בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

Abstract

עודף צריכת המלח תזונתיים תורמת דלקת ואת ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות של יתר לחץ דם. קודם לכן מצאנו כי אנטיגן תאים דנדריטים (Dc) יכול לחוש נתרן גבוהות חוץ-תאית, המוביל את ההפעלה של אוקסידאז nadph ל היווצרות של isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts. אלה IsoLG-חלבון adducts מגיבים עם עצמי-חלבונים ולקדם אוטואימונית כמו המדינה ויתר לחץ דם. יש שפותחה ואנו ממוטב המדינה-of-the-art שיטות ללמוד הפונקציה DC ביתר לחץ דם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד, ב- חוץ גופית הטיפול עם נתרן גבוהות, והעברה המאמצת של הטחול מאתר CD11c⁺ תאים לתוך עכברים הנמען ללמוד את תפקידם של יתר לחץ דם.

Introduction

עודף מלח תזונה הוא גורם סיכון עיקרי עבור יתר לחץ דם. ^{1 , 2} American Heart Association ממליץ 2,300 מיליגרם (מ ג) של צריכת נתרן (Na⁺) ליום, לכל היותר פחות מ-10% מאוכלוסיית ארה ב מתבונן המלצה זו. ^{3 , 4} צנוע הפחתות צריכת Na⁺ להוריד את לחץ הדם, לצמצם את המקרים החדשים השנתי של מחלת לב כלילית, קו בארה ב 20%. ⁵ בעיה רצינית עם עודף צריכת מלח הוא כי 50% מהאוכלוסיה עם יתר לחץ דם תערוכות מלח-רגישות, כהגדרתו העלאה של 10 מ מ כספית בלחץ הדם בעקבות Na⁺ טעינה או ירידה דומה בלחץ הדם לאחר Na⁺ ההגבלה ו diuresis. ⁶ מלח-רגישות גם מתרחשת ב- 25% של אנשים normotensive, חזאי עצמאית של מוות ושל אירועי לב וכלי דם. ^{7 , 8} מנגנוני חישה מלח יתר לחץ דם המערבים את הכליה. ובכן נחקרו; אולם, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תאי המערכת החיסונית יכולה לחוש Na⁺. ^{9 , 10}

ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים במיוחד כליות נה⁺ טיפול יכול לגרום להצטברות של Na⁺ interstitium ולקדם דלקת. ^{11 , 12} מעבדה שלנו ואחרים הראו כי תאים של שני מולדת, מסתגלת המערכת החיסונית לתרום החרפה של יתר לחץ דם. ^{9 , 13 , 14 , 15} שונים לחץ דם גבוהה לגירויים, כולל אנגיוטנסין II, נוראדרנלין, כי מלח מקרופאגים, ומונוציטים ו- T לימפוציטים לחדור את הכליות ואת להערכת ולקידום השמירה Na⁺ , vasoconstriction, לחץ דם העלאת ונזק סוף-איברים. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} במחקרים קודמים, מצאנו כי DCs להצטבר isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts בתגובה לגירויים שונים עם יתר לחץ דם, לרבות אנגיוטנסין II ו- DOCA-מלח יתר לחץ דם. ¹⁴ IsoLGs מוצרים מאוד תגובתי של השומנים peroxidation במהירות, covalently adduct כדי lysines על חלבונים, הצטברות שלהם קשורה DC הפעלה. ¹⁴ הקמנו לאחרונה כי מוגברות Na⁺ הוא גירוי חזק עבור IsoLG-חלבון adduct-צורה מאתר Dc-⁹ Na⁺ כניסתו DCs מתווך באמצעות מובילי רגיש amiloride. נה⁺ ואז חילופי לקבלת סידן (Ca^{2 +}) דרך בכל הארץ, ד^{2 +} מחליף נה⁺. Ca^{2 +} מפעיל קינאז C (PKC) אשר מפעיל את אוקסידאז nadph ל המוביל סופראוקסיד מוגברת (O₂^{· -}), IsoLG-חלבון adduct גיבוש. ⁹ ההעברה המאמצת של מלח החשופים DCs הפריימים יתר לחץ דם בתגובה מנה תת pressor של אנגיוטנסין II. ⁹

זיהוי של CD11c⁺ DCs רקמות הוגבלה בעבר אימונוהיסטוכימיה, RT-PCR, בידוד של בקרי קבוצת מחשבים הוגבלה לתא מיון לפי cytometry זרימה. למרות cytometry זרימה מיון תא היא שיטה חזקה הבידוד של תאים חיסוניים, שזה יקר, זמן רב, מה שמוביל תשואה נמוכה של התאים קיימא. לכן, אנו יש אופטימיזציה פרוטוקול צעד אחר צעד עיכול רקמת, גירוי במבחנה של העברה המאמצת של CD11c⁺ DCs ללמוד ביתר לחץ דם.

