מאמר שיטה

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

21.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59086

⸱

11 באפריל 2019

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

במאמר זה

סיכום

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

תקציר

המערכת חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות מתפקד באופן טבעי של חיידקי החסינות אדפטיבית, אך יש כבר בהצלחה לשנות את ייעודו הגנום הנדסה רבים אורגניזמים שונים. בדרך כלל, wildtype CRISPR הקשורים 9 (Cas9) או Cas12a endonuclease משמשת כדי לדבוק אתרים ספציפיים בגנום, אחרי אשר יתוקן מעבר כפול גדילי הדנ א באמצעות הסוף שאינם הומולוגיים הצטרפות לשביל (NHEJ) או את (תיקון מכוון הומולוגיה HDR) מסלול בהתאם תבנית התורם נעדרים או להציג בהתאמה. עד כה, CRISPR מערכות ממינים שונים חיידקי הוכחו להיות מסוגל לבצע עריכה הגנום בתאים בתרבית. עם זאת, למרות הפשטות לכאורה של הטכנולוגיה, מספר פרמטרים צריכים לקחת בחשבון, אשר לעיתים קרובות להשאיר משתמשים מבולבלים אודות הטוב ביותר לבצע את הגנום שלהם עריכת ניסויים. כאן, אנו מתארים שזרימת עבודה מלאה של הנבחנים: זיהוי של שיבוטים תא שנושאים שינויים DNA הרצוי, במטרה להקל על ביצוע מוצלח של הגנום עריכת ניסויים בקווים בתרבית של תאים. אנחנו האר שיקולים מרכזיים עבור משתמשים כדי לשים לב, כולל הבחירה של מערכת CRISPR, אורך מרווח, את העיצוב של תבנית התורם חד גדילי oligodeoxynucleotide (ssODN). נוכל לדמות כי זרימת עבודה זו תהיה שימושית ללימודים נוקאאוט גנטי, מחלת מידול המאמצים, או הדור של הכתב תא קווים.

מבוא

היכולת מהנדס הגנום של כל אורגניזם חי יש לא מעט אפליקציות ביו, הביו-טכנולוגיה, כגון התיקון של גורמי מחלות מוטציות, בניית דגמי הסלולר מדויק לחקר המחלה, או דור של החקלאי יבולים עם תכונות רצויות. מאז המאה ה, טכנולוגיות שונות פותחו עבור גנום הנדסה בתאי יונקים, כולל meganucleases1,2,3, אבץ אצבע nucleases4,5, או תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs)6,7,8,9. עם זאת, טכנולוגיות קודמות אלה הם קשה לתוכנית או מייגע להרכיב, ובכך פוגעות שלהם אימוץ נרחב מחקר ובתעשייה.

בשנים האחרונות, באופן קבוע באשכולות interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) - מערכת CRISPR-הקשורים (Ca) התפתחה גנום חדש חזק הנדסה טכנולוגיה10,11. במקור מערכת חיסונית אדפטיבית בחיידקים, עבר בהצלחה לפריסה הגנום שינוי בצמחים ובעלי חיים, כולל האדם. הסיבות העיקריות מדוע CRISPR-Cas צברה פופולריות רבה בזמן כל כך קצר זה הרכיב המביאה את endonuclease Cas מפתח, כגון Cas9 או Cas12a (ידוע גם בשם Cpf1), על המיקום הנכון הגנום הוא פשוט חתיכת קצר מדריך בודד chimeric RN (SgRNA), אשר היא פעולה פשוטה עיצוב וזול לסנתז. לאחר לאתר היעד האנזים Cas מתפקד בתור זוג מספריים מולקולרית ודבק ה-DNA מאוגד עם שלו RuvC, HNH או Nuc תחומים12,13,14. מעבר נטושים כפול וכתוצאה מכך (DSB) לאחר מכן תיקון על ידי התאים באמצעות קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) או מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). בהיעדרו של תבנית תיקון, DSB יתוקן על ידי השביל NHEJ לשגיאות, אשר יכולים להצמיח אקראיים מדומים ההוספה או המחיקה של נוקלאוטידים (indels) באתר לחתוך, ובכך לגרום frameshift מוטציות בגנים חלבונים. עם זאת, בנוכחות התורם תבנית המכילה את השינויים הרצויים של הדנ א, DSB יתוקן על ידי השביל HDR דיוק גבוה. סוגים נפוצים של תבניות התורם כוללים חד גדילי oligonucleotides (ssODNs), פלסמידים. לשעבר משמש בדרך כלל אם השינויים DNA המיועד קטנות (לדוגמה, שינוי של בסיס יחיד זוג רשימות), בזמן האחרון זה משמש בדרך כלל אם אנחנו רוצים להוסיף רצף ארוך יחסית (לדוגמה, רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP) לתוך מיקומה היעד.

הפעילות endonuclease של החלבון Cas דורש הנוכחות של protospacer הסמוך מוטיב (פאם) ב אתר היעד15. פאם של Cas9 נמצא בקצה 3' של protospacer, פאם Cas12a (הנקראת גם Cpf1) נמצאת בקצה 5' במקום16. Cas-המדריך RNA מורכב אין אפשרות להציג DSB אם פאם הוא נעדר17. לפיכך, פאם המקומות אילוץ על המיקומים גנומית איפה מסוגל לבקע נוקלאז Cas מסוים. למרבה המזל, nucleases Cas של מינים שונים של חיידקים בדרך כלל התערוכה פאם דרישות שונות. לפיכך, על ידי שילוב של המערכות CRISPR-Cas השונות שלנו ארגז כלים הנדסיים, אפשר להרחיב את מגוון אתרים אשר עשוי להיות ממוקד הגנום. יתר על כן, אנזים Cas טבעי שניתן הנדסה לאחור או התפתחו כדי לזהות רצפים פאם חלופיים, שמפרידה את היקף נגיש מניפולציה18,19,20גנומית מטרות.

למרות מספר מערכות CRISPR-Cas זמינים למטרות הנדסה הגנום, רוב המשתמשים של הטכנולוגיה יש הסתמך בעיקר על נוקלאז Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) מסיבות רבות. קודם כל, זה דורש יחסית פשוט הגולה פאם, בניגוד רבים לחלבונים אחרים-Cas זה יכול לבקע רק בנוכחות PAMs מורכבים יותר. שנית, זה endonuclease Cas הראשון כדי לפרוס בהצלחה תאים אנושיים21,22,23,24. שלישית, SpCas9 הוא האנזים מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה. אם חוקר מבקש להשתמש נוקלאז Cas אחר, הוא או היא לעתים קרובות יהיה ברור על הדרך הטובה ביותר לעצב את הניסוי ותבצע כמה אנזימים אחרים בהקשרים ביולוגיים שונים, בהשוואה ל- SpCas9.

