מאמר שיטה

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 ביוני 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן שגרתי ובאמצעות ג'ל פוליאקרילמיד משמשים לאפיון מורכבות של ריבונאופלפרוטאין (RNP) ולמדידת גודל RNA, בהתאמה. כמו שיטות רבות של הדמיה ג'ל להשתמש כתמים לא ספציפיים או בדיקה fluorophore יקר, רגיש, להפלות, ומתודולוגיות הדמיה חסכונית-ג'ל הם רצויים מאוד. RNA רצפי הליבה של מנגו הם קטנים (19-22 nt) רצף מוטיבים כי, כאשר נסגר על ידי גזע שרירותי RNA, יכול להיות פשוט ובזול מצורף ל-RNA של עניין. אלה תגי מנגו לאגד עם אהדה גבוהה וספציפיות thiazole-כתום fluorophore ליגיום הנקרא TO1-Biotin, אשר הופך אלפי פעמים פלורסנט יותר על הכריכה. כאן אנו מראים כי מנגו I, II, III, ו IV יכול לשמש במיוחד בתמונה RNA ב ג'לים עם רגישות גבוהה. קצת כמו 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA בג הרפתקאות ניתן להבחין על ידי ג'ל הטבילה במאגר דימות המכיל אשלגן ו 20 ננומטר TO1-Biotin עבור 30 דקות. אנו להדגים את הספציפיות של מנגו מערכת מתויגים על ידי דימות מנגו-שתייגת ה-RNA בקטריאלי של 6S בהקשר של תערובת מורכבת של רנ א חיידקי הכולל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנגו הוא מערכת תיוג RNA המורכב מסדרה של ארבעה RNA פלורסנט קטנים aptamers לאגד בחוזקה (כריכת nanomolar) כדי נגזרות פשוטות של thiazole-כתום (TO1-Biotin, איור 1A)1,2,3 . עם הכריכה, הקרינה הפלואורסצנטית של זה הוא גדל 1,000-to 4,000-לקפל בהתאם לאפאלף המסוים. בהירות גבוהה של מערכת מנגו, אשר עבור מנגו III עולה על זה של חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), בשילוב עם הזיקה של האיגוד nanomolar של ה-RNA מנגו aptamers, מאפשר לו לשמש הן הדמיה וטיהור של RNA תסביכים2,4.

רנטגן מבנים של מנגו אני5, השני6, ו III7 היו נחושים ברזולוציה גבוהה, וכל שלושת Aptamers לנצל את ה-RNA 4 מ א כדי לאגד TO1-biotin (איור 1b– D). הליבות הקומפקטיות של כל שלושת האפתמים מבודדים מרצף ה-RNA החיצוני באמצעות מוטיבים מתאם קומפקטיים. מנגו I ו-II לנצל מתאם גמישה GNRA כמו לולאה כדי לחבר את ליבות מנגו שלהם לדופלקס RNA שרירותי (איור 1B, C). לעומת זאת, מנגו השלישי משתמש מוטיב טריפלקס נוקשה לחבר את הליבה שלה סליל RNA שרירותי (איור 1D, שאריות סגולים), בעוד המבנה של מנגו IV אינו ידוע כעת. כמו הליבה ליגולי מחייב של כל אחד מהאפתמים האלה מופרד מרצף ה-RNA החיצוני על ידי המתאמים הללו, נראה כי הם יכולים להיות פשוט שולבו מגוון של RNAs. ה-rna התלת-ממדי של החיידק (מנגו i), הרכיבים של השמרים מלצונים (מנגו i), ו-rna 5s, U6 rna, ו-C/D scarna (מנגו II ו IV) כל היתה בהצלחה מתויג באופנה2,8, הרומז כי רבים RNAs ביולוגי יכול להיות מתויג באמצעות RNA מנגו מערכת aptamer.

