מאמר שיטה

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

DOI:

10.3791/59093

⸱

22 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערת חיות מספקים מערכת משכנעת על חקירת מנגנונים אבולוציונים ובסיסים הגנטי שבבסיס לשינויים רבים תכונות מורכבות, לרבות ניוון העין, לבקנות, אובדן שינה, hyperphagia, והעיבוד החושי. מינים של cavefish מ ברחבי העולם להציג של אבולוציה מתכנסת של מאפיינים מורפולוגיים והתנהגותיים עקב לחצים סביבתיים משותפים בין מערכות שונות מערה. מערת מגוונת מיני נחקרו בהגדרת מעבדה. טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus, עם צורות רואי ועיוורת, סיפקה ייחודי תובנות ותהליכי הביולוגי המולקולרי שבבסיס האבולוציה של תכונות מורכבות, שאיזו היטב כמערכת מודל המתעוררים. בעוד גנים המועמד ויסות ההתפתחות של תהליכים ביולוגיים שונים זוהו mexicanus א, היכולת לאמת תפקיד עבור גנים יחידניים הוגבלה. היישום של transgenesis וטכנולוגיה לעריכת ג'ין יש פוטנציאל כדי להתגבר על מכשול משמעותי הזה וכדי לחקור את המנגנונים האבולוציה של תכונות מורכבות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה שונים מניפולציות ביטוי גנים ב- mexicanus א. גישות כוללים את השימוש morpholinos, Tol2 transgenesis, מערכות עריכה-ג'ין, בדרך כלל בשימוש דג זברה ודגים אחרים מודלים, לתמרן פונקצית ג'ין mexicanus א. פרוטוקולים אלה כוללים תיאורים מפורטים של תהליכי הרבייה מתוזמן, איסוף הביצים, זריקות, הבחירה של בעלי חיים מהונדסים. אלה גישות מתודולוגיים יאפשר לחקירת גנטי והעצבים המנגנונים האבולוציה של תכונות מגוונות ב- mexicanus א.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז מוצא המיניםשל דרווין1, מדענים זכו תובנות עמוקות כמה תכונות הם בצורת אבולוציונית בתגובה מוגדר לחצים סביבתית ואקולוגית, בזכות מערת אורגניזמים2. טטרה מקסיקנית, mexicanus א, מורכב של אוכלוסיות 'משטח' אב קדמון eyed המאכלסים נהרות ברחבי מקסיקו בדרום טקסס ושל אוכלוסיות מבודדת מבחינה גיאוגרפית לפחות 29 של מערת נגזר morphs המאכלסים את אברה דל סיירה, באזורים אחרים של צפון-מזרח מקסיקו3. מספר תכונות הקשורות מערת זוהו mexicanus א, כולל צריכת החמצן מסולף, depigmentation, אובדן של העיניים, ושינינו האכלה, שיחור מזון התנהגות4,5,6, 7,8,9. מתנות mexicanus א במודל רב עוצמה עבור חוקרים מנגנונים של אבולוציה מתכנסת היסטוריה אבולוציונית מוגדרים היטב, אפיון מפורט של הסביבה האקולוגית וכתוצאה הנוכחות באופן עצמאי התפתחו המערה אוכלוסיות10,11. רבים מן התכונות הנגזרות למערה נמצאים ב- cavefish, כולל אובדן עינו, לישון אובדן, גדל האכלה, אובדן של בתי הספר, להפחית תוקפנות, ו מופחתת תגובות הלחץ, התפתחו מספר פעמים דרך מקורות עצמאיים, לעיתים קרובות ניצול מסלולים גנטיים שונים בין מערות8,12,13,14,15. זה חוזר על עצמו האבולוציה הוא היבט רב עוצמה של מערכת mexicanus א , מספקים תובנה השאלה כללית יותר של מערכות איך גנטי עשוי להיות מוטרד כדי להפיק דומה פנוטיפים.

בעת היישום של טכנולוגיה גנטיים מכניסטית חקירת פונקציה ג'ין הגביל ב מיני דגים רבים (כולל mexicanus א), התפתחויות אחרונות דג זברה לספק בסיס לפיתוח טכנולוגיה גנטיות דגים 16,17,18,19,20. כלים רבים נמצאים בשימוש נרחב דג זברה לתמרן ביטוי גנים, היישום של נהלים אלה זמן סטנדרטית. לדוגמה, ההזרקה של מורפולינו oligos (MOs) בשלב תא בודד באופן סלקטיבי חוסם RNA ומונעת תרגום עבור חלון זמן קצר במהלך פיתוח21,22. בנוסף, עריכת ג'ין גישות, כגון מקובצים באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) ותמלול activator דמוי אפקטור נוקלאז (TALEN), לאפשר לדור של מחיקות מוגדר או, במקרים מסוימים, הוספות דרך רקומבינציה הגנום19,20,23,24. Transgenesis משמש כדי לתפעל ביטוי גנים יציב או הפונקציה באופן ספציפי סוג התא. מערכת Tol2 משמש ביעילות כדי ליצור חיות הטרנסגניים מאת coinjecting transposase mRNA עם פלסמיד ה-DNA Tol2 המכילה25,transgene26. מערכת Tol2 מנצל את transposase Tol2 של medaka כדי להפיק germline יציב הוספות של construct17 הטרנסגניים. יצירת Tol2 transgenics כרוך coinjecting של פלסמיד המכיל transgene ולצדו Tol2 ואתרי אינטגרציה mRNA Tol2 transposase17. מערכת זו שימש לייצר מגוון של קווים הטרנסגניים דג זברה ואת השימוש בה התרחב לאחרונה מערכות מודל מתהווים נוספים, כולל cichlids, דגים גמבוזיים, את stickleback, ו, לאחרונה, cavefish מקסיקני27, 28,29,30.