כדי להוסיף הבהרות לגבי את הביצועים היחסיים של מערכות CRISPR-Cas שונות, לאחרונה ערכנו השוואה שיטתית של חמש רשויות אישורים endonucleases – SpCas9, האנזים Cas9 מ Staphylococcus aureus (SaCas9), האנזים Cas9 מ- מנינגוקוקוס (NmCas9), האנזים Cas12a מן Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), האנזים Cas12a של החיידק Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. להשוואה הוגן, הערכנו את nucleases רשויות אישורים שונים באמצעות אותה קבוצה של אתרי יעד ותנאים אחרים ניסיוני. המחקר גם מאפשרת עיצוב הפרמטרים עבור כל מערכת CRISPR-Cas, אשר ישמש כהפניה שימושי עבור משתמשים של הטכנולוגיה. . הנה, טוב יותר לאפשר לחוקרים לנצל CRISPR-Cas מערכת, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הנדסה הגנום אופטימלית עם אנזימים שונים Cas9 ו- Cas12a (ראה איור 1). הפרוטוקול כוללת לא רק פרטים ניסיוני אבל שיקולי התכנון חשוב גם כדי להגדיל את הסבירות של תוצאה הנדסה מוצלחת הגנום בתאים בתרבית.

דיאגרמת תהליך עריכת גנים של CRISPR; תכנון sgRNAs, שיבוט פלסמיד, העברת תאים, סינון שיבוטים
איור 1 : סקירה כללית של זרימת העבודה כדי ליצור הגנום נערך שורות תאים אנושיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עיצוב של sgRNAs

  1. בחר מערכת CRISPR-Cas המתאים.
    1. תחילה, בדוק את אזור היעד עבור רצפי פאם nucleases Cas9 ו Cas12a כל זה הוכחו להיות פונקציונלי ב בתרבית של תאים16,21-32. חמישה אנזימים הנמצאים בשימוש לעתים תכופות ניתנת טבלה 1 יחד עם PAMs המתאימים שלהם.
      הערה: חוץ endonucleases המפורטים בטבלה1, ישנם אנזימים רשויות אישורים אחרות פחות נפוצים, שנפרסו בהצלחה בתרבית של תאים, כגון נוקלאז Cas9 של סטרפטוקוקוס thermophilus (St1Cas9) את זה מזהה את NNAGAAW פאם. אם אתר היעד הרצוי אינו מכיל של פאם ידוע, אז אחד לא היה מסוגל להשתמש במערכת CRISPR-Cas הגנום הנדסה.
    2. שנית, שקול כל המאפיינים הידועים של לוקוס גנומית היעד או הגן. מאפיינים מסוימים שיש לקחת בחשבון כוללות רמות ביטוי גנים או נגישות כרומטין, אם קיימים אחרים מקרוב הקשורות רצפים גם כן.
      הערה: אנזימים מסוימים מתאימים יותר עבור משקעת במיוחד הקשרים ביולוגיים. לדוגמה, כדי לערוך לוקוס גנומית החוזרות על עצמן או גן עם מספר paralogs קרובים אחרים, מומלץ להשתמש גם AsCas12a (עקב שלה סובלנות נמוכה לאי-התאמות בין sgRNA את המטרה DNA מ SpCas9, LbCas12a) או SaCas9 (עקב שלה הדרישה מפרידי ארוכים יותר, אשר מספק הם ברמת פירוט גבוהה מיקוד)25.
רשויות אישורים Endonucleaseפאםאורך מרווח אופטימלית
SpCas9הגולה17-22 nt כלול
SaCas9NNGRRT≥ 21 nt
NmCas9NNNNGATT≥ 19 nt
AsCas12a, LbCas12aTTTV≥ 19 nt

טבלה 1: כמה נפוץ אנזימים Cas עם cognate PAMs שלהם באורכים של האופטימלית sgRNA. N = כל נוקלאוטיד (A, T, G או C); R = A או G; V = A, C, או G.

  1. בחר רצף מרווח מתאים. זיהוי ייחודי רצף ככל האפשר כדי למזער את הסיכון של אירועים המחשוף את המטרה, או על-ידי בדיקת הגנום היעד עם הפיצוץ33 או באמצעות מספר כלים מקוונים זמינה בחופשיות, כגון: (א) תוכנית מן המעבדה של ג'אנג פנג34 (http://crispr.mit.edu/); (ב) צ'ופצ'ופ35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (ג) E-פריך36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (ד) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (ה) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    הערה: אורך מרווח האופטימלית יכול לנוע בין 17 עד 25 נוקלאוטידים (nt) כולל, תלוי איזה Cas משמש האנזים (ראה טבלה 1). עבור Cas9, מרווח הוא הזרם של פאם, בעוד שלגבי Cas12a, מרווח זה במורד הזרם של PAM. בנוסף, יעילות HDR טיפות במהירות עם הגדלת המרחק מן האתר לחתוך. לפיכך, לעריכה DNA מדויק, מקם את sgRNA קרוב ככל האפשר אל האתר המיועד השינוי.
  2. לסנתז DNA oligonucleotides עם המסוכך המתאים עבור פלסמיד CRISPR נמצא בשימוש.
    1. הוספת נוקלאוטיד G מול מרווח אם התנוחה הראשונה של המדריך אינו ג'י קובעות הפוך רצף משלים מרווח. הוסף המסוכך הכרחי לקראת שיבוט למטרות.
      הערה: המחשה, עבור פלסמידים המשמשים שלנו מחקר הערכה25, oligonucleotides להיות מסונתז מוצגות בטבלה מס ' 2. השתמש הדוגמה נתון באיור 2 כמדריך, במידת הצורך. פלסמידים CRISPR רבים זמינים ממקורות מסחריים (למשל, Addgene). חלק פלסמידים פופולרי יותר מקבלים את הטבלה של חומרים.
פלסמיד CRISPRרצף
pSpCas9, pSaCas9תחושה: 5' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACC (גר') - 3'
Antisense: 3' - (ג) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'
pNmCas9תחושה: 5' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACC (גר') - 3'
Antisense: 3' - (ג) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5'
pAsCas12a, pLbCas12aתחושה: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

בטבלה 2: Oligonucleotides הדרושים עבור שכפול רצפים sgRNA לתוך פלסמידים CRISPR בשימוש הערכה האחרונה ללמוד25. המסוכך מופיעים בכתב נטוי.