Protocol

אוניברסיטת ואנדרבילט אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש אישרו ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו, דאגו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (Press Academies הלאומית. 2010 המתוקן).

1. בידוד של טחולים של עכברים

1. הכן 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 מ"מ HEPES, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
2. המתת חסד בשבוע 10-12-C57bl/6 בן זכר עכברים באמצעות אינהלציה₂ CO. לרסס את החזה ואת הצדדים של העכבר עם 70% אתנול. בצד שמאל, פתח היטב את העור ואת חלל הצפק לחשוף את הטחול.
3. באמצעות מלקחיים קטנים, בזהירות להזיז את המעיים והכבד לצד השמאלי של העכבר, ושימוש מספריים בסדר בעדינות לסלק את הטחול.
   הערה: שלב זה חייב להיעשות בזהירות רבה כפי נזק מערכת העיכול יכול לגרום לזיהום.
4. מקום הטחול נכרת כל צינור חרוטי שכותרתו 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של RPMI 1640 בינוני.

2. דור של תא בודד המתלים מ טחולים

הערה: הטחול יכול להיות חלופה מועדפת להשעיה תא בודד על ידי שילוב של דיסוציאציה מכני פלוס עיכול אנזימטי.

1. להכין את הפתרון עיכול הטחול על-ידי הוספת collagenase D (1 מ"ג/מ"ל; 0.29 U/מ ג lyophilized) והכנתי DNase (0.1 mg/mL) כדי RPMI 1640 בינוני (ראה שלב 1.1)
2. להשתמש מלקחיים להעביר הטחול לתוך צינור C (הצינור דיסוציאציה) המכיל 3 מ"ל של הטחול עיכול פתרון.
3. לבצע את הדיסוציאציה מכני באמצעות מהמגן חצי אוטומטית בהתאם להוראות היצרן.
   1. מקם את הצינור C על גבי חצי אוטומטיות מהמגן, המבטיח כי הצינור C ממוקמת בחוזקה על זרוע מסתובבת. ברגע הצינור C מושם, ליחצו על כפתור התחל מהמגן חצי אוטומטי כדי להפעיל את פרוטוקול הטחול 04.01 60 s.
      הערה: דיסוציאציה מכני יכול להתבצע גם על ידי הצבת מסנן μm 40 על גבי צינור חרוטי 50 מ ל וגריסה בעדינות הטחול דרך המסנן. לאחר שחיקה הטחול, דרך לשטוף את המסנן מיקרומטר 40 עם 10 מ"ל של מדיה RPMI.
4. לאחר דיסוציאציה מכני, ניתוק ברכבת התחתית מהמגן ולבצע עיכול אנזימטי. דגירה בדגימות למשך 15 דקות ב 37 ° C תחת סיבוב רציף (20 סל ד).
5. להעביר את הפתרון על-ידי pipetting לתוך צינור חרוטי 50 מ ל לאחר שהסתנן דרך מסננת 40 מיקרומטר. לשטוף את מסננת מיקרומטר 40 עם 10 מ"ל של PBS של Dulbecco (dPBS). Centrifuge התאים ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
6. לאחר צנטריפוגה, וארוקן את תגובת שיקוע לחלוטין ולשטוף בגדר מאת resuspending ב- 10 מ"ל של dPBS. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.

3. בידוד של CD11c⁺ DCs מהשעיה הטחול תא בודד

1. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של dPBS וספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer trypan כחול הדרה.
2. גלולה התאים על ידי צריך שתוציאו ב 300 x g, 10 דקות ב 4 º C.
3. וארוקן את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend צנפה ב 400 µL מגנטית מופעל מיון תא מאגר (מקינטוש).
4. להוסיף 100 µL של גרגרי CD11c (ראה טבלה של חומרים) לכל עונה 1 פרק 10⁸ תאים.
5. מערבולת התליה תא דגירה 10 דקות במקרר-4 מעלות צלזיוס.
6. להוסיף 10 מ ל מקינטוש המאגר כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
7. וארוקן את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend ב µL 500 MACs המאגר.