ואילו cavefish היא מערכת ביולוגית מרתק שחקרתי מנגנוני האבולוציה תכונה, יכולת מלאה שלה כמודל אבולוציונית לא היה מלא רתם. זה כבר חלקית בשל חוסר יכולת לתמרן גנטי, הסלולר יפעלו ישירות31. גנים המועמד ויסות תכונות מורכבות זוהו באמצעות תכונה כמותית אתרים כמותיים מחקרים, אך האימות של גנים אלו המועמד היה קשה32,33,34. לאחרונה, נוקאאוט ארעי באמצעות morpholinos, ג'ין עריכה באמצעות מערכות CRISPR ו- TALEN, ואת השימוש Tol2-transgenesis בתיווך שימשו כדי לחקור את הבסיס הגנטי שבבסיס מספר תכונות35,36,37 ,38. יישום והטמעה סטנדרטיזציה של טכניקות אלה יאפשר מניפולציות זה לחקור את הפסיכולוגי עצבית המולקולריים של תכונות ביולוגיות, כולל המניפולציה של תפקוד הגן, תיוג של אוכלוסיות תאים מוגדרים, ו הביטוי של עיתונאים פונקציונלי. ואילו יישום מוצלח של כלים גנטיים אלה לתמרן גן או תפקוד התאים הוכח במערכות דגם מתהווה, פרוטוקולים מפורט עדיין חסרים mexicanus א.

Mexicanus א לספק תובנות מנגנוני האבולוציה בתגובה לסביבה המשתנה הקריטי ולהציג את ההזדמנות כדי לזהות גנים הרומן ויסות תכונות מגוונות. מספר גורמים מראים כי mexicanus א הוא מודל מאוד צייתן להחלת הוקמה גנומית כלי זמין כרגע ויצר מודלים גנטי, כולל את היכולת בקלות לשמור על הדגים במעבדות, גודל שבוחרים גדול, שקיפות, הגנום ברצף וכן מבחני התנהגות מוגדרים39. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לשימוש של morpholinos, transgenesis, ג'ין ועריכה של אוכלוסיית השטח ומערת של mexicanus א. היישום רחבה יותר של כלים אלה ב- mexicanus א יאפשר חקירה מכניסטית התהליכים המולקולרי שבבסיס האבולוציה של הבדלים התפתחותיים, פיזיולוגיים והתנהגותיים בין cavefish לבין משטח דגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מורפולינו oligo עיצוב

הערה: רצפי mexicanus א זמינים דרך המרכז הלאומי של מידע ביוטכנולוגיה (NCBI) ג'ין NCBI ההזמנות (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), כמו גם מהדפדפן הגנום Ensembl (https://www.ensembl.org). בעת עיצוב של מורפולינו לשימוש בשתי צורות השטח - ואת מערת המגורים, חיוני כדי לזהות כל וריאציה גנטית בין morphs בשלב זה, כך ניתן להימנע אלה אזורים גנטיים כמו מטרות עבור morpholinos. כל וריאציה רב-צורתיות בתוך אתר המטרה מורפולינו יכול להוביל איגוד לא יעיל. העיצוב דומה מערכות דגים אחרים, כגון דג זברה, ולאחר שהוצג בעבר לעבוד ביעילות תוך36,21, mexicanus א40.