דיאגרמת עריכת גנים CRISPR, מיקוד אקסון, רצפי אוליגונוקלאוטידים, השוואת SpCas9, SaCas9.
איור 2 : דוגמה הממחישות כיצד בחר יעד אתרים ועיצוב oligonucleotides לקראת שיבוט לתוך פלסמידים CRISPR. היעד לוקוס גנומית כאן היא אקסון 45 של הגן CACNA1D האנושית. PAMs עבור SpCas9 ו- SaCas9 הם הגולה ו- NNGRRT בהתאמה, מסומנים באדום, ואילו פאם עבור AsCas12a, LbCas12a TTTN, מסומן בירוק. הפס האופקי אדום מציין את protospacer SpCas9, SaCas9, בעוד הפס האופקי ירוק מציין את protospacer עבור שני אנזימים Cas12a. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. שיבוט של oligonucleotides לתוך עמוד השדרה וקטור

  1. Phosphorylate, anneal oligonucleotides antisense והיגיון.
    1. אם oligonucleotides הם lyophilized, resuspend אותם כדי ריכוז 100 מיקרומטר בחומצה טריס-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (TE מאגר, ראה טבלה של חומרים) או ddH2O.
    2. להכין תערובת התגובה 10 µL המכילה 1 µL של הגיון oligonucleotide, 1 µL של antisense oligonucleotide, 1 µL T4 DNA ליגאז מאגר (10 x), µL 1 של T4 polynucleotide קינאז (PNK), ו 6 µL של ddH2O. לערבב היטב על-ידי pipetting ולמקם את תערובת התגובה סאי תרמי ! אש באמצעות הפרמטרים הבאים: 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 95 ° C 5 דקות, כבש עד 25 ° C-6 ° C/min.
    3. לדלל את התגובה מיקס מטריים ddH2O (למשל, תערובת התגובה 2 µL + 198 µL ddH2O).

דיאגרמת פלסמיד CRISPR עם רצפי גנים, פריימרים לעריכת DNA, ניתוח מפות וקטוריות.
איור 3 : דוגמה פלסמיד CRISPR. () א מפה המציינת את תכונות חשובות שונות של פלסמיד. . הנה, האמרגן EF-1a כוננים הביטוי של Cas9, בעוד האמרגן U6 כוננים הביטוי של sgRNA. Amp(R) מציין של ג'ין אמפיצילין-התנגדות ב- פלסמיד. (b) הרצף של "BbsI-BplI שיבוט באתר" פלסמיד. זיהוי הרצף של BbsI GAAGAC, מסומן באדום, ואילו הרצף זיהוי של BplI הוא איסור פרסום-N5- CTC והוא מסומן בירוק. (ג) תחל יכול לשמש עבור המושבה PCR כדי לבדוק אם הרצף sgRNA נשלטה בהצלחה לתוך פלסמיד. המפתח hU6_forward מסומן על ידי חץ סגול על המפה פלסמיד, בעוד ומהצמיגים M13R(-20) אוניברסלי מסומן על ידי חץ ורוד על המפה פלסמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. לעכל את פלסמיד CRISPR עם אנזים ההגבלה המתאימה.
    הערה: שכפול של sgRNAs בדרך כלל לסמוך על מכלול שער הזהב עם סוג אנזימי הגבלה IIs. אנזימים שונים עשויים לשמש פלסמידים שונים CRISPR. PSpCas9, להשתמש BbsI או BplI (ראה איור 3). PSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a, pLbCas12a, להשתמש BsmBI.
    1. הכנת תערובת התגובה 20 µL המכיל 1 µg של פלסמיד מעגלית וקטור, µL 2 מאגר (10 x), 1 µL של אנזים הגבלה (למשל, BbsI, BplI או BsmBI), ו- ddH2O לאמצעי הסופי של µL 20. דגירה התגובה ב 37 ° C עבור 2.5 h.
    2. להוסיף 1 µL של שרימפס phosphatase אלקליין (SAP) התגובה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 30 דקות.
    3. להרוות את התגובה על-ידי הוספת µL 5 6 x טעינת ה-DNA לצבוע (ראה טבלה של חומרים), לערבב היטב, ולפתור את התגובה ב- 0.8% agarose ג'ל עם 1 x מאגר טריס-אצטט-EDTA (טה). לאחר מכן, לסלק את הלהקה הנכונה ולהמשיך להתחבר לטהר את הווקטור ליניארית.
  2. מאתרים ומפסיקים את oligonucleotides annealed לתוך פלסמיד מתעכל CRISPR.
    1. להכין תערובת התגובה 10 µL: 50 ng של וקטור ליניארית, µL 1 של oligonucleotides annealed מדולל, 1 µL T4 DNA ליגאז מאגר (10 x), µL 1 של T4 DNA ליגאז, ו- ddH2O לאמצעי הסופי של 10 µL (ראה טבלה של חומרים). דגירה התגובה ב 16 ° C בלילה או בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
      הערה: כדי להאיץ את תהליך מצדו, מרוכז T4 DNA ליגאז ולהשתמש דגירה המיקס התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (ראה טבלה של חומרים).
  3. להפוך את המוצרים מחוברים כשיר מבחינה כימית e. coli תאים (ראה 1 קובץ משלים). מורחים את התאים חיידקי טרנספורמציה על צלחת אגר ליברות עם 100 אמפיצילין µg/mL.
  4. לבצע תגובת שרשרת של פולימראז המושבה (PCR) כדי לזהות החיידקים עם הוספת.
    1. להכין שני סטים של רצועת המבחנות סטרילי. הגדר 1, להוסיף µL 4.7 ddH2O, תוך כדי להגדיר 2, להוסיף µL 50 ק ג מרק עם אנטיביוטיקה המתאים (למשל, אמפיצילין µg/mL 100).
    2. עם טיפ פיפטה סטרילי, לבחור מושבה רלוונטי, להעביר אותו בקצרה צינור 1 לקבוע, להשאיר את הטיפ בשפופרת הגדר 2. חזור על כמה מושבות, מקפיד להשתמש המבחנות שונה בכל פעם.
      הערה: בדרך כלל, הקרנת ארבע המושבות מספיקה. עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם היעילות שיבוט.
    3. להוסיף את ריאגנטים הבאים כל שפופרת להגדיר 1 (עבור 10 µL PCR): 5 µL של 2 x PCR מיקס מאסטר (עם טעינה לצבוע, ראה טבלה של חומרים), µL 0.15 של oligonucleotide או היגיון antisense (100 מיקרומטר), µL 0.15 של פריימר (100 מיקרומטר) מיקוד על פלסמיד CRISPR במורד הזרם או למעלה זרם של הקלטת sgRNA בהתאמה (ראה איור 3).
      הערה: המוצר PCR אמור להניב אידיאלי גודל המוצר של 150 bp או להקות גדולות יותר, כך שכל חיובי לא טועים כמו הדימרים פריימר.
    4. להפעיל את מותני הצנטרפוגה תרמי באמצעות הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 95 ° C ל 30 s (שלב 2), 60 ° C ל 30 s (שלב 3), 72 ° C ל 30 s (שלב 4), חזור על השלבים 2\u20124 עוד 34 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות , ולהחזיק ב 4 º C.
      הערה: הטמפרטורה מחזק של 60 ° C ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור תחל תוכנן. התארכות זמן של 30 s יכולה להשתנות גם בהתאם לגודל הצפוי אמפליקון PCR את ה-DNA פולימראז בשימוש.
    5. לפתור את התגובות על ג'ל agarose 1% באמצעות מאגר x TAE 1.
    6. לחסן מושבה המניבה להקה חיובי ב- PCR על ידי העברת 50 µL התרבות מהצינור הגדר 2 המתאים לתוך צינור חרוטי גדול המכיל 5 מ ל LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. תן את תרבות גדלים בין לילה 37 ° C שייקר אינקובטור.
    7. לבודד פלסמידים תרבות לילה השימוש miniprep קיט (ראה טבלה של חומרים), רצף הדגימה באמצעות פריימר PCR את המושבה שאינו oligonucleotide antisense או היגיון (hU6_forward או M13R(-20), איור 3).
      הערה: אם יש צורך, ביצוע של maxiprep של פלסמיד CRISPR תבדוק-רצף להשיג כמות גדולה לניסויים במורד הזרם.