הרפתקאות מקורי וג משמשים בדרך כלל כדי ללמוד RNAs. ג'לים משומשים משמשים לעתים קרובות כדי לשפוט את הגודל או העיבוד של RNA, אבל בדרך כלל, במקרה של כתם בצפון, למשל, דורשים מספר שלבים איטיים ורציפים כדי ליצור תמונה. בעוד כאשר ה-RNA fluorogenic אחרים, כמו תרד RNA וברוקולי, כבר נעשה שימוש בהצלחה עבור הדמיה ג'ל9, אין מערכת apers fluorogenic עד היום בעל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת מנגו, מה שהופך אותו עניין רב לחקור יכולות הדמיה ג'ל של מנגו. במחקר זה, תהינו אם מערכת ה-RNA מנגו יכול להיות פשוט מורחב ג'ל הדמיה, כמו עירור אורכי גל פליטה של TO1-Biotin (510 nm ו 535 nm, בהתאמה) מתאימים הדמיה בערוץ eGFP משותף הפלורסנט ביותר מכשור סריקת ג'ל.

הפרוטוקול שלאחר ג'ל מכתים הציג כאן מספק דרך מהירה במיוחד לזהות מנגו מתויגות מולקולות RNA ב מקורי והרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. זו שיטת הצביעת כוללת ג'ל לטבילה במאגר המכיל אשלגן ו-TO1-Biotin. רנ א מנגו aptamers הם G-ארבעה מבוססי plex ו אשלגן נדרש כדי לייצב מבנים כאלה. באמצעות RNA ששועתק מ מינימלי קידוד מנגו תבניות DNA (לראות את מדור הפרוטוקול), אנחנו יכולים פשוט לזהות מעט ככל 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA ב-הרפתקאות ג ' לים, באמצעות פרוטוקול מכתים ישירה. בניגוד לכתמי חומצות גרעין לא ספציפיות (ראה טבלת חומרים, המכונה SG מכאן), אנחנו יכולים לזהות בבירור מנגו-rna מתויג גם כאשר ריכוזים גבוהים של רנ א מתויג סך קיימים במדגם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הריאגנטים