  1. העיצוב של חסימת-תרגום morpholinos
    הערה: חסימת-תרגום morpholinos לחסום את התרגום על-ידי איגוד לאתר התחלה אנדוגני, לעכב translational מכונות מ מחייב את רצף ה-mRNA דרך הסטריים hinderance.
    1. זיהוי האזור קידוד של הגן היעד החל האתר התחלה ATG.
    2. להקליט זוגות בסיס ראשון 25 של הרצף היעד על-ידי העתקה והדבקה הרצף במחברת עורך או מעבדה טקסט.
    3. באמצעות תוכנה באינטרנט (למשל, http://reverse-complement.com) או תרגום ידנית, ליצור המשלים הפוכה של הרצף היעד. לשמור את המשלים הפוכה וכתוצאה מכך עורך טקסט או מחברת מעבדה.
    4. להזמין את מורפולינו עם הרצף המשלים הפוכה מחברה שיוצר מורפולינו oligonucleotides. ראה טבלה של חומרים עבור חברות.
  2. העיצוב של חסימה אחוי morpholinos
    הערה: חסימה אחוי morpholinos לחסום שחבור, ובכך, למנוע היווצרות של מולקולה mRNA בוגר. זה מספק שיטה חלופית נוקאאוט כאשר האתרים התחלה אינם מוגדרים היטב, או גישה אופטימלית יותר בעת אימות של נוקאאוט באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא הרצויה. זה היתרון של חסימה אחוי morpholinos (מעל חסימת-ATG MOs) היא כי הדרה אקסון או הכללה אינטרון יכול להידרש בקלות עם רוורס טרנסקריפטאז (RT)-PCR, גודל ההבדלים דמיינו על ג'ל. RT-PCR וג'ל אלקטרופורזה כדי לקבוע יעילות מורפולינו צריך להיעשות באמצעות הליכים מעבדה סטנדרטיים.
    1. לזהות את רצף ה-pre-mRNA של הגן היעד. לנצל את המידע הזמין מן הגנום mexicanus א דרך NCBI או Ensembl כדי לקבוע גבולות אקסון-אינטרון33.
    2. יעד אקסון-אינטרון (splice התורם) או אקסון-אינטרון אתרים גבול (splice מקבל) עבור אינטרון הכללה או אקסון הרחקה.
      הערה: ספלייסוזום בדרך כלל מטרות רצף "גו" (U1 יעד) את אינטרון באתר splice 5', רצף AG" "-3' (U2) אחוי intronic אתר היעד. בתנאים רגילים, ספלייסוזום U1 ו- U2 subunits לאגד באתרים אלה יעד על הרצף pre-mRNA של שחבור ראוי להופיע. עם זאת, אם משני רצפי המטרה אלה חסומה על-ידי מורפולינו, ספלייסוזום מעביר לאתר הבא זמין U1 או U2, גורם אינטרון הדרה או אקסון ברצף ה-mRNA. זה יכלול תכנון/אופטימיזציה, בהתאם לאופי הגן מטרה21. באופן כללי, חסימת אתר U1 פנימי הפניות את splice לאתר הבא זמין U1, גורם כריתה אקסון. לחלופין, חסימת צומת splice הראשון או האחרון גורם של הכללה אינטרון כי אין אתר כדי לנתב מחדש את splice כדי. השתמש בתוכנת רצף לחזות את השפעת החרגות שונות נגד הכללות. תחזיות יכול להצביע על פוטנציאל frameshifts או עצירה מוקדמת codons, המציין את אתר יעד יעיל יותר להפרעה mRNA.
    3. ברגע אתר היעד מזוהה, להקליט רצף שלו ב- text book editor או lab. ודא אתר היעד 25 בסיס זוגות (bp) ארוך.
    4. באמצעות תוכנה באינטרנט (למשל, http://reverse-complement.com) או תרגום ידנית, ליצור המשלים הפוכה של הרצף היעד. להקליט רצף שלו ב- text book editor או lab.
    5. להזמין את מורפולינו עם הרצף המשלים הפוכה מחברה שיוצר מורפולינו oligonucleotides. ראה טבלה של חומרים דוגמת חברות.

2. Morpholinos להזרקה

הערה: מספר ריכוזים או אמצעי אחסון של הזרקת מו תצטרך להתבצע כדי לקבוע ריכוז אופטימלי להזריק. זריקות טיפוסי הכמויות נמוכות עמ' 400-800 של מו ההשפעה של נוקאאוט מורפולינו יכול להימשך עד 6 ימים postinjection.

  1. לקבל את המניות מורפולינו. מורפולינו מניות מגיע lyophilized. מימה זה עם סטרילי H2O לפני השימוש בריכוז המניות הרצוי (למשל, 4 מ מ). לאחסן ב- 20 °C עד השימוש.