3. עיצוב סינתזה של תיקון תבניות

הערה: עבור דיוק בהנדסת הגנום, תבנית המציין את השינויים DNA הרצוי צריך להינתן יחד עם ריאגנטים CRISPR. עבור עריכות DNA קטנות כגון שינוי של נוקלאוטיד בודד, ssODN תורם תבניות הן המתאימות ביותר (ראו סעיף 3.1). עבור עריכות דנ א גדולים יותר כגון החדרת ה-GFP תג 5" או 3' של גן מסוים חלבונים, פלסמיד התורם תבניות המתאימות ביותר (ראו סעיף 3.2).

  1. עיצוב ולסינתזה של תבנית התורם ssODN (ראה איור 4).
    1. לקבוע שהנכון לנטישה של מי רצף התבנית צריך לעקוב.
      הערה: Cas12a תערוכות העדפה ssODNs של הרצף-יעד סטרנד, בעוד Cas9 תערוכות העדפה עבור ssODNs של סטרנד היעד רצף במקום25 (ראה איור 4).
    2. ודא רצף המתוקן לא targetable על ידי נוקלאז Cas שנבחר שוב. לדוגמה, מוטציה של פאם בצורה כזאת, כי אין שינוי חומצת אמינו או למנוע את פאם מהתבנית תורם אם יש לה סיבה פונקציונלית. השתמש הדוגמה נתון באיור 4b כמדריך, במידת הצורך.
    3. להחליט אם תבנית סימטרית או אסימטרי התורם רצוי. לתורמים סימטרי, ודא כי כל זרוע הומולוגיה איגוף האתר שינוי ה-DNA nt לפחות 17 ארוך25. עבור תבניות התורם אסימטרי, השתמש יונקות זרועות ארוכים יותר של השינויים DNA הרצוי (ראה איור 4). חשוב להבטיח כי זרוע קצרה היא בסביבות 37 nt אורך, בעוד היד השנייה הומולוגיה הוא בסביבות 77 nt ב אורך25,39.
    4. לסנתז את תבנית מעוצבת כמו פיסת דנ א חד גדילי.
      הערה: ssODNs א-סימטרי יכול, אך אינם תמיד, להפגין יעילות HDR גבוהה יותר מאשר ssODNs סימטרי. באופן כללי, תורם אסימטרי בדרך כלל מבצע לפחות כמו גם תורם סימטרי, כאשר תוכנן כראוי. עם זאת, תבנית סימטרית עולה הרבה יותר כי היא ארוכה יותר, ולכן דורש לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) טיהור או הליך סינתזה מיוחדת. הסתרה ג'ין שגרתית בדרך כלל לסמוך על השביל תיקון NHEJ, אינם דורשים תבנית תיקון. עם זאת, אם היעילות נוקאאוט נמוכה, לעצב תבנית התורם ssODN מכיל מוטציה frameshift והוא לפחות 120 nt ב אורך25,40.

דיאגרמת עריכת גנים המציגה שילוב ssODN סימטרי/אסימטרי בלוקוס היעד באמצעות CAS9/12a.
איור 4 : העיצוב של תבניות התורם ssODN. () מפרטים טכניים הממחישות עיצובים אפשריים שונים. המלבנים האופקיים אדומים מציינים סטרנד הלא-יעד (NT), בעוד המלבנים הכחולים לציין סטרנד היעד (T). בנוסף, המלבנים ירוק קטן מציינים את השינויים DNA הרצוי (כגון שינויים נוקלאוטיד יחיד). כאשר נעשה שימוש של ssODN סימטרי, האורך המינימלי של כל זרוע הומולוגיה צריך להיות לפחות 17 nt (אבל יכול להיות ארוך יותר). עבור ssODNs א-סימטרי, ssODN T 37/77 נראה אופטימלי SpCas9-induced HDR, ואילו ssODN NT 77/37 מופיע אופטימלי עבור Cas12a-induced HDR. L = זרועו השמאלית הומולוגיה; R = נכון הומולוגיה הזרוע. (b) דוגמה ספציפית כדי להדגים כיצד לעצב תבניות ssODN. כאן לוקוס גנומית יעד זה אקסון 45 של הגן CACNA1D האנושית. פאם Cas9 הוא ורוד ומסומן בקו תחתון, בעוד את פאם Cas12a הוא חום ומסומן בקו תחתון. המטרה היא ליצור מוטציה missense (מסומן בירוק) על-ידי המרת שהוא (קידוד סרין) קנאה (קידוד ארגינין). כדי למנוע מיקוד מחדש על-ידי Cas12a, פאם TTTC הוא מוטציה כדי CTTC. שימו לב כי אין שינוי בחומצת אמינו (UAU ו- UAC שניהם הקוד של טירוזין). כדי למנוע עוד יותר מיקוד מחדש על-ידי Cas9, codon שהוא מוחלף codon UCC (מודגש), שניהם איזה קוד עבור סרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. עיצוב ותשכפלי תבנית התורם המתאים פלסמיד. לדוגמה, זה יכול להכיל רצף GFP ולצדו זרועות ארוכות כי הם הומולוגיים כדי לוקוס גנומית היעד (ראה איור 5).
    1. ודא רצף שהשתנה לא targetable על ידי נוקלאז Cas שנבחר שוב. לדוגמה, ניתן לפצל את protospacer על ידי התג (GFP) שנוספו. לחלופין, פאם עשוי להיות מוטציה או להסיר מהתבנית התורם כך שאינה משפיעה על תפקוד הגן.
    2. להגביר את הזרועות הומולוגיה של הדנ א באמצעות PCR. אורך כל זרוע הומולוגיה היא בדרך כלל 1000 ל 1500 bp.
      הערה: כדי להקל על שיבוט, ודא כי פריימר לפנים הזרוע השמאלית הומולוגיה, ומהצמיגים הפוך עבור הומולוגיה נכון זרוע אחד יש לפחות 20 nt חופפים ברצף עם שדרה וקטורית שנבחרה. בנוסף, ודא ומהצמיגים הפוכה על הזרוע השמאלית הומולוגיה, ומהצמיגים קדימה עבור הזרוע הומולוגיה נכון יש כמה רצפים חופפים עם תג epitope.
    3. שיבוט שתי זרועות הומולוגיה והתג (GFP) לתוך עמוד השדרה וקטוריות באמצעות הרכבה גיבסון41 (ראה את הטבלה של חומרים). לאמת את פלסמיד מאת סנגר רצף באמצעות קדימה, להפוך תחל כי הם ויוצאת של התבנית התורם בהתאמה.
      הערה: סנגר רצף זמין נרחב ובזול שירות מסחרי. לשלוח את aliquot של פלסמיד יחד עם תחל רצף ספק שירות.
    4. Linearize את התבנית תורם באנזים הגבלה שחותך את פלסמיד רק פעם אחת במעלה הזרוע השמאלית הומולוגיה או במורד הזרם של הזרוע הומולוגיה הנכון.
      הערה: לאחרונה, תורם כפול-קאט, אשר מקיפים את רצפי sgRNA. פאם, הוא שוחרר מן פלסמיד לאחר המחשוף. על ידי נוקלאז ברשויות המתאימות, הוכח כדי להגדיל את יעילות HDR42. כאשר רצפי. פאם sgRNA מוכנסים במעלה הזרם של הומולוגיה שמאל וימין זרועות בהתאמה (למשל על ידי העצרת גיבסון), אורך הזרוע הומולוגיה עשוי להיות מופחת ל-300 bp, ויש צורך linearize את פלסמיד.

