצועות שני 1 ס"מ x 2.5 ס"מ.
    2. לשים את coverslip גדול מגב המשימה העדינה ולהישאר הפסים הקלטת לאורכו לאורך קצות coverslip כדי ליצור אזור 1 ס"מ x 2.5 ס"מ בין החלקים של הקלטת.
    3. לתקוע את coverslip קטן על גבי הפסים הקלטת כדי לסיים את מכלול תא זרימה.

3. זורם את הפתרונות לתא זרימה

  1. זורמים שנהנתם 20 μL של הפתרון פג-PPG-יתד לתוך התא זרימה מורכבים. אמצעי האחסון שטס בתא חייב להיות גדול מספיק כדי למלא את החדר. בשלבים הבאים, השתמש באותו אמצעי אחסון כאשר מחליפים את הפתרונות.
  2. לאפשר הפתרון פג-PPG-יתד לספוג על פני השטח במשך 5 דקות. חילופי הפתרון פג-PPG-יתד עם מאגר BRB80 3 פעמים על ידי זורם למאגר ב. זורמים הפתרון תנועתיות לתוך התא זרימה.
  3. לאטום את הקצוות של התא זרימה עם גריז כדי למנוע אידוי אם הניסוי המתוכנן הוא יותר משעה.
    הערה: תא זרימה מוכן כעת ליצירת תמונה.

4. הדמיה תא זרימה

  1. ביצוע ההדמיה באמצעות התקנה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) המטרה-סוג החזרה גמורה microtubules וגם את המנועים קינזין (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: כאן, השתמשנו מיקרוסקופ עם 100 x / 1.49 מפתח נומרי המטרה עדשה, באמצעות לייזרים שני, אחד עם אורך גל של 642 nm ו כוח מרבי של 140 mW, ועוד אחד עם אורך גל של 488 ננומטר, כוח מרבי של 150 mW.
  2. במקום טיפה של שמן טבילה על המטרה.
  3. למקם את התא זרימה על פלטפורמת מיקרוסקופ ולהביא המטרה עד יש קשר בין התא זרימת השמן על המטרה.
  4. השתמש interlock כיסוי המערכת של המיקרוסקופ כדי לחסום כל אור לייזר מלברוח.
  5. להפעיל את הלייזר ולהתמקד על צידם התחתון של התא זרימה. Microtubules מתויג, מתרגש באורך-גל של 647 fluorescently ננומטר. הם ידומה, באמצעות לייזר nm 642 בזמן 488 ננומטר לייזר משמש את המנועים GFP-קינזין.
  6. להקליט את תמונות או קטעי וידאו של ריבית. בדרך כלל, עוצמת הלייזר הוא כ 30 mW וזמן חשיפה של 50 מילישניות לשניהם לייזר ערוצים. ניתן להקליט תמונות עבור כל עוד יש תנועתיות בתא זרימה.
    הערה: ההארה לייזר מזיק בעין והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך. נא ודא כי השטח מכוסה לגמרי עם מכסה אטום.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסויים אלה, השתמשנו 1,000 פעמים לדילול microtubules מוכן בסעיף 1.3.2. ריכוז קינזין היה 20 ננומטר, ריכוז ATP היה 1 מ מ. הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ TIRF. הדאייה microtubules היו בנפרד עם תמונה של מוטורס קינזין: microtubules היו גלויים על עירור עם 647 ננומטר לייזר (איור 1, אדום), ה-GFP-קינזין היה גלוי כשהוא מתרגש עם 488 ננומטר לייזר (איור 1, ירוק). הזמן בין עירור עם אור אדום וירוק היה פחות מ- 1 s. הזמן בין מסגרות היה ש-microtubules ס' 10 מוצג הדאייה יציב. Microtubule הממוצע גלישה מהירות היה שנהנתם 800 nm בשנייה. צפיפות המשטח microtubule היה 400 מ-2. עקבות קינזין (ירוק) הופיע להרחיב מעבר לסוף נגרר microtubules (אדום) עבור מספר מיקרומטר.