4. הפרדה מגנטית של CD11c⁺ DCs

הערה: הפרדה מגנטית מתבצעת באופן ידני באמצעות מפריד מגנטי (ראה טבלה של חומרים) לבוש עם עמודות LS. ניתן גם לעשות הפרדה מגנטית באופן אוטומטי עם הפרדה מגנטית אוטומטית. (ראה טבלה של חומרים).

1. מקם את העמודה? האם השדה המגנטי של מקינטוש ומפריד צינור חרוטי 15 מ"ל בכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה דרך.
2. יש לשטוף את העמודה LS עם 3 מ"ל של המאגר.
3. מקום התליה תא אל כל עמודה LS ולאסוף את הזרימה דרך המכיל תאים ללא תווית.
4. לשטוף את העמודה LS עם 3 מ"ל של מאגר MACs איסוף התאים ללא תווית לעבור דרך. לשטוף את העמודה LS 2 פעמים נוספות.
5. הסר את העמודה LS במפריד מגנטי. להוסיף 5 מ של מקינטוש מאגר כל עמודה, מיד לשטוף את התאים דיסקות שכותרתו מאת בחוזקה צולל העמודה LS לתוך צינור חרוטי נקי 15 מ"ל.
   הערה: חשוב לבצע עם בידוד כפול של תאים CD11c כדי לקבל השעיה תא טוהר גבוהה. לכן, חזור על שלבים 3.1 עד 4.5. וצור הפניה איור 4 לתקנים טוהר. שלב זה משפר את הטוהר של CD11c⁺ תאים 90 עד 95 אחוז.
6. לקבוע CD11c⁺ DC מספר על hemocytometer באמצעות trypan blue הדרה. לדלל את הדגימה תא ב- 1:1 לדילול בפתרון trypan blue 0.4%.
   הערה: תאים Non-קיימא להיות מוכתם כחול, בעוד התאים קיימא יישאר וללא רבב.
   1. כדי לעשות זאת, בזהירות למלא את hemocytometer של µL 10 של דילול דגימת תאים, תקופת דגירה של 1 דקה.
   2. ספירת תאים 4 ריבועים של 1 x 1 מ מ² בחדר נטען כדי לקבוע את המספר הנייד קיימא.

5. בטיפול חוץ גופית גבוה מלח CD11c⁺ DCs

1. להכין DC תרבות בינוני על-ידי הוספת 10% FBS, 0.1 מ מ HEPES, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין 500 mL 1640 RPMI.
2. הכינו 10 x DC תא מלח גבוהה תרבות המדיה (400 מ מ) על ידי שוקל 1.17 גר' NaCl והצבתו לתוך צינור בז סטרילי 50 מ. להוסיף 50 מ של סטרילי DC תא תרבות המדיה (להכין בשלב 5.1) 50 מ ל בז שפופרת של מערבולת עד NaCl בתמיסה.
3. מיד לסנן גבוהה מלח DC תרבות התקשורת באמצעות ואקום סינון דרך מסנן μm 0.2 בשכונה התרבות תאים.
4. Centrifuge כל השעיה תא מ טחולים ב x 300 גר' 10 דקות ב- 4ºC. Resuspend כל גלולה תא בתקשורת תרבות DC-ריכוז של עונה 1 פרק 10⁶ תאים/מ ל....
5. פיפטה 900 μL (כ 1 x 10⁶ תאים) של ההשעיה DC בחלק תחתון שטוח 24-ובכן בז צלחת. להוסיף 100 µL של התקשורת תרבות DC מלח גבוהה מכל קידוח עבור ריכוז נתרן הסופי של 190 מילימטר. לתייג את הצלחת, מקומו 37 ° C humified CO₂ החממה במשך 48 שעות.