3. CRISPR gRNA, תמלול במבחנה, ועיצוב הכנה

  1. CRISPR gRNA עיצוב
    הערה: gRNAs נוצרו באמצעות מחקר שפורסם בעבר על-ידי Varshney et al.40 ו- Wierson et al.41.
    1. באמצעות דפדפן הגנום, לזהות את האזור קידוד של הגן עניין. באמצעות את רצף גנומית, לזהות את רצף המטרה gRNA בתוך אקסון על-ידי חיפוש 20 bp נוקלאוטיד היעד רצף התחלה עם GG ואחריו רצף פאם (הגולה). אזור הגן אחרי ההתחלה (ATG) יהיה ממוקד.
      הערה: אם לא ניתן למצוא רצף המטרה עם GG בקצה 5' ב אקסון הרצוי של הגן, אחד או שני של הג's. הרבה מכדי הראשון והשני נוקלאוטידים בקצה 5' של הרצף. עם זאת, 2 ג'י's מעוגנת ב oligo, כמו אלה נדרשים עבור שעתוק T7.
    2. לעצב ולהזמין oligonucleotide של גנים ספציפיים (oligo ת 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3... "). להוסיף את הגן הספציפי 20 bp gRNA היעד רצף (מודגש) ללא הרצף פאם בין רצף יזם T7 (אדום) רצף חפיפה נהגה anneal ל oligonucleotide השני (כחול). Anneal ומגבירים (ראה שלב 3.2.1) זה oligo A ו- oligo השני (oligo ב': 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') כדי ליצור את תבנית gRNA המשמש שעתוק.
      הערה: Oligo B זהה עבור כל תגובה, צריך רק להיות הורה 1 x.
  2. תמלול והכנה gRNA
    1. Anneal ומגבירים את oligos. כוללים את תחל הבאה כדי להגביר את gRNA על מנת להגביר את התשואה: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (פריימר T7) ו- 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA פריימר). ביצוע של PCR באמצעות פולימראז Thermococcus kodakaraensis (KOD).
      הערה: עבור שני תחל ב- oligo A ו- oligo B 10 מחזורים מומלצת עבור תשואה טובה. פרוטוקול מפורט ניתן למצוא Wierson et al.41.
    2. לתמלל את gRNA באמצעות ערכות זמינים מסחרית שעתוק במבחנה (ראה טבלה של חומרים). זה נעשה באמצעות שינויים היצרן'פרוטוקול s שפורסמו על-ידי Klaassen et al.42.
    3. לזרז, לשטוף, resuspend את gRNA כפי שתואר על ידי Klaassen et al.42.
      הערה: עליך resuspended את gRNA במים נטולי RNase כדי למנוע השפלה.
    4. להקליט את הריכוז של gRNA, אשר יכול להיקבע באמצעות ספקטרופוטומטרים. להעריך את איכות הרנ א על ידי פועל 2 µL ג'ל agarose. RNA aliquot כדי להימנע ההקפאה/ההפשרה ואחסן אותו ב- 80 °C עד מיד לפני הזריקות.
  3. תמלול והכנה Cas9
    1. Cas9 mRNA יש לשעתק באמצעות ערכות זמינים מסחרית שעתוק במבחנה (ראה טבלה של חומרים) כפי שתואר לעיל43. השתמש את הגירסה של nls-Cas9-nls43.
    2. להקליט את ריכוז gRNA, להעריך את איכותם על-ידי פועל 2 µL ג'ל agarose. RNA aliquot כדי למנוע ריקבון מתעוררת דרך מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה, ומאחסנים את aliquots ב-80 מעלותצלזיוס.

4. הכנת מבנים Tol2, Tol2 transposase, transgenesis

  1. היכונו Tol2 transgene בונה הזרקה.
    הערה: אנחנו בהצלחה מסויימת דג זברה לאור/זמינים ובונה medaka ב mexicanus א. מבנים אלה פועלים באופן תקין ב- mexicanus א, ככל הנראה בשל רמה גבוהה של רצף הומולוגיה (עיין המאגר AddGene ומסדי נתונים ברשת מידע דג זברה [ZFIN] עבור מבנים זמינים). השברים יזם דג זברה הביעו את transgenes ברקמות הצפוי בעת שימוש ב- א mexicanus.
    1. Tol2 בונה או ליצור פלסמיד עם מקדם רקמות ספציפיות, transgene הרצוי והזרועות Tol2 (ראה קוואן ואח44). עם קבלת, רצף הבונה כדי לאמת את פלסמיד.
    2. ביצוע של midiprep עבור מבנים על פי היצרן's הנחיות. Elute את פלסמיד הסופי ללא RNase H2O, לקבוע הריכוז עם ספקטרופוטומטרים, לדלל את ריכוז עד 100–300 ng /μL, ואת aliquot החנות המבנה ב-20 °C.
  2. לעכל Tol2 transposase פלסמיד, לסנתז mRNA.
    1. להשיג עותק של פלסמיד transposase Tol2 (מחשבים-zT2TP) כתבנית ליצירת Tol2 mRNA45.
    2. Midiprep המחשבים-zT2TP לבנות על פי היצרן's הנחיות. Elute זה באמצעי אחסון נמוכה של מים נטולי RNase או מאגר (~ 50 μL). לאחסן את aliquots ב-20 °C.
    3. לעכל את פלסמיד Tol2 שימוש באנזים הגבלה.
      1. מבצע תקציר הגבלת 10 µg של מחשבים אישיים מעגלית-zT2TP פלסמיד באמצעות טבלה 1.
      2. לפצל את התגובה לתוך 2–μL 50 תגובות, התגובות בין לילה-37 °C ב הצנטרפוגה תרמי דגירה.
      3. למחרת, בטל את האנזים על ידי חימום זה 65 °C למשך 20 דקות.
      4. לטהר פלסמיד ליניארית מיד לאחר התקציר, באמצעות זמינים מסחרית PCR טיהור ערכות (ראה טבלה של חומרים) לפי ההנחיות יצרנים' . Elute את פלסמיד ב 15 μL נטולת RNase H2O ולקבוע את הריכוז של המוצר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
      5. לרוץ μL 1 של פלסמיד מעוכל, μL 1 של פלסמיד נימולים על agarose 1.5% ג'ל כדי לאשר פלסמיד ליניארית.
    4. ביצוע של שעתוק במבחנה של Tol2 mRNA.
      1. לנצל את µg 1 של מחשבים אישיים ליניארית-zT2TP פלסמיד כתבנית עבור שעתוק. בצע את היצרן's הנחיות שעתוק במבחנה (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתואר בטבלה 2.
      2. דגירה על 37 °C ב הצנטרפוגה תרמי לפי היצרן's הנחיות.
      3. להוסיף 1 µL של DNase, דגירה זה על 37 °C ב הצנטרפוגה תרמי לפי היצרן's הנחיות.
      4. לבצע ליתיום כלוריד משקעים לכל פרוטוקול ערכת שעתוק. Resuspend בגדר RNA ב ~ 20–μL 30 ללא RNase H2O.
      5. לקבוע את הריכוז של המוצר על-ידי שימוש ספקטרופוטומטרים ולהקליט את איכות ה-RNA.
      6. לדלל את המוצר ~ 100–300 ng/µL ו- aliquot זה לתוך 5–10 μL דוגמאות כדי להימנע ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה. לאחסן אותם ב- 80 °C עד השימוש.
        הערה: זה אפשרי לבדוק 1–µL 2 של mRNA מטוהרים Tol2 השמצות/להקה עם אלקטרופורזה בג'ל.