  1. TO1-ביוטין הפתרון החותמות (ג'ל צביעת פתרון)
    1. לעשות 1 L של 1 מטר מאגר פוספט ב-pH 7.2 בגובה 25 ° c על ידי הוספת 342 mL של 1 M של Na2hpo4 ו 158 ML של 1 m נה2PO4. להתאים את ה-pH ל 7.2 ב 50 mM על ידי הוספת פתרון פוספט מתאים. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את הפתרון בכלי הפלסטיק בטמפרטורת החדר.
    2. להכין פתרון 5x ג'ל מכתים (ללא TO1-Biotin) כדלקמן. לפצות על 1 L פתרון על ידי ערבוב 247.5 mL של ddH2O, 700 mL של 1 m kcl, 50 ml של 1 m פוספט מאגר (pH 7.2), ו 2.5 Ml של רצף 20. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את הפתרון בפלסטלינה. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורת החדר.
      הערה: MgCl2 ניתן להוסיף פתרון זה אם נדרש כפי שהוא יכול לייצב את מכלולי RNA. לזאת תהיה השפעה צנועה. על אות הפלורסצנט2
    3. הפוך את הפתרון 1x ג'ל כתמים באמצעות הפתרון 5x ג'ל מכתים משלב 1.1.2 ו, מיד לפני השימוש, מוסף אותו עם TO1-Biotin fluorophore (ראה טבלת חומרים) לריכוז הסופי של 20 ננומטר. לדוגמה, להוסיף 20 מ ל של הפתרון 5x ג'ל כתמים כדי 80 mL של מים מיועמים כדי להפוך 100 mL של 1 x ג'ל כתמים הפתרון, ולהוסיף 2 μL של 1 מ"מ TO1-Biotin מלאי (מוכן diמתילטופסמיד).
      הערה: מקדם המחיקה עבור הצבע TO1-Biotin ב 500 nm הוא 63,000 M-1· ס"מ-1, נמדד בפתרון מכתים1.
  2. עמוד הרפתקאות (2x הרפתקאות ג'ל טעינת פתרון ופתרונות A, B, C, אמוניום פרסולפט, ו טטרמתיליפילואמין)
    1. הכינו 50 מ ל של 2x העמסה ג'ל טעינת הפתרון על ידי ערבוב 40 מ ל של הטופס1, 0.5 מ ל של 0.5 החומצה האטילילאדיבאמאטאטואצטט (EDTA, pH 8.0), ו 9.5 mL ddH2O. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. הטענת צבעים אינה מתווספת לפתרון זה, כפי שהיא עשויה להסתיר הדמיה פלואורסצנטית.
    2. להכין 2x הרפתקאות ג'ל טוען לצבוע כדלקמן. כאשר טיהור RNA ו-DNA olig, להוסיף 0.5 mL של 2.5% (w/v) ברומאופנול כחול (BB) ו 0.5 mL של 2.5% (w/v) קסילן cyanol (XC) לפתרון המתואר בשלב 1.2.1, ולהוסיף 8.5 ml של ddh2O במקום 9.5 ml. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
    3. להכין 100 mL של הפתרון על ידי שקילה החוצה 200.2 g של אוריאה (משקל הנוסחה: 60.06 g/מול) והוספת אותו ל 312.5 mL של 40% 19:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין. מערבבים את זה עם בר לערבב מגנטי במהירות מקסימלית עד הומס (כ 3 h) ולהפוך את הפתרון ל 500 mL באמצעות ddH2O. שים לב כי הריכוזים הסופיים הם 6.667 M אוריאה ו 25% 19:1 אקרילאמיד: N, n'-מתיונין אקרילי. אחסן ב-4 ° צ' בכלי פלסטיק נקיים.
    4. להכין 1 L של פתרון B על ידי שקילה 400.4 g של אוריאה ולפצות את הפתרון 1 L עם ddH2O; מערבבים עד אוריאה התפרקה. פתרון ב' ניתן לשמור בטמפרטורת החדר.
    5. להכין פתרון C (10x טריס-borate-EDTA [TBE]) כדלקמן. הכן 4 L של 10x tbe על ידי שקילה החוצה 432 g של בסיס Tris ו 220 g של חומצה חומצת, הוספת 160 mL של 0.5 M edta עם pH של 8 (מסוננים), וממציא את הפתרון ל 4 L עם ddh2O. מלאי גדול של מאגר זה נעשה כפי שהוא משמש גם ג'ל פועל מאגר.
    6. הכינו 10% אמוניום פרסולפט (aps) על ידי המסת 1 גרם של APS לתוך נפח כולל של 10 mL של ddh2O. Store ב 4 ° c.
    7. יש לשמור על הטטרמתילילאדיאמין (TEMED) שימושי. אחסן אותו ב-4 ° c ביחד עם פתרון APS.
  3. דף מקורי (פתרון העמסה של 2x של ג'ל יליד)
    1. להכין 50 mL של 2x מקורית ג'ל טעינה פתרון על ידי ערבוב 25 מ ל של 100% גליצרול, 10 מ ל של הפתרון 5x ג'ל כתמים, ו 15 מ ל של ddH2O כדי להפוך את הפתרון ל 50 mL.
      הערה: כמו בסעיף ג'ל הרפתקאות, ניתן להוסיף צבעים למניה הזאת, אבל התוספת שלהם יכולה לטשטש את אות הפלורסנט בג, ולכן יש להימנע מכך.