דיאגרמת עריכת גנים עם sgRNA, מיקוד גנים CLTA, שילוב P2A-GFP ורצפי פריימר.
איור 5 : עיצוב, שיבוט של תבנית התורם פלסמיד. דוגמה ספציפית () המטרה במשחק הזה היא נתיך P2A-GFP קצה קרבוקסילי של החלבון CLTA. המלבן אופקי כחול מציין את הזרוע השמאלית הומולוגיה, בעוד מלבן אופקי אדום מציין את הזרוע הומולוגיה הנכון. אותיות מציינים חלבונים רצפים, בעוד אותיות קטנות מצביעות על רצפים ללא קידוד. PAMs עבור SpCas9 ו- Cas12a נטוי, עם קו תחתון. תבנית (b) תורם פלסמיד יכול לשמש כדי לתייג endogenously P2A-GFP ב C-הסופית של CLTA. רצפי פריימר שסופקו ניתן לשכפל את פלסמיד על ידי העצרת גיבסון. התנאים PCR הם כדלקמן: 98 ° C למשך 3 דקות, 98 ° C ל 30 s (שלב 2), 63 ° C ל 30 s (שלב 3), 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה (שלב 4), חזור על השלבים 2\u20124 עוד 34 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולהחזיק ב 4 º C. אותיות שחורות תואמות וקטור רצפי אותיות כחול תואמות את הזרוע השמאלית הומולוגיה, אותיות ירוק שיתאימו P2A-GFP, אותיות אדומות תואמות את הזרוע הומולוגיה נכון. שימו לב כי ברגע רצף קידוד P2A-GFP בהצלחה משולב של לוקוס היעד, מיקוד מחדש על-ידי SpCas9 לא תהיה אפשרות, מאז 9 היחידה nt של שלה protospacer (GTGCACCAG) יישאר ללא פגע. יתר על כן, על מנת למנוע מיקוד מחדש על-ידי Cas12a, 3 basepairs מיד במורד הזרם של התחנה codon (באותיות מודגשות) נמחקים מהרצף פלסמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. תא תרביות תאים

הערה: החלקים הנותרים של הפרוטוקול נכתבות עם HEK293T תאים במוח. המדיום תרבות המשמש מורכב של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת גלוקוז 4.5 g/L, 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין ו 0.1% פניצילין/סטרפטומיצין. שלבים שונים של הפרוטוקול ייתכן שיהיה עליך לשנות בהתאם שורת התאים בפועל בשימוש. כל תא תרבות העבודה מתבצעת בארון Class II אבטחה כדי להבטיח סביבת עבודה סטרילית.

  1. זרע 1.8 x 105 תאים בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן יום אחד לפני תרביות תאים.
    1. לבטל את התאים על ידי כ רפה בעברית התקשורת, ולאחר מכן הוספת 150 µL 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    2. לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 150 µL (או 1 x נפח) של התא תרבות המדיה. העברה התליה תא צינור חרוטי. ספין למטה התאים ספסל למעלה ומפרידה ב 1000 x g למשך 5 דקות.
    3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend עם 5 מ של התא תרבות המדיה. בשפופרת צנטרפוגה נפרדים, aliquot 10 µL של 0.4% trypan blue פתרון. ואז, מוסיפים בתאים µL resuspended 10 מהשלב 4.1.2 ומערבבים היטב.
    4. פיפטה 10 µL של התערובת (תאים + trypan blue) לתוך hemocytometer. להמשיך לספור את התאים באופן ידני או באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
    5. זרע 1.8 x 105 תאים לתוך אחד טוב של צלחת 24-ובכן תרביות רקמה.
  2. להכין תערובת תרביות תאים המכילים גם 500 ננוגרם של פלסמיד CRISPR (עבור בתיווך NHEJ עריכת) או 300 ng של פלסמיד CRISPR ו- 300 ng של תבנית התורם (לעריכה בתיווך HDR), בהתאם להוראות המצורפות הכימית תרביות תאים (ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר למשך הזמן המומלץ (בדרך כלל סביב 10\u201220 דקות).
  3. להוסיף את תערובת תרביות תאים לתאים באופן dropwise, ו מערבולת בעדינות את הצלחת לאחר.
  4. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 אוויר חממה במשך 24 שעות ביממה (עבור מבוסס NHEJ ניסויים) או 72 h (לניסויים מבוסס-HDR).

5. קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא (FACS) של תאים transfected

  1. לבטל את התאים על ידי כ רפה בעברית התקשורת, ולאחר מכן הוספת µL 150 של 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  2. לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 150 µL (או 1 x נפח) של התא תרבות המדיה. העברה התליה תא שפופרת צנטרפוגה. ספין למטה לתאים microcentrifuge ב x 235 גרם במשך 5 דקות.
  3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 2% סרום שור עוברית (FBS) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS). לסנן את התאים דרך רשת 30 מיקרומטר או תא מסננת צינור 5 מ"ל FACS.
  4. להכין עוד צינור צנטריפוגה עם 100 µL תרבות המדיה או 2% FBS ב- PBS עבור אוסף של תאים.
  5. על cytometer זרימה, שער התאים עם תאים שאינם transfected כפקד שלילי. למיין ולאסוף תאי transfected, לפי איזו קרינה פלואורסצנטית סמן קיים פלסמיד CRISPR בשימוש. לדוגמה, אם פלסמיד נושא גן mCherry, מיון עבור תאים RFP-חיוביות.
    הערה: פלסמידים שונים CRISPR יש סמנים שונים לבחירה. בערכה של פלסמידים (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 ו pLbCpf1) השתמשו במחקר זה הערכת נושא החלבון הניאון כתום (OFP) או את הגן mCherry.