5. microinjections

  1. הכנת הכלים הכלליים לזריקות
    הערה: ההליכים בסעיף זה תוארו בפירוט על-ידי Kowalko et al.46, מבט כולל על שינויים מזעריים מוצג כאן.
    1. צור הזרקת צלחות על ידי שפיכת agarose 3% חם מומס במים מערכת דגים לתוך 100 מ ל צלחת פטרי. בזהירות מקום של עובש הזרקת ביצה agarose טרי יצוק כדי להפוך בארות ביצי הדג. מניחים בצד של העובש אגר בזווית של 45° , ואז הורידו אותו לאט לתוך agarose; לאט לאט הנמכת כייר בזווית מונע אוויר להילכד מתחת העובש. הסר בעדינות את התבנית, ברגע agarose פני השטח למוצק. הלוחות ניתן לאחסן, אטום, ב 4 °C עד 1 לשבוע.
    2. משיכה נידלס של נימים זכוכית בורוסיליקט להזרקה ב פולר אלקטרודה/המחט לפי היצרן's הנחיות. פרוטוקול זה ישתנו לפי פולר פיפטה; עם זאת, ניתן למצוא תוכנית משיכת מחט לדוגמה בטבלה3.
      הערה: אופטימיזציה של המחט חשוב לזריקות, כמו מחטים ארוכות מדי לכופף במקום נקי לחדור את הביצית.
    3. הופכים פיפטות זכוכית גדול נשא העברת הביצית על ידי שבירת פיפטות זכוכית רגילה אז הפתח מספיק גדול עבור הביצים. באמצעות מבער בונזן, ללטש את הקצה השבור של הזכוכית על ידי חשיפת בסוף פיפטות שבור ללהבה עד שהיא חלקה.
  2. רבייה ההתקנה
    הערה: ישנם פרוטוקולים שונים רבים המשמשים כמקום לרביית mexicanus א. ראו פרוטוקול מפורט, Borowsky39. להתחיל את ההתקנה רבייה 1 שבוע לפני הזריקות.
    1. יום 1, מקום 2-3 נקבות 3 ו- 4 זכרים בטנק יחיד גלון 10 ומתוחזק על ± 1 24 °C.
    2. בימים 1–7, להגדיל את ההאכלה ~ 3 2x יום. ודא שהדיאטה כוללת מזון חי, כגון תולעים שחורות, שרימפסים.
    3. יום 6, להוסיף תנור טנק בודד מוגדר 27 °ג מעבדה טמפרטורות טנק יכול להשתנות; לכן, זה יהיה גידול של–2 3 °C יחסית הטמפרטורה טנק נורמלי.
    4. בערב של יום 7, אשר הערב (zeitgeber [ZT] 9–11) של הזרקת בלילה, ביסודיות לנקות את הטנקים עם ספוג ספוג מים ולהסיר עודפי מזון או פסולת באמצעות רשת קנס נטו או הקונכייה.
    5. בליל יום 7, להתחיל. לחפש ביצי דגים משטח-ZT15 ולהמשיך לבדוק כל 15–30 דקות עד ZT18. עבור cavefish, להתחיל. לחפש ביצים-ZT17 ולהמשיך לבדוק כל 15–30 דקות עד ZT20.
      הערה: הזמנים מבוססים על 14:10 מחזור אור h: אפל באמצעות zeitgeber זמן. גידול פי הערכות, מעבדות בודדות יש לקבוע באותו הזמן. . זה קריטי כדי לאסוף את הביצים בקרוב לאחר שהן שוחרר/מופרית על מנת להזריק אותם בשלב תא בודד
  3. אוסף של תא בודד שלב ביצים
    1. הלילה שבו צפוי גידול, לבחון הטנקים כל 15–30 min וצג עבור הביצים בתחתית המיכל. ביצים מופיעים שקוף, מדידת כ- 1 מ מ קוטר.
    2. השתמש דג רשת קנס נטו כדי לאסוף את הביצים ולהעביר אותם לקערה כוס מלאה במים מערכת דגים טריים. לבחון את הביצים במיקרוסקופ כדי לאשר כי הביצים הן בשלב אחד-cell.
    3. באמצעות פיפטות זכוכית, להעביר תא בודד ביצים הלוחות הזרקה. פיפטות זכוכית נדרשים בשלב זה כמו הביצים ידבק פלסטיק.