2. הכנה וטעינה של ג'לים

  1. הכינו ג'ל הרפתקאות עם אחוז מתאים על-ידי ביצוע הטבלה 1. קחו בחשבון את השיטה הספציפית ליציקת ג'ל; 30 מ ג ג'ל משמשים בדרך כלל. אחוז הג המתאים יכול להיות מוערך על ידי שימוש בטבלה 2: לבחור את האחוז אלקטרופורזה שבו הצבעים BB ו-XC יש הרבה יותר מהר ואיטי, בהתאמה, מאשר RNA של ריבית, כדי להבטיח הפרדה גבוהה להקות בגודל הרלוונטי טווח.
  2. פתרונות מערבבים A, B ו-C לפי לוח 1 ולהוסיף APS ו-temed מיד לפני שפיכת ג'ל. מערבבים היטב את הפתרונות בפלסטלינה נקייה.
  3. יוצקים את התמיסה ג'ל לתוך מכשיר מתאים ליציקת ג'ל, לאחר שווידאת שכל הרכיבים נקיים בקפידה. הרם צד אחד של המנגנון כך ג'ל מוטה מעט כאשר מוזג, כדי למנוע כל בועות אוויר להיות לכודים בתוך הג עצמו.
  4. הכנס את המסרק הרצוי והשאר אותו לפולימלזציה (כ -30 דקות). שימו לב לפילמור על ידי התבוננות מקרוב לשינוי במדד השבירה סביב הבארות ג'ל. הפוך את הטנק ג'ל באמצעות 1x פתרון C (1x TBE) ובזהירות להסיר את המסרק. שימוש במזרק, מעמיס את הבארות. מיד לפני הטעינה לדגימה
  5. הכינו דוגמאות לדגימות כדלקמן. הוסף מעבד 2x העברת ג'ל טעינת פתרון לדגימות ה-RNA של עניין כדי להפוך את הג הרפתקאות הטעינה של פתרון 1x ו-החום בטמפרטורה 95 ° c עבור 5 דקות באמצעות הציקלניה או אמבט מים.
  6. לפני טעינת הדגימות, האוויר מצנן אותם כמה דקות עד שהם מגניבים למגע. טען את הדגימות על-ידי שכבות אותן בתחתית כל באר, באמצעות עצות טעינת ג'ל.
    הערה: ניתן להשתמש בעצות עגולות עבור ג'לים בעובי של 1 מ"מ או יותר; להשתמש בטיפים שטוחים ג'לים דקים.
  7. הפעל את ג'ל ההפעלה בטמפרטורת החדר. ודא כי המתח החשמלי הוא נמוך מספיק, כך שלוחות הזכוכית של מערכת הג לא נשברים.
    הערה: במעבדה שלנו, 28 ואט עבור 20 ס מ x 16 ס"מ צלחות היה מספיק למטרה זו.

3. הכנה והעמסה של ג'לים מקומיים

  1. הכינו ג'ל יליד עם אחוז מתאים על-ידי פנייה לטבלה 3. קחו בחשבון את מערכת הליהוק ג'ל ספציפי, אבל זכור כי 30 מ"ל ג'ל משמשים בדרך כלל. מערבבים את הפתרונות של 1x TBE, 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין לאמילאמיד, ו גליצרול על פי שולחן 3, ולהוסיף APS ו temed מיד לפני שפיכת ג'ל. המשך כמתואר בשלבים 2.3 ו-2.4.
  2. הכינו דגימות יליד על ידי הוספת 2x מקורי הפתרון המקורי ג'ל לדגימות RNA של עניין כדי להפוך את הפתרון 1x ולאפשר את זה כדי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 100 דקות לפני הפעלת ג'ל כדי להבטיח קיפול RNA שלם.
  3. הפעל את הג המקורי בחדר קר 4 ° c, וודא שהספק נמוך מספיק כדי לא לחמם את הג.
    הערה: במעבדה שלנו, 14 ואט עבור 20 ס מ x 16 ס"מ צלחות היה מספיק למטרה זו.

4. RNA הכנה על ידי הפעלת שעתוק T7

הערה: רצפי DNA המשמשים את שעתוק הריצה10 של RNA מנגו בנייה הזמינו מסחרית. בשיטה זו, ה-DNA oligT7 מכיל את ההשלמה הפוכה (RC) של שני הרצף להיות משועתק ואת היזם הם הוכלא רצף הגדיל T7 העליון המקדם ולאחר מכן משועתק בתוך מבחנה. להלן, עבור כל מחלת ה, RC של רצף הליבה של מנגו מוצג מודגש ו-RC של אזור היזם T7 מוצג נטוי. שאריות בגופן רגיל מתאימים לאזורים משלימים שרירותיים אחרת הנדרשים כדי לאפשר ליבת מנגו לקפל כראוי.