6. הרחבת שיבוטים בודדים

  1. Centrifuge התאים ממוינים ספסל למעלה ומפרידה במהירות המרבית (18,000 x g) עבור 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 300 µL תרבות המדיה. זרע µL 200, בתאים צלחת 24-ובכן תרביות רקמה ולתת להם לשחזר כמה ימים בחממה 37 ° C. תמשיך הנותרים התאים µL 100 עבור סעיף 7.
  2. ברגע התאים מתחילים להפוך confluent, מעבר להם על פי שלבים 4.1.1\u20124.1.3. הזרע התאים בדלילות בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ כדי לאפשר מספיק שטח פנוי עבור מושבות בודדות לגדול. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 אוויר חממה.
    הערה: נסה דילולים שונים. תאים בודדים צריך די שטח כדי לגדול כמו מושבות בודדות. עם זאת, הם גם לא יכול להיות יותר מדי דליל, כפי כמה שורות תאים לא גדלים היטב כאשר מספר התאים מעטים מדי.
  3. ברגע המושבות מתחילים להיווצר, לבחור אותם תחת המיקרוסקופ (עם הגדלה 4 x) ומניחים כל המשובטים לבאר בודדת של צלחת 24-ובכן, המכיל תאים תרבות המדיה. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 אוויר החממה עד התאים הופכים confluent.
    הערה: אלטרנטיבה דילולים טורי, איסוף המושבה היא להשתמש cytometry זרימה כדי למיין עבור תאים בודדים לתוך צלחת 96-ובכן. עם זאת, זה לא יפעלו עבור כמה שורות תאים שגדלים לא טוב כשיש תא אחד בלבד.

7. הערכה של עריכת יעילות

  1. לחלץ את הדנ א על-ידי צריך שתוציאו התאים הנותרים µL 100 ממוין (מתוך שלב 6.1) ומפרידה העליון ספסל במהירות המרבית (18,000 x g) עבור 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע והמשך לבודד באמצעות ערכת חילוץ (ראה טבלה של הדנ א חומרים).
  2. לבצע את endonuclease T7 אני (T7EI) assay המחשוף (ראו איור 6).
    1. להגדיר את µL 50 PCR המכיל 10 µL של ה-PCR התגובה מאגר (5 x), µL 1 של dNTP מיקס (10 מ מ), 2.5 µL על-ידי המשתמש קדימה פריימר (10 מיקרומטר), 2.5 µL על-ידי המשתמש הפוכה פריימר (10 מיקרומטר), 0.5 µL של ה-DNA פולימראז, 2\u20125 µL של תבנית ה-DNA גנומי (תלוי כמה תאים יש כבר מיון), ואז טופ עד 50 µL עם ddH2O (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: תחל נועדו לאגף את לוקוס גנומית היעד ואת התשואה שמוצר ה-PCR של סביב 400\u2012700 bp. בדרך כלל אחד פריימר ממוקם קרוב יותר לאתר לחתוך של האנזים Cas מאשר פריימר אחרים, כך התוצאה של T7EI וזמינותו היא שתי רצועות נפרדות ag התעוררו ג'ל (ראה איור 6).
    2. להפעיל את ה-PCR הצנטרפוגה תרמי עם הפרמטרים הבאים: 98 ° C למשך 3 דקות, 98 ° C ל 30 s (שלב 2), 63 ° C ל 30 s (שלב 3), 72 ° C ל 30 s (שלב 4), חזור על השלבים 2\u20124 עוד 34 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות , ולהחזיק ב 4 º C.
    3. לפתור את התגובה על ג'ל agarose 2% באמצעות מאגר x TAE 1.
    4. לסלק את המוצר PCR של הג'ל עם איזמל נקייה, חדה ולטהר את הדנ א באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, על פי הוראות היצרן. למדוד את הריכוז של המוצר PCR באמצעות ספקטרופוטומטרים באורך-גל של ספיגת 260 ננומטר (ראה טבלה של חומרים).
    5. להכין תערובת assay המכיל 200 ng של דנ א, 2 µL של תגובה T7EI מאגר (10 x), כיכב µL עד 19 עם ddH2O (ראה טבלה של חומרים).
    6. Anneal מחדש את המוצר PCR הצנטרפוגה תרמי באמצעות הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, כבש עד 25 ° C-6 ° C/דקה, אז להחזיק ב 4 º C.
    7. הוסף 5 U T7EI למוצר ה-PCR מחדש annealed, מערבבים היטב בעזרת pipetting, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות.
    8. לפתור את הדנ א T7EI-מעוכלים על ג'ל agarose 2.5% באמצעות מאגר x TAE 1.
    9. תמונה הג'ל לכמת עוצמות הלהקה באמצעות ImageJ, לחשב את קצב היווצרות ויאסין באמצעות הנוסחה הבאה:
      נוסחת אחוזי אינדל; משוואה למוטציות הכנסה/מחיקה; יישומי ניתוח גנטי.
      שם מייצג עוצמת מוצר ה-PCR תקין ו- b, c תואמות עוצמות מוצרי ביקוע43.
      1. כדי לכמת את העוצמה של הלהקה ב- ImageJ, קודם צייר תיבה מלבנית סביב הלהקה כמו בקרבת הגבול שלה ככל האפשר. שנית, לחץ על נתח , ולאחר מכן להגדיר מידות. ודא כי האפשרויות באזור, כלומר ערך אפורו צפיפות משולב נבדקים. יציאה בחלון הגדרות על-ידי לחיצה על אישור. שלישית, לחץ על נתח , ולאחר מכן למדוד. מתכוונת או את הערך RawIntDen משמש את עוצמת הלהקה.