    4. בזהירות בעזרת פיפטה, לשחרר את הביצים לתוך הבארות של צלחת הזרקת agarose של סעיף 5.1. למלא את השורות של צלחת הזרקת prewarmed (בטמפרטורת החדר) המספר המרבי של ביצים (30–40 שורה, ועד חמש שורות). שורות מלא לסייע למנוע את הביצים לזוז במהלך זריקות. לשמור את הביצים להתייבש על הצלחת ההזרקה עם כמות קטנה של דגים מערכת מים עד בצוע של הזריקות.
  4. פיקו-הזרקת התקנה והנחיות אופטימיזציה הזרקת כללי
    1. מילוי מחטים הזרקת באמצעות פיפטה העמסה ג'ל או טיפים מתאימים בתוך נימי או שימוש רגיל micropipette טיפים הוספת–2 4 µL בעירוי דרך הוריד עד הסוף. ברגע שהמחט מלא, להשתמש מלקחיים כדי לקצץ את אורך עודף של המחט הזרקה.
    2. לבצע microinjections באמצעות מחט לטעון micromanipulator, מחובר microinjector picoliter.
    3. להגדיר את הזמן הזרקת 0.03 s והלחץ החוצה בבית ~0.0 psi. הלחץ הזרקת ישתנו בהתאם עם הבדלים קלים בין מחטים, אז למטב את פעולותיי כדי להשיג מזון לעוס הזרקת nL ~1.0.
      הערה: הזרקת הלחץ הוא לעיתים קרובות בטווח של ~ 10–30 psi.
    4. לתקנן את בולוס הזרקת על ידי הזרקת לתוך שמן מינרלי ומדידת בולוס את גודל עם מיקרומטר שקופית כדי להשיג ~ 1–1.5 נפח הזרקה nL. התאם את הלחץ הזרקה (psi) כדי להגדיל או להקטין את העוצמה בולוס.
    5. שאיבת מים מחוץ לראש הביצים בעזרת טישו מעבדה.
      הערה: chorion ביצים Astyanax זה קצת יותר קשה לחדור יותר ביצי דג זברה. אנו מוצאים כי ציור המים ליד החלק העליון של הביצים מסייע להקל על המחט חדירה לתוך הביצית. צלחת אופטימיזציה יכול לאפשר ~ 200 ביצים על לוח אחד.
    6. השתמש את micromanipulator כדי לחדור כל ביצה עם המחט, ולהזריק ישירות לתוך החלמון. ברגע בכיוון החלמון, להזריק את הביצה על ידי לחיצה על דוושת רגל הכנס כפתור או הזרקה.
      הערה: יכול להיות מוזרק צלחת מלאה בתוך ~ 15 דקות. השלב תא בודד נמשך ~ 40 דקות.
  5. הזרקה של morpholinos
    הערה: כמות מורפולינו צורך נוקאאוט מבלי לגרום רעילות יצטרכו להיות מותאם לכל הגן היעד; עם זאת, ריכוז 400 פ ג הוא מקום טוב להתחיל.
    1. להכין מורפולינו כך להיות מוזרק pg 400 של מורפולינו לכל ביצה. מורפולינו הפשרה על קרח. הפתרון הזרקת מורכבת מורפולינו (על הריכוז הרצויה), נטול RNase H2O או Danieau's פתרון, פנול אדום (10% של הכרך האחרון). לקבלת דוגמה, ראה בטבלה 4.
    2. להזריק 1 nL לכל העובר.
  6. זריקות CRISPR
    1. להכין RNA כך pg 25 של gRNA ו- 300 פ"ג של mRNA Cas9 הכולל להיות מוזרק לכל העובר. לקבלת תערובת הזרקה מדגם CRISPR/Cas9, ראה טבלה 5.
    2. להזריק 2 nL של gRNA/Cas9 ה-mRNA לכל עובר ישירות אל העובר.
  7. הזרקה של Tol2 transposase, Tol2-מלון פלסמיד עבור transgenesis
    1. הפשרת transposase mRNA, פלסמיד Tol2 על הקרח. שילוב Cas9 mRNA (ב 25 ng/µL), לבנות Tol2 הרצוי (בגיל 25 ng /μL), פנול אדום (≤10% של הכרך האחרון) במים נטולי RNase. לקבלת דוגמה Tol2 transgenesis הזרקת תערובת, ראה טבלה 6.
    2. שמור את הזרקת פתרון ומחטים על קרח כדי למנוע ההשפלה של mRNA. להזריק-1 nL בכרך לכל העובר.