מנגו I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CGT CGT ACG TCC התגיתTA תג TCC GTC GTA טה AAG
מנגו II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC מCTC TCC מסדרת CGT C GT משחק C
מנגו III: GGC ACG TAC גה תאת ACC כללי הסוכנות TCC TTC CTT CGT ACG TCC C תגTA התגית TCC GTC GTA TTA AAG
מנגו הרביעי: GCA CGT ACT CGT CTC האווירית CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT מסיטי מחסום הפנים TAA AG
T7 העליון סטרנד: CTT TAA TAC GAC TCA CTT תג G

  1. ג'ל היטיבי לטיהור של דנ א
    1. עבור 0.2 μl לפני בקנה מידה סינתזה DNA, להשעות מחדש את ה-DNA הdeprotected olig, הגאות ב 100 Μi של ddH2O ו 100 μl של 2x הרפתקאות צבע הטעינה (משלב 1.2.2). במקרה זה, כולל ג'ל טעינת צבעים בפתרון הטעינה באותו ריכוז כמו בשלב 1.2.2 הוא המועדף.
    2. לטהר את ה-DNA olig, הגאות באמצעות 50 mL בקנה מידה התאמת היקף ג'ל של אחוז אלקטרופורזה המתאים; השתמש בטבלה 2 כדי לבחור את אחוז הג. לדוגמה, השתמש ב-8% ג'ל לרצף של 50 nt. באופן אידיאלי, ברומאופנול כחול צריך לרוץ מהר יותר מאשר מחלת האלכוהול, ו קסילן cyanol צריך לרוץ לאט יותר.
      הערה: במעבדה שלנו, ג ' לים כאלה היו יצוק באמצעות מפרידי הליהוק כי היו 1.5 מ"מ עבה ומסרק ג'ל טעינת עם בארות שהיו 2 – 2.5 ס"מ רוחב.
    3. טען 100 μL של ה-DNA פתרונות olig, הכין בשלב 4.1.2 לכל ג'ל הכנה היטב כמתואר בשלבים 2.4 – 2.7.
    4. יבש בזהירות את החלק החיצוני של הג, להסיר את צלחות הזכוכית, ולכסות את שני צידי הג באריזת פלסטיק. מניחים אותו על מסך הדמיה פלורסנט (אלומיניום מגובים דק לוחיות כרומטוגרפיה לוחות ספוג עם fluorophore הם פתרון חסכוני) ולהשתמש באור קצר באורך גל UV המנורה כדי להמחיש את להקות DNA על ידי הצללה UV.
    5. חדה, צל מוגדר היטב יש לציין אם סינתזה ה-DNA הוא באיכות גבוהה. סמנו את הרצועות על עטיפת הניילון, בעזרת סמן קבוע.
      הערה: להגן על העור והעיניים מפני אור UV ולשמור על החשיפות קצר כדי למנוע פגיעה בדגימת חומצת גרעין.
    6. הצבת ג'ל על צלחת זכוכית נקייה, בזהירות לגזור את הלהקות מסומנים ומקום כל קטע ג'ל ב 400 μL של 300 מ"מ הנאל. . בעזרת מסובבי בטמפרטורת החדר
    7. לשחזר את החומקת בצינור צנטריפוגה נקי להוסיף 2.5 המקבילה של אתנול כדי לזרז את ה-DNA. מערבולת היטב ומניחים את הצינור ב-20 ° c עבור 30 דקות.
    8. גלולה המדגם העליון הספסל צנטריפוגה ב 156,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-ddH2O. השתמש בספקטרוסקופיה כדי לקבוע במדויק את הריכוז של דנ א. אחסן את המדגם כמניה 10 μM לנוחות ב-20 ° c.
  2. תמלול ושעתוק ג'ל לטיהור של דגימות RNA
    1. הכנת 5x נוקלאוטיד טריפוספט (NTP) מניות על ידי ערבוב מניות NTP נוזלי מורכב ריכוז סופי של 40 mM guanosine טריפוספט (gtp, 11,400 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ cytidine טריפוספט (ctp, 7,600 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ אדנוזין טריפוספט (ATP, 5,000 M-1· ס"מ-1), ו 10 מ"מ הטריפוספט (utp, 10,000 M-1· ס"מ-1); כל מקדמי ההשמדה ב 260 ננומטר.
      הערה: מניות נוזלי או אבקה ניתן להשיג מסחרית. אם הכנת מניות ראשיות מאבקה, להתאים בקפידה את ה-pH ל-pH הסופי של 7.9, באמצעות 1 M NaOH. מחלקים את המניה בצינורות המיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ומאחסנים אותה ב-20 ° c.