figure-results-1
איור 1: דאייה microtubules מונעות על-ידי מנועים קינזין משטח מכורך חלש. כפי microtubules להתקדם, נצברות קינזין מוטורס מהפתרון. מנועים אלה לסירוגין בין שתי מדינות: יחיד-מוכרחים microtubule ולאחר כפול מכורך את microtubule והן את פני השטח. כאשר מנוע מאוגד כפול מגיע לסוף microtubule, המנוע נשאר מאחור, לאט desorbs מפני השטח עם שיעור כיבוי של s 0.1 כ-1. כתוצאה מכך, שבילים של מנועים קינזין להישאר מאחור microtubules. שורה עליונה: הערוץ האדום (microtubule). בשורה האמצעית: הערוץ הירוק (קינזין). שורה תחתונה: בשילוב אדום (microtubule) וערוץ ירוק (GFP-קינזין). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ננו הפעיל את עצמי איזה מרכיב מחייב חלש אבני הבניין לבניית מסלול משלה. כפי שמוצג באיור1, דאייה microtubules קינזין מוטורס מהפתרון ולצבור להפקיד אותם על פני השטח. . המנועים קינזין נשארים בעקבות microtubule לתקופה קצרה של זמן לפני שחזר פתרון. לפיכך, בניסוי זה, קינזין מנועים חלופי בין 3 מדינות:

(1) יחיד מכורך microtubule מדינה: זה כאשר קינזין תחילה נקשר microtubule. הוא קיים ב שיווי משקל עם המדינה (2).

(2) מצב כפול מכורך: במקרה זה, קינזין יחיד מכורך microtubule גם נקשר פני השטח באמצעות את התג שלו. מצב כפול מכורך זה מאפשר microtubule הנעה.

(3) מצב השטח מכורך יחיד: קינזין כפול מכורך הלך מסוף microtubule, הוא לא desorbed עדיין מפני השטח שנמצא במצב זה. מנועים אלה ניתן לראות באיור 1 (ערוצים משולב וירוק): הם להרחיב מאחורי הזנב של microtubule עבור מספר מיקרומטר ויוצרים את העקבות שמפחית שלו.

השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא היווצרות של פני השטח הידרופובי בשקופית. לא רק זה להשתמש כימיקלים מסוכנים, אלא זה גם מאפשר את פג-PPG-יתד functionalized עם הקבוצה נ כדי להרגיע את השטח, המאפשר ואז את קינזין לאגד הפיכה אל פני השטח. צעד חשוב נוסף הוא איטום התא זרימה עם גריז. דבר זה מאפשר הדמיה ממושך ללא נוזלי מתאדים תא הזרימה.

השינויים העיקריים טכניקה זו מורכבות משתנה ריכוז microtubule קינזין ריכוז, ריכוז ATP. שינוי microtubule ריכוז ישתנה מספר microtubules גלישה על פני השטח. שינוי קינזין ריכוז ישתנה מספר מולקולות קינזין ניתן לאגד microtubule. עם זאת, הגדלת ריכוז קינזין מעל הסכומים שכבר הגדרת בניסוי זה יכול להגדיל רקע זריחה, וכך קשה יותר לראות את השבילים קינזין נשאר מאחור דאייה microtubules. בינתיים, הורדת ריכוז ATP מתחת 10 מיקרומטר באופן משמעותי יקטן microtubule גלישה מהירות. אם אפקט זה רצוי, זה הכרחי לנצל של ATP נוצר מחדש מערכת המורכבת פוספטאז קריאטין ו- phosphokinase.