תרשים תהליך עריכת גנים של CRISPR עם הגדרת PCR, בדיקת מחשוף אי התאמה, תוצאות NGS.
איור 6 : בדיקת תאים עבור גנום מוצלחת עריכה תוצאות. () A מפרטים טכניים הממחישות שניים נפוץ בשימוש מבחני, כלומר המחשוף אי-התאמה assay עם endonuclease T7 אני אנזים (T7EI), הדור הבא רצף (הגדרות) או רצף אמפליקון יישוב. מלבנים אופקיים כחול מצביעים על ה-DNA, העיגולים הצהובים מצביעים על שינויים המושרה על ידי מערכת CRISPR-Cas. צבעי יסוד וזמינותו T7E1 מסומנים בירוק, ואילו צבעי בסיס ליצירת amplicons עבור הגדרות מסומנים באדום. (b) העיצוב של פריימר רצף וזמינותו פצילות T7EI ועבור המיתרים. כאן לוקוס גנומית יעד זה אקסון 45 של הגן CACNA1D האנושית. האתר מיועד שינוי מסומן באמצעות כוכבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. לבצע רצף אמפליקון יישוב (ראה איור 6).
    1. עיצוב תחל PCR כדי להגביר את מיקומה גנומית היעד. מקם לאחד תחל פחות מ 100 bp אבל יותר מעשרים bp מ protospacer.
      הערה: בדרך כלל, הגודל הכולל של מוצר ה-PCR נועדה להיות סביב 150\u2012300 bp (ראה איור 6).
    2. לצרף רצפים נוספים תחל כדלקמן: (א) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[קדימה פריימר] – 3 אינץ '; (ב) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[פריימר הפוכה] –3'.
    3. להגדיר 50 µL PCR התגובה תערובת המכילה 10 µL של ה-PCR התגובה מאגר (5 x), µL 1 של dNTP (10 מ מ), 5 µL של פריימר (10 מיקרומטר), 5 µL של פריימר b (10 מיקרומטר), 0.5 µL DNA פולימראז, 2\u20125 µL גנומית תבנית ה-DNA (תלוי כמה תאים מוינו) , ואז מעל µL עד 50 עם ddH20.
    4. להפעיל את ה-PCR הצנטרפוגה תרמי עם הפרמטרים הבאים: 98 ° C למשך 3 דקות, 98 ° C ל 30 s (שלב 2), 63 ° C ל 30 s (שלב 3), 72 ° C 15 s (שלב 4), חזור על השלבים 2\u20124 עוד 34 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות , ולהחזיק ב 4 º C.
    5. לפתור את התגובה על 2% agarose ג'ל ולטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת חילוץ ג'ל על פי הוראות היצרן. לכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים באורך-גל של ספיגת 260 ננומטר (ראה את הטבלה של חומרים).
    6. לסנתז הבאות עגול 2 תחל ה-PCR: (ג) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3'; (ד) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[ברקוד] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT – 3'
    7. הגדרת תגובת ה-PCR 20 µL לערבב המכיל 4 µL PCR התגובה מאגר (5 x), µL 0.4 של dNTP (10 מ מ), 2 µL של פריימר c (10 מיקרומטר), 2 µL של פריימר d (10 מיקרומטר), µL 0.2 של ה-DNA פולימראז, 2 µL של תבנית ה-DNA (מתוך שלב 7.3.5 מדולל 1: 100), ו µL 9.4 ddH2O.
      הערה: הגורם דילול עבור תבנית ה-DNA עשוי להשתנות בהתאם הריכוז המקורי שלו. אם הריכוז סביב 20\u201240 ng/µL, השתמש גורם לדילול מטריים. בנוסף, לבחור ברקוד שונים עבור כל מדגם ניסיוני, אם ומהצמיגים זהה פריימר b נמצאים בשימוש בשלב 7.3.3.
    8. להפעיל את ה-PCR הצנטרפוגה תרמי עם הפרמטרים הבאים: 98 ° C למשך 3 דקות, 98 ° C ל 30 s (שלב 2), 65 ° C ל 30 s (שלב 3), 72 ° C ל 30 s (שלב 4), חזור על השלבים 2\u20124 עוד 14 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות , ו- 4 ° C החזק.
    9. לפתור 5 µL של כל תגובה על 2% agarose ג'ל כדי לקבוע ההצלחה של מותני. לשלב כל הדגימות ביחד (בהנחה ברקוד שונות שימש במשך כל דגימה), לנקות את ה-DNA במאגר באמצעות ערכת טיהור PCR לפי היצרן הוראות. אם חלק מותני התערוכה מלהקה אחת (המציין את הנוכחות של מוצרים שאינם ספציפיים), לבצע צעד החילוץ ג'ל נוספים.
    10. רצף את הספרייה על מכשיר רצפי התפוקה גבוהה (ראה טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן לייצר קריאות bp 151 לזווג. פריימר רצף קריאה 1 מותאמים אישית שנועדו וכולל שיסופק בנפרד. רצף שלו הוא כדלקמן: Read1_seq: 5' – CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3'. פריימר רצף קריאה 2 אינדקס רצף פריימר הינם סטנדרטיים, מסופקים במחסנית מגיב.
      הערה: T7EI assay ורצף אמפליקון יישוב משמשות כדי לבדוק את היעילות של הגנום עריכה. עם זאת, ניתן לבצע ניסויים אחרים כדי להעריך את יעילות העריכה, בהתאם לסוג ה-DNA השינויים שהוכנסו. לדוגמה, אם אתר ההגבלה נוצר באתר היעד, ניתן לבצע על assay פולימורפיזם (RFLP) הגבלת אורך קטע. זה דומה וזמינותו T7EI חוץ מזה endonuclease הגבלת משמש כדי לעכל את המוצר PCR במקום.

8. הקרנת שיבוטים בודדים

  1. מ שלב 6.3, לפצל את התאים, ברגע שהם מתחילים לקבל confluent. עבור כל שיבוט בודדים, לאסוף את התאים הנותרים ולחלץ את הדנ א על פי שלב 7.1.
  2. לבצע את הבדיקה T7EI עבור כל שיבוטים בודדים לפי סעיף 7.2, למעט שינוי אחד. להגביר את היעד לוקוס גנומית מתאי wildtype, בשלב 7.2.5, במקום להשתמש 200 ng של בדיקת הדנ א בלבד, לערבב 100 ננוגרם של מבחן ה-DNA עם 100 ננוגרם של wildtype ה-DNA.
    הערה: הסיבה לצעד ששונה היא כי כמה שיבוטים ייתכן שעברו המרה biallelic מוצלח, מוטציות homozygous. במקרים כאלה, יהיו להקות המחשוף ב וזמינותו T7EI אם ה-DNA wildtype לא מעורב.
  3. רצף אתר היעד של שיבוטים כי התערוכה המחשוף להקות ב וזמינותו T7EI.
    1. להגביר את מיקומה גנומית ששונתה על-פי שלבים 7.2.1–7.2.4.
    2. להגדיר את התגובה שיבוט הבאים: 4 µL של מוצר ה-PCR, µL 1 של תמיסת מלח, 1 µL של סיירי וקטור (ראה את הטבלה של חומרים).
    3. לערבב בעדינות על-ידי pipetting, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 5 דקות.
    4. להפוך את µL 3 של המיקס תגובה כימית המוסמכת e. coli תאים (כגון TOP10 או Stbl3) (ראה 1 קובץ משלים). מורחים את התאים חיידקי טרנספורמציה על צלחת אגר ליברות עם 50 kanamycin μg/mL.
    5. למחרת, לחסן לפחות 10 מושבות LB המדיה נוזלית המכילה 50 kanamycin μg/mL.
    6. כאשר תרבויות חיידקים הם עכורים, ולבודד פלסמידים באמצעות miniprep של קיט (ראה טבלה של חומרים), אותן באמצעות תקן M13 קדימה או פריימר הפוכה M13 ברצף.
  4. לבצע את תספיג (הידוע גם בשם immunoblot) כדי לקבוע העדר או נוכחות של החלבון יישוב (אם הגנום עריכת הניסוי כרוך לדפוק גן חלבונים באמצעות מוטציות frameshift). עיין בקובץ המשלים 1.
    הערה: ניתן לבצע ניסויים אחרים כדי לזהות השיבוט נושאת את השינויים הרצויים גנומית. לדוגמה, ניתן לבצע assay פנוטיפי אם לדפוק גן מסוים ידוע כגורם שינויים מסוימים בהתנהגות הסלולר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבצע גנום עריכת ניסוי, פלסמיד CRISPR לבטא sgRNA מיקוד שלוקוס-של-הריבית צריכה להיות משובטים. קודם כל, פלסמיד מתעכלת עם אנזים ההגבלה (בדרך כלל סוג של IIs אנזים) כדי linearize זה. מומלץ לפתור את המוצר מתעכל על ג'ל agarose 1% לצד פלסמיד מעוכל להבחין בין עיכול מלאה או חלקית. כמו פלסמידים מעוכל הם supercoiled, הם נוטים לרוץ מהר יותר מאשר עמיתיהם ליניארית (ראה איור 7). השני, שני oligonucleotides עבור sgRNA חייבת להיות annealed, מאתרים לתוך פלסמיד לחתוך. כדי לקבוע אם oligonucleo...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת CRISPR-Cas היא טכנולוגיה חזקה, מהפכני להנדס את הגנום ואת transcriptomes של צמחים ובעלי חיים. זנים חיידקיים רבים נמצאו יכילו מערכות CRISPR-Cas, אשר פוטנציאל עשוי להיות מותאם הגנום, transcriptome הנדסה למטרות44. למרות Cas9 endonuclease של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת (SpCas9) היה האנזים הראשון כדי לפרוס בהצלחה תאים אנושיים21,22,23,24, אנזימים של אחרים בקטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים שאין להם מתחרים אינטרסים כלכליים.