    2. להכין 100 mL של 10x T7 מאגר תמלול על ידי ערבוב 25.6 mL של 1 M טריס-HCl, 14.4 mL של 1 M טריס base, 26 מ ל של 1 M MgCl2, 10 מ ל 10% טריטון X-100, ו 0.637 g של spermidine. הפוך את המניה לנפח סופי של 100 mL על ידי הוספת ddH2O.
      הערה: pH הסופי של 7.9 של הפתרון 1x צריך להיות מאושר באמצעות מד pH מכויל. 10x צריך להיות סטרילי-מסוננים ומאוחסן ב-20 ° c בגודל הראוי שבציטוטים.
    3. בצע שעתוק כדלקמן.
      1. להוסיף את החומרים הבאים כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 x T7 תמלול מאגר באמצעות המניה 10x T7 מאגר שעתוק ו ddh2O (משלב 4.2.2), 1x ntps, 10 מ"מ של dithiothreitol (dtt), 1 μm העליון הגדיל רצף (ראה סעיף 4 הערה עבור ה רצף), 1 μM ג'ל-מטוהרים מנגו רצף DNA (שלב 2.1), ו T7 RNA פולימראז אנזים (1 U/μL).
      2. מערבולת, ספין למטה, והופך את הפתרון ב 37 ° c עבור 2 h או עד שהוא מעונן ומזרז לבן טפסים בתחתית הצינור. תמלול 50 μL צריך לגרום 50 μL של ~ 50 μM RNA לאחר טיהור ג'ל. הוסף כמות שווה של צבע המעיק על 2x ואחסן אותו ב-20 ° c עד שמוכן לטיהור ג'ל.
    4. ג'ל-לטהר את ה-RNA כתוצאה מכך שמתואר בסעיף הטיהור של דנ א של ה-DNA, על ידי השלבים הבאים 4.1.2 \ u 20124.1.8, החלפת דגימת RNA עבור ה-DNA.
      הערה: RNA הוא רגיש מאוד לירידה RNase, כך להבטיח כי בכל השלבים, כפפות מעיל מעבדה נקי שחוקים כל הזמן. ודא שכל הדגימות מוכנות ומאוחסנות בפלסטלינה לשימוש יחיד כדי להגן מפני זיהום rnase, ולשטוף צלחות זכוכית בזהירות עם סבון חם ומים לפני השימוש, לשטוף אותם ביסודיות עם ddh2O, ויבש את כלי הזכוכית עם ה סיוע של אתנול להחיל מבקבוק לחיצה.
    5. השתמש 1 μL של מדגם ה-RNA הסופי ובאמצעות ספקטרוסקופיה מבוססת droplet, לקבוע את ספיגת ב 260 nm. באמצעות מקדם הכחדה נקבע על ידי השיטה השכנה הקרובה, לחשב את הריכוז RNA ולהתאים את הריכוז לדוגמה 10 μM עם ddH2O לנוחות. יש לאחסן את דגימות ה-RNA ב-20 ° c.
  3. סדאנכיה קולי סך הכל חומצה גרעין גולמי החילוץ
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא דוגמה. פרוטוקול זה משתמש באופן מדוקדק הביע מנגו אני-tagged 6S RNA מתוך פלבאמצע E. coli, ו אינדוקציה מתוך זה פלמיד מתואר במקום אחר בפירוט4.
    1. לצורך מחקר זה, להכין 500 mL של תאים המושרה הן מנגו פקולי-RNA ו-Poli-T1 הפלמידים (התאים הם המושרה על OD600nm של 1). מצנע את התאים ומאחסנים אותם ב-80 ° c לפני השימוש.
    2. לבצע חילוץ RNA כדלקמן.
      1. קח 0.5 מ ל של המושרה הנגרמת תא הגלולה ולהוסיף 500 μL של פנול שולית. ואז, מערבולת המדגם; הפתרון יהפוך לבן חלבי. צנטריפוגה במהירות מקסימלית עבור 2 דקות כדי להפריד את השכבות.
      2. לחלץ את השכבה העליונה, אשר יהיה מעט צהוב, ולחזור על שלב 4.3.2.1 על ידי הוספת נפח שווה של פנול, תפרידו, וחילוץ עבור סך של 5x (או עד השכבה האמצעית, שהיא אטומה לבנה, נעלם רק שתי שכבות ברורות נותרו).
      3. הוסף את הנפח המופק ממים פנול לנפח שווה של כלורופורם, מערבולת, ולאחר מכן, צנטריפוגה במהירות מקסימלית עבור 2 דקות.
      4. לחלץ את השכבה מימית ולהוסיף בריכוז הסופי של 300 מ"מ. מזרז את חומצת הגרעין שהתקבל על ידי תוספת של 2.5 שווי של אתנול, מערבולת, ספין למטה, ומזרז ב-20 ° c עבור לפחות 30 דקות.
      5. גלולה ב צנטריפוגה העליון ספסל ב 15.6 x 1,000 x g ב 4 ° c עבור 30 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 100 μl של ddh2O.
      6. הוסף את הטיפול בתהליך העיכול של DNase להליך זה, בעקבות הפרוטוקול המופנה11, כדי להשיג RNA כולל.
        הערה: מערבולת במרץ עד הגלולה מומס לחלוטין ב-ddH2O.