6. המאמצת בהעברת מלח גבוהה מטופלים CD11c⁺ DCs

1. לאחר גירוי במבחנה במשך 48 שעות, הסר הצלחת מ 37 ° C humified CO₂ מיכלים.
2. Pipette תא תרבות התקשורת למעלה ולמטה resuspend CD11c⁺ DCs-פיפטה כל CD11c⁺ DC ההשעיה לתוך מקביל הנקרא צינור 1.6 מ ל. חזור על שלב זה עבור כל אדם טוב מצופה.
3. Centrifuge בכל CD11c⁺ DC ההשעיה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר DC עם 100 µL של dPBS סטרילי.
4. . ההשעיה צייר DC לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט ½ אינץ ' 27 G
5. מקום תמים זכר 10 בת שבוע C57bl/6 העכברים מתחת לגיל 2% איזופלוריין כדי להשיג מטוס כירורגי יציב. בדוק את רמת ההרדמה עם חוסר רפלקס פדלים. ברגע מטוס כירורגי יציב מושגת, לאט ובזהירות להציג את המחט לתוך המרחב רטרו-מסלולית בזווית של 30 מעלות.
   הערה: השיקוע של המחט 27 G צריך להיות כלפי מטה, מן העין, כדי למנוע נזק עינית.
6. לאט לאט בצורה חלקה להזריק את CD11c⁺ DC ההשעיה (כ 1 x 10⁶ תאים). לאחר הזריקה תושלם, הסר בזהירות את המחט עבור שטח רטרו-מסלולית להיות בהכרה כדי לא לגרום נזק לעין.
   הערה: לאחר הזריקה צריך להיות מעט או ללא דימום. העברה המאמצת של CD11c⁺ Dc ניתן גם לבצע באמצעות שיטה עירוי של הזרקה (למשל וריד הזנב). העכברים שליטה לקבל CD11c⁺ בקרי תחום שלא היו תרבותי בתקשורת מלח רגיל.
7. להסיר את העכברים קונוס האף ונטר אותם במשך כ 30 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה.

7. הכנת יום 14 במינון נמוך אנגיוטנסין II (140 ng/ק"ג/דקה)

1. להכין מאגר אנגיוטנסין II על-ידי הוספת μL 500 של 5 M NaCl 300 μL של חומצה אצטית. Satis קוונטית (QS) עד 30 מ של יונים H₂0.
2. להמיס אנגיוטנסין II לפתרון מניות 5 מ"ג/מ"ל עם אנגיוטנסין II מאגר. אנגיוטנסין II הפתרון מניות עם המאגר הנוסף כדי להשיג ריכוז סופי כזה minipump osmotic יעביר אנגיוטנסין II בקצב של 140 ng/kg/min לפי משקל הגוף של כל עכבר מדולל.
   הערה: חיוני אנגיוטנסין II (מ ג) = (עכבר משקל (g) x 0.2 מ ג / יום x 14 ימים) / 1,000
   מוכן אנגיוטנסין II (מ ג) = (חיוני אנגיוטנסין II x 260 µL) / משאבה קצב (0.25 μL)
   אנגיוטנסין II מניות נפח (μL) = מוכן אנגיוטנסין II / מלאי ריכוז (5 מ"ג/מ"ל) x 1,000
   לדלל נפח (μL) = 270 - אנגיוטנסין II מניות נפח
3. להוסיף אנגיוטנסין II מניות נפח שתדללו (אנגיוטנסין II מאגר) מבוסס על אמצעי האחסון שחושבו בצעד 7.2.
4. ברדס תרבות תא סטרילי, פתח osmotic minipump.
5. הוספת מדולל אנגיוטנסין II פתרון ולהוציא אוויר במזרק, המחט. את המחט שסופקו לתוך החלק התחתון של minipump osmotic ולהזריק לאט אנגיוטנסין II פתרון תוך לאט ובזהירות בכדי לבטל את המחט של שלפוחית השתן.
6. הכנס את הראש osmotic minipump לתוך שלפוחית השתן osmotic באופן מלא, תשומת לב לא בשביל שיהיה להם אוויר לתוך שלפוחית השתן.

8. ההשתלה של 14 יום במינון נמוך אנגיוטנסין II Osmotic Minipumps

1. עשרה ימים לאחר העברתם המאמצת של CD11c⁺ DCs, המקום עכברים בתוך תא איזופלוריין ליזום הרדמה, ולאחר מכן להעביר עכברים האף חרוט ברציפות לקבל 2% איזופלוריין להשיג ולשמור על מטוס כירורגי המתאים.
2. הסר את הפרווה לאורך הצד הגבי של הצוואר עם קוצץ כדי להכין אתר כירורגי. לנקות את האזור מגולח עם אתנול 70% ואחריו betadine 7.5% לפני תחילת הניתוח.
3. ליצור חתך קטן (כ 1.5 ס מ) של העור. הכנס ועוצרי דימום לתוך החתך כדי ליצור כיס תת עורית עבור הצבת osmotic minipump.
4. הוסף את minipump לתוך הכיס תת עורית. קרוב לעור פצע עם תפרי ניתוח 2-3 ולהחיל יישום אחר של 7.5% betadine על הפצע, סיכות כדי למנוע זיהום.
5. לפקח על העכברים למשך 30-60 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה לפני שחזר אותם לכלובים.
   הערה: עכברים צריך להיות במעקב עד 3-4 ימים לאחר השרשת osmotic minipump.