תודות

M.H.T. נתמך על ידי סוכנות מענק משרד המועצה המשותפת של מדע טכנולוגיה ומחקר (1431AFG103), המועצה הלאומית למחקר רפואי גרנט (OFIRG 0017 2016), קרן מחקר לאומי מעניק (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093), משרד החינוך Tier 1 גרנט (RG50/17 (S)), סטארט-אפ הענק Nanyang הטכנולוגי מהאוניברסיטה, ו כספים עבור התחרות הבינלאומית גנטית הנדסת מכונות (iGEM) מאוניברסיטת Nanyang הטכנולוגי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201
שרימפס אלקליין פוספטאז (rSAP)NEBM0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) מאגר, 50Xבסיס ראשוןBUF-3000-50X4Lיש לדלל ל-1X לפני השימוש. תמיסת 1X מכילה 40 מ"מ טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית ו-1 מ"מ EDTA.
מאגר Tris-EDTA (TE), 10Xבסיס ראשוןBUF-3020-10X4Lיש לדלל ל-1X לפני השימוש. תמיסת 1X מכילה 10 מ"מ טריס (pH 8.0) ו-1 מ"מ EDTA.
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigaseNEBM0202400,000 יחידות/מ"ל
ערכת קשירה מהירהNEBM2200אלטרנטיבה ל-T4 DNA Ligase.
ערכת קשירת DNA מהירהThermo ScientificK1423אלטרנטיבה ל- T4 DNA Ligase.
ערכת שיבוט Zero Blunt TOPO PCRThermo Scientific451245תמיסת המלח מגיעה עם וקטור TOPO בערכה.
ערכת NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621Lלהרכבת גיבסון.
זריקה אחת Stbl3 Chemical Qualified E.ColiThermo ScientificC737303
מרק LB (Lennox), אבקתSigma AldrichL3022Repose ב-ddH20, וחיטוי לפני השימוש
במרק LB עם אגר (Lennox), אבקתSigma AldrichL2897Reconstruct ב-ddH20, וחיטוי לפני השימוש
במדיה SOC--2.5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ גלוקוז ב-1 ליטר של מרק LB
Ampicillin (נתרן), USP GradeGold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermixבסיס ראשוןBIO-5185
Agaroseבסיס ראשוןBIO-1000
T7 אנדונוקלאז INEBM0302
ערכת מיצוי DNA פלסמיד Miniprep FavorgenFAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM),היקלוןSH30081.014.5 גרם/ליטר גלוקוז, ללא L-גלוטמין, HEPES ונתרן פירובט
L-גלוטמין, 200 מ"מGibco25030
פניצילין-סטרפטומיצין, 10, 000U/mLGibco15140
0.25% טריפסין-EDTA, 1XGibco25200
בקר עוברי SerumHycloneSV30160 FBS מושבת בחום לפני השימוש ב-56 oC למשך 30 דקות
תמיסת מלח חוצצת פוספט, 1XGibco20012
jetPRIME transfectionreagent Polyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0EpicentreLUCG-QE09050
ISOLATE II ערכת DNA גנומיBiolineBIO-52067אלטרנטיבה ל-QuickExtract
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוההNEBM0491
דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) תערובת תמיסותNEBN0447
6X טעינת DNA צבעThermo ScientificR061110 מ"מ Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% ברומופנול כחול, 0.03% קסילן ציאנול FF, 60% גליצרול, 60 מ"מ
קוקטייל מעכב פרוטאז EDTA, Set3Merck
קרום ניטרוצלולוזה, 0.2 ומיקרו; mBio-Rad1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10XBio-Rad1610772יש לדלל ל-1X לפני השימוש. תמיסת ה-1x מכילה 25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין ו-0.1% SDS.
חוצץ טריס-גליצין, 10Xבסיס ראשוןBUF-2020יש לדלל ל-1X לפני השימוש. תמיסת ה-1x מכילה 25 מ"מ טריס ו-192 מ"מ גליצין.
תמיסת Ponceau SSigma AldrichP7170
TBS, 20Xבסיס ראשוןBUF-3030יש לדלל ל-1X לפני השימוש. תמיסת ה-1x מכילה 25 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5) ו-150 מ"מ NaCl.
Tween 20Sigma AldrichP9416
חלב רזה לבדיקה חיסוניתNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
נוגדן עבור β-actin (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778מספר פריט: C0916
מערכת MiSeqIlluminaSY-410-1003
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo ScientificND-2000
Qubit פלואורומטרThermo ScientificQ33226
EVOS FL Cell ImagingThermo ScientificAMF4300
CRISPR פלסמיד: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138מערכת וקטור יחיד: ה-gRNA מתבטא מאותו פלסמיד.
פלסמיד CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591מערכת וקטורית יחידה: ה-gRNA מתבטא מאותו פלסמיד.
פלסמיד CRISPR: xCas9 3.7Addgene108379מערכת וקטור כפולה: ה-gRNA מתבטא מפלסמיד אחר.
פלסמיד CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230מערכת וקטור יחיד: ה-gRNA מתבטא מאותו פלסמיד.
פלסמיד CRISPR: hCas9Addgene41815מערכת וקטור כפולה: ה-gRNA מתבטא מפלסמיד אחר.
פלסמיד CRISPR: eSpCas9(1.1)Addgene71814מערכת וקטורית יחידה: ה-gRNA מתבטא מאותו פלסמיד.
פלסמיד CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247מערכת וקטור כפולה: ה-gRNA מתבטא מפלסמיד אחר.
גבוה 539134 System

מקורות

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888(2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471(2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62(2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500(2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463(2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35(2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9T7 EndonucleasePCRWestern BlotDNA

מאמרים קשורים