5. הצביעת לאחר ג'ל

  1. הכינו 1 x ג'ל מכתים פתרון לפי המתכון בשלב 1.1.3 ולהוסיף אותו למיכל זכוכית נקייה כי הוא רחב מספיק כדי להתאים בנוחות את ג'ל.
    הערה: בורוסיליקט מיכלי זכוכית עם עפעפיים מתאימים משמשים היטב למטרה זו.
  2. הוסף מספיק 1x ג'ל מכתים את הפתרון המיכל כך ג'ל מכוסה לחלוטין עם הפתרון ואת הנוזל המרעס מעל החלק העליון של הג כאשר הוא ממוקם על המסלול הסובב.
    הערה: הגורם המכיל חייב להיות גדול מספיק כדי להתאים את ג'ל כך שהוא יכול לנוע ויש לו מספיק מאגר במיכל כדי לכסות במלואו את הג.
  3. לאחר ג ' ל או מהריצה ג'ל סיים ריצה (סעיף 2 או 3, בהתאמה), להסיר את ג'ל מן המנגנון ולנתק את הבארות שלה. זה יכול להיות שימושי כדי להסיר את הפינה של ג'ל לכיוון מאוחר יותר בניתוח.
  4. בזהירות להעביר את הג לפתרון 1x ג'ל צביעת מוכן בשלב 5.2.
    הערה: הג הם שבריריים ונוטים לשבור כל כך להיזהר בעת העברת ג'ל. השאר את המכסה על המיכל כתמים כל הזמן כדי לא לזהם את הג.
  5. מניחים את ג'ל על מסובבי מסלולית במהירות של 100 סל ד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ודא שהג'ל אינו מתקפל חזרה אל עצמו; אחרת, RNA עשוי לנטרל את הג ולכן התווית חלק אחר של הג.