6. לגידול וסינון מוזרק דגים

  1. גידול דגים מוזרק
    1. אחרי הביצים מוזרקים, מיד להעביר אותם מלא ~ 200 מ ל מים המערכת דגים קערות זכוכית (10 x 5 ס מ). ביצים הן לשטוף בקלות על ידי לטבול הלוחות הזרקה לתוך קערות מלאות דגים את הביצים עם פיפטה מים ושטיפה.
    2. למקם את העוברים מוזרק 80–~ 50 לכל קערה, אחורי אותם על 22–24 °C.
    3. לנקות את הקערות עם דגים מוזרק 2 x ליום כדי להסיר את העוברים מת ולשנות ~ 20% של המים על בסיס יומי.
    4. גידול נוספים מתבצע על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר39.
  2. הקרנה של יחידים המוזרק מורפולינו
    1. דמיינו את החיות תחת stereomicroscope עבור פנוטיפים מסך. ההשפעה של morpholinos יכול להימשך למעלה ל ~ 5 ימים postinjection21.
    2. למדוד פנוטיפים התנהגותיים-postinjection 4 ימים.
  3. הקרנה של CRISPR indels
    1. עיצוב תחל כדי להגביר את הדנ א מסביב למטרה. לעצב תחל כך המוצר PCR היעד הוא כ 100–125 bp.
      הערה: לדוגמה, עבור מיקומה oca2 , אזור סביב אתר היעד gRNA היה מוגבר באמצעות פריימר לפנים 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' ופריימר הפוכה 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' עבור המוצר PCR אורך 105 bp.
    2. להקריב את העוברים או פין קליפ דגים בוגרים לפי הפרוטוקול בעלי חיים מוסדיים.
    3. לאסוף עוברי או סנפירים ביתור לתוך המבחנות, לחלץ את הדנ א ולבצע PCR מותני. דוגמת פרוטוקולים עבור תחל גנים ספציפיים ניתן למצוא Ma et al.35.
    4. להעריך עבור מוטגנזה מכוונת, לרוץ 5 תגרום µL של מוצר ה-PCR על ג'ל 3% agarose ב 70 V עבור 3 ה DNA (nonmutagenized) פראי-סוג מוצר ה-PCR כלהקה ברורים. מוטציה DNA תגרום להקה smeary על הג'ל.
    5. כדי לקבוע את הרצף של אללים mutant, ת א לשבט את המוצר PCR על פי היצרן's הוראות, לקחת את המושבות, תרבויות miniprep. לשלוח את ה-DNA שנוצר עבור רצף.
    6. להקים ולקיים קווים של דגים משדר אללים mutant, חצו דגים מוזרק המבוגרים פראי-סוג דגים, ומסך 5–עוברי 10 כדי לקבוע אם לשאת כל אחד הוא צאצא של אלל mutant של הגן בעקבות צעדים 6.3.1-6.3.6.
      הערה:1 F שונה מיחידים אותו הדג מייסד0 F יכול לשאת מוטציות שונות. ודא הקווים המוטנטים הינם וסודרו להשיג מוטציות חזה כדי לייצר אללים הנמצאים מחוץ למסגרת.
    7. זיהוי דג נושאת אלל mutant PCR באמצעות וזמינותו הלהקה smeary (צעדים 6.3.1-6.3.6) או על ידי עיצוב ספציפי אלל PCR תחל המדגישים מוטציה ולהקות פראי-סוג (איור 2C).
    8. לאחר שורה של דגים הוא הוקם, homozygose אללים mutant לבדיקת פנוטיפים רצסיבי.
  4. הקרנה של אנשים חיוביים מהונדס
    הערה: שימוש בונה המכיל מכונת פלורסנט מומלץ כדי לייעל את ההקרנה עבור הטרנסגניים אנשים חיוביים. עם זאת, תקן ה-PCR הקרנת שיטות יכול לשמש עבור שידור מסך.
    1. המחש רקמות ספציפיות חלבונים פלורסנט בדגים0 F מוקדם ככל postinjection יומיים, עם epifluorescence לנתח היקף.
      הערה: הביטוי ב- F0 הזחלים הוא פסיפס, אנשים חיוביים שיש מגוון פנוטיפים הביטוי.
    2. לשמור אנשים חיוביים כמו F0 מייסד הדגים.
    3. כאשר F0s מגיעים לבגרות, backcross דגים המייסדים ליחידים nontransgenic נגזר מן המלאי באותה אוכלוסייה/מעבדה. מסך F1 צאצאים באמצעות פרוטוקול אותה כפי שמתואר בשלב 6.2.
      הערה: הביטוי ב- F1 הזחלים אחיד ומבטיחה עקביות בין אחים1 F.