מגבלה אפשרי של טכניקה זו היא כי, בשל התכנים קינזין פעיל גדול של המערכת, מ- ATP ניתן לצרוך במהירות, ניסויים עלולה להימשך פחות משעה בתנאים מסוימים. זה יהיה למשל המקרה אם אחד בשימוש ריכוז קינזין כפולה גבוה יותר, מחומשת ריכוז microtubule גבוה יותר מאשר מה מוצג פרוטוקול זה.

שלנו הקודם העבודה18, למדנו את התפוצה המרחבית של מנועים קינזין לאורך microtubules, מוכיח הדאייה microtubules לצבור קינזין מוטורס מהפתרון, וכתוצאה מכך גידול של הצפיפות של מנועים לאורכו של microtubule. מצאנו גם כי הדאייה יציבות microtubules' המחישו מבנין לא לינארית על פתרון קינזין מהירות ריכוז לבין microtubule.

פרוטוקול הציג סוללת את הדרך לשימוש יעיל יותר של חלבון מוטורס במערכות הננומטרי הנדסה לאחור ועבור לחקירה נוספת בעיצוב של nanosystems פעילים הנמצאים בשיווי משקל דינמי. יתר על כן, באופי הדינמי של מערכת זו מאפשרת לשרת כמערכת מודל לימוד הריפוי העצמי ודינאמיים החלפת רכיבים מולקולריים, סגירת חלק הפער בין מבנים הנדסה וטבעי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית תחת גרנט NSF NSF-DMR 1807514. המחברים תודה Bachand ג Vandelinder (פ') למתן חלבון קינזין GFP. עבודה זו בוצעה, בין השאר, במרכז ננוטכנולוגיה משולב, Office של מדע המשתמש מתקן מופעל עבור Office לנו מחלקת האנרגיה (DOE) של המדע על ידי המעבדה הלאומית לוס אלמוס (חוזה לא. DE-AC52-06NA25396), מעבדות סנדיה הלאומית (קון-בדרכי מס 97 דה-AC04-94AL85000). המחברים תודה ד ר ג'ניפר נף, AllVivo עילאיים שלהם מתנה של פג-PPG-יתד functionalized עם נ. ת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לייזר 488 ננומטראומיקרון לייזראז'LuxX 488-150
642 ננומטר לייזראומיקרון לייזראז'LuxX  642
קזאיןסיגמאC7078-500G
קטלאז מכבד בקרסיגמאC40-500 מ"ג
קריאטין פוספטסיגמאP-7936
קריאטין פוספוקינאזסיגמאC3755-500UN
D-גלוקוזסיגמאG2133-50KU
תמיסת דיכלורודימתילסילןסיגמא40140-25ML
דימתיל סולפוקסידSigma34869-100ML
DithiothreitolSigmaD0632-5Gליקוי חמה רעיל
TINikon Instruments
eGFP rkin430מסופק על ידי George Bachand
EGTASigmaE4378-25G
Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר סיינטיפיק14-959-49A
גלוקוז אוקסידאזסיגמאG0543-10KU
גואנוזין טריפוספטסיגמאG8877-10MG
מגבים עדינים למשימותסיגמא תרופות8089
מגנזיום כלורידסיגמאM1028-100 מ"ל
מתנולפישר כימיקלA412רעיל
מערכת טיהור מים Milli-QMillipore Corporation
ניקל סולפטסיגמא656895-50G
צינורות פקליטקסלסיגמאT1912-5MG
צינורותסיגמאP-6757
פלורוניק F108-NTAמסופק על ידי ג'ניפר נף וכלי הדםPEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic  F-108Sigma542342-250GPEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap צינורות מיקרוצנטריפוגה עם שמירה נמוכהפישר סיינטיפיק21-403-190
טולואןפישר כימיקלT324
טובולין רעיל, HiLyte647-labeledCytoskeleton, Inc.TL670M
UV אוזון ProcleanerBioForce NanosciencesPC440
Whatman  מסנני מזרק PuradiscSigmaWHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS מצלמהAndor TechnologysCMOS 4.2
רעיל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603(2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UVGFP

מאמרים קשורים