9. בידוד של טחולים של עכברים הנמען עבור ניתוח Cytometric תזרים

1. לאחר 14 ימי במינון נמוך אנגיוטנסין II אינפוזיה, לבודד טחולים של עכברים שקיבלו במבחנה מלח גבוהה מטופלים DCs בהעברה המאמצת. בצע את השלבים מדויק המפורטים לעיל (שלבים 1 ו-2).

10. צביעת משטח

1. העברת splenocytes כי הם resuspended ב- 1 x PBS לתוך פוליסטירן FACS צינור צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 8 דקות ב 4 º C. האחות תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה. לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר MACs, צנטריפוגה (x 350 גרם, 8 דקות, 4 ° C).
   1. לחלק את splenocytes באותה מידה צינורות שונים פוליסטירן FACS מבוסס על מספר פאנלים cytometric הזרימה הרצויה.
2. כדי לבצע ההכתמה של הכדאיות תא חי/מת, לשטוף את התאים עם 1 x PBS, צנטריפוגה (x 350 גרם, 8 דקות, 4 ° C). Resuspend ב מ 1 ל 1 x PBS ולהוסיף 1 µL של התא-הכדאיות כתם (ראה טבלת חומרים). תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C (במקרר או על קרח) מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
3. במהלך הדגירה של הכתם הכדאיות תא, להכין את הקוקטייל של נוגדנים פני התא מכתים בתוך אמצעי אחסון המתאים MACS המאגר.
4. רוחצים את התאים עם 1 מ"ל MACS מאגר, צנטריפוגה (350 x g, 8 דקות, 4 ° C), את resuspend כל גלולה תא עם 100 µL של הנוגדן קוקטייל. דגירה מוגנים מפני האור למשך 30 דקות ב 4 º C.
   הערה: כל נוגדן cytometry זרימה הוא ייחודי, זה שימושי מאוד, מומלץ לקבוע את כמות אופטימלית נוגדנים הדרושים על-ידי ביצוע עיקול טיטור מנה עבור כל נוגדן ספציפי.
5. רוחצים את התאים פעמיים עם 1 מ"ל MACS המאגר את resuspend את splenocytes בסכום המתאים MACS מאגר לניתוח cytometric זרימה.

Results

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של השלבים המתוארים לעיל. טחולים מאתר מבודד מסודרים עבור CD11c⁺ Dc לתא מגנטי ומיון מצופה מדיה מלח רגיל (NS; 150 mmol NaCl) או מדיה מלח גבוהה (HS; 190 mmol NaCl) עבור ה 48 CD11c⁺ DCs הם מכן הועבר adoptively על ידי רטרו-מסלולית הזרקה לעכברים הנמען תמים. עשרה ימים מאוחר יותר, עכברים מושתלים עם osmotic minipumps במינון נמוך אנגיוטנסין II (140 ng/kg/min) אינפוזיה למשך 14 ימים. במהלך העירוי ל-14 יום של אנגיוטנסין II, לח...

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, לנו יש אופטימיזציה הליכים כדי לבודד CD11c⁺ DCs מ טחולים של עכברים, adoptively להעביר אותם לתוך תמים חיות ללמוד את התפקיד של בקרי קבוצת מחשבים במלח-induced יתר לחץ דם. פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד ולהעביר adoptively קבוצות משנה אחרים תא החיסון כולל מקרופאגים, ומונוציטים מסתגלת תאים חיסוניים כולל לימפוציטים T ו- B. לנו יש אופטימיזציה תהליך העיכול הטחול להשגת הישרדות cell נאותה ויציבות של סמני פני ביטוי DC. יתר על כן, לנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול לגירוי במבחנה של מאתר Dc עם נתרן גבוהות להישרדות...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC/Cy7 נגד עכבר CD11c	Biolegend	117324
autoMACS מאגר ריצה	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
קולגנאז D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS ללא סידן ומגנזיום	Corning	21-031-CV
FcR חוסם ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC נגד עכבר CD45	Biolegend	103108
שפופרת GentleMACS C	Miltenyi Biotec	130-096-334
מכשיר דיסוציאטור GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	פרוטוקול שימוש: טחול 04.01
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים סגולה ניתנת לתיקון	Invitrogen	L34964
LS עמודות	Miltenyi Biotec	130-042-401
מפריד QuadroMACs	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 בינוני	ג'יבקו	11835-030