    4. מאז Tol2 אינטגרציה אינה בתיווך האתר, שילוב יכול להשתנות בין המייסדים, בחר F1 אחים נגזר למייסד0 F יחיד, interbreed לבטא חיובית אחים1 F כדי להפיק F2s. הצאצא הזה יהיה בסיס קו יציב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר אוכלוסיות של שוכני המערה mexicanus א מראים שינה מופחתת ערות/פעילות מוגברת יחסית שלהם בני מינו של השטח-דיור14. Hypocretin/orexin (HCRT) neuropeptide שנשמרת מאוד, אשר פועל להגברת ערנות, שיבושים HCRT בשביל לגרום narcolepsy בני אדם אחרים47,יונקים48. בעבר הראו המערה mexicanus א הגדילו ביטוי של פפטיד HCRT, רומז כי ביטוי מוגבר של פפטיד זה עשויה ביסוד האובדן של שינה cavefish38. נוקאאוט מו הביטוי h...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנחנו מסופקים מתודולוגיה מניפולציה ג'ין פונקציה באמצעות morpholinos, CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה מתודולוגיה transgenesis. העושר של טכנולוגיה גנטית ואופטימיזציה של מערכות אלה דג זברה סביר יאפשר העברת מכלים אלה לתוך mexicanus א עם נוחות52. הממצאים האחרונים השתמשו גישות אלה ב- mexicanus א, אך הם נשארים underutilized לגבי חקירת תכונות מורפולוגי, התפתחותיות, התנהגותיות מגוונת זו מערכת30,36,42...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים Sunishka טהאקור על לה סיוע genotyping והדמיה הדג מוטציה oca2 מתואר באיור2. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) פרס 1656574 A.C.K. פרס ה-NSF 1754321 J.K., A.C.K., פרס לאומי מכונים לבריאות (NIH) R21NS105071 A.C.K., E.R.D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גידול דגים ואספקת ביצים
רשת דגים רשת עדינהPenn PlaxBN4
מחמם מיכל דגיםAqueon100106108
מלכודות ביציםבהתאמה אישיתNAוליצור סורג פלסטיק להצבה בתחתית המיכל כדי להגן על ביצים
פיפטות זכוכיתפישר Scientific13-678-20C
נורות פיפטהפישר סיינטיפיק03-448-21
AgaroseFisher ScientificBP160-500
תבניות ביציםכלי מדע אדפטיביTU-1
Morpholino Supplies
Control MorpholinoGene Tools, LLCבקרה סטנדרטית olio
Custom MorpholinoGene Tools, LLCNA
פנול אדוםסיגמא אולדריץ'P0290-100ML
em>CRISPR אספקה
Cas9 פלסמידAddGene46757
GoTaq DNA פולימראזPromegaM3001
KOD התחלה חמה TaqEMD Millipore71-842-3
פריימריםמשולבים DNA טכנולוגיותמותאם אישית
T7 Megascript ערכתאמביון / תרמופישרAM1333
miRNeasy KitQiagen217004
mMessage mMachine T3 ערכתאמביון / תרמופישרAM1348
MinElute ערכתQiagen28204
Tol2 transgenesis Supplies
pCS-zT2TP פלסמידKawakami et al., 2004בקשה מהמחבר
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF Restriction Enzyme New EnglandBiolabsR3189
PCR ערכת טיהורQiagen28104
SP6 mMessenger Kitאמביון / ThermofisherAM1340
<חזק>אספקת מיקרו הזרקה< / חזק>< / em>
זכוכית צינורות נימייםSutter InstrumentsBF100-58-10
מושך פיפטותSutter InstrumentsP-97
Picoinjectorוורנר אינסטרומנטסPLI-100A
מיקרומניפולטורWorld Precision InstrumentsM3301R
מעמד מיקרומניפולטורWorld Precision InstrumentsM10
בסיס MicmanipulatorWorld Precision Instrumentsבסיס צלחת פלדה, 10 ק"ג
עיצוב <הבכיר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877(2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105(2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055(2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307(2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823(2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808(2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637(2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113(2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637(2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841(2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRTol2DNA

מאמרים קשורים