6. הדמיה מנגו-מתויגים RNAs ב ג'ל

  1. הקפדה קפדנית על מאגר ההדמיה. שטפו את הג במהירות במים, והקפדה על שרידי נוזלים מספיק כדי לשמור על הג במקצת בתוך המיכל.
  2. העבר בזהירות את הג אל האימגר. העברה בזהירות להרים את צדי הג ולהניחה על מגש האימגר; לחילופין, הג ניתן לשפוך באיטיות על המגש. ודא כי אין בועות מתחת ג'ל וכי אין נוזל עודף מתחת ג'ל. פיפטה מגולגל על הג יכול להועיל להסרת כל נוזל עודף.
    הערה: השתמש במגבת נייר כדי לספוג את עודפי הנוזלים.
  3. קח תמונה ג'ל, התבוננות זריחה בין עירור גל 510 nm ופליטת אורך הגל 535 nm (למשל, אור ירוק ב 520 ננומטר הגדרות הזריחה על האימג'ר). ודא שההגדרות ממוטבות באופן מלא על הכלי ובצע בזהירות את ההוראות עבור הכלי המשמש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קצר מנגו-tagged RNAs הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול. בהנחה כי הזריחה בתנאים denaturing יהיה קשה ביותר להתבונן בשל הנוכחות של אוריאה ב ג'לים, אנו הראשונים לחקור את ההתנגדות של aptamers מנגו כדי אוריאה, אשר משמש חומצה גרעין denaturant. מצאנו aptamers מנגו עמידים באופן משמעותי כדי לגבות את ריכוז אוריאה של כ 1 M (איור 2A). לפני הוספת ג'ל מכתים הפתרון ג'ל הרפתקאות, הריכוז הסופי של אוריאה ב ג'ל הוא 6 M. הוספת פתרון מכתים מספיק כדי להקטין את הריכוז הזה ל 1 M היה, ולכן, להיות אופטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתרון משמעותי של תג פלורסנט מנגו הוא תג אחד ניתן להשתמש בדרכים מרובות. בהירות גבוהה ואהדה של aptamers אלה להפוך אותם שימושיים לא רק עבור הדמיית תא2 אלא גם עבור מחוץ גופית RNA או rnp טיהור4. לכן, הדמיה ג'ל מרחיב את רב-תכליתיות תג מנגו בצורה פשוטה. רגישות מנגו ג'ל הדמיה היא מעט פחות מזה של הצפון כתמי14 אבל יכול בקלות לזהות 60 – 120 fmol מדגם RNA, מבלי להזדקק להעברת קרום ארוך ומייגע ושלבים חיטוט. זה דומה ליעילות החיטוט המבוססת על הכלאה שנמצאו בעבר RNAs ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פטנט הוא בהמתנה על מערכת fluorogenic מנגו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לרזון קוג'ואו ואמיר אבדולאזדה על הסיוע הטכני שלהם ועל לנה דולגושינה על הגהה של כתב היד. המימון סופק עבור פרויקט זה על ידי מדעי הטבע הקנדי ומועצת המחקר ההנדסה (NSERC) מענק הפעלה P.J.U.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסרק עבה 0.8 מ"מ 14 בארות עבור 30 מ"ל ג'ל PAGELabRepCo11956042
101-1000 ומיקרו; L  טיפיםפישר02-707-511
20-200 ומיקרו; L שימור נמוך  טיפיםפישר סיינטיפיק02-717-143
אקרילאמיד: N, N'-methylenebisacrylamide (40% 19: 1)BioreagentsBP1406-1רעילות חריפה
אקרילאמיד: N, N'-methylenebisacrylamide (40% 29: 1)FisherBP1408-1רעילות חריפה
AgarAnachemia02116-380
צלחת TLC מגובה אלומיניוםSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
אמוניום פרסולפטBiorad161-0700
תאי BL21NEBC2527H
חומצה בוריתACPB-2940
ברומופנול מלח נתרן כחולSigmaB8026-25G
ChloloformACPC3300
DithiothreitolSigma Aldrich AlcoholsD0632-5G
DNase IThermoFisherEN0525
EDTA מלח דיסודיוםACPE-4320
אתנולמסחרי 
P016EAAN טיפים לטעינת ג'ל שטוחCostarCS004854
Formamide 99%Alfa AesarA11076
סט מכשירי ג'ל עם מרווחים ומסרקיםצלחת זכוכית LabRepCo41077017
עם מכסה פלסטיקפיירקס1122963צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים לחתיכת הג'ל שלך
גליצרולאנכימיה43567-540
HClAnachemia464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
אורביטל מסובבמעבדה
PhenolInvitrogen15513-039
טיפים עגולים לטעינת ג'לCostarCS004853
נתרן פוספט דיבסיסיCaledron8120-1
נתרן פוספט מונו-בסיסיקלדרון8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 RNA פולימראזABME041
TEMEDסיגמא-אולדריץ'T7024-50 מ"ל
TO1-3PEG-ביוטין פלואורופורABMG955
TrisBase FisherBP152-500
טריפטוןפישרBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
אוריאהפישרU15-3
קסילן ציאנולסיגמאX4126-10G
תמצית שמריםביושופYEX401.500
1164840001 מזיקים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TO1 BiotinRNARNARNA

מאמרים קשורים