בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

תקציר

עודף צריכת המלח תזונתיים תורמת דלקת ואת ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות של יתר לחץ דם. קודם לכן מצאנו כי אנטיגן תאים דנדריטים (Dc) יכול לחוש נתרן גבוהות חוץ-תאית, המוביל את ההפעלה של אוקסידאז nadph ל היווצרות של isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts. אלה IsoLG-חלבון adducts מגיבים עם עצמי-חלבונים ולקדם אוטואימונית כמו המדינה ויתר לחץ דם. יש שפותחה ואנו ממוטב המדינה-of-the-art שיטות ללמוד הפונקציה DC ביתר לחץ דם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד, ב- חוץ גופית הטיפול עם נתרן גבוהות, והעברה המאמצת של הטחול מאתר CD11c⁺ תאים לתוך עכברים הנמען ללמוד את תפקידם של יתר לחץ דם.

מבוא

עודף מלח תזונה הוא גורם סיכון עיקרי עבור יתר לחץ דם. ^{1 , 2} American Heart Association ממליץ 2,300 מיליגרם (מ ג) של צריכת נתרן (Na⁺) ליום, לכל היותר פחות מ-10% מאוכלוסיית ארה ב מתבונן המלצה זו. ^{3 , 4} צנוע הפחתות צריכת Na⁺ להוריד את לחץ הדם, לצמצם את המקרים החדשים השנתי של מחלת לב כלילית, קו בארה ב 20%. ⁵ בעיה רצינית עם עודף צריכת מלח הוא כי 50% מהאוכלוסיה עם יתר לחץ דם תערוכות מלח-רגישות, כהגדרתו העלאה של 10 מ מ כספית בלחץ הדם בעקבות Na⁺ טעינה או ירידה דומה בלחץ הדם לאחר Na⁺ ההגבלה ו di....

פרוטוקול

אוניברסיטת ואנדרבילט אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש אישרו ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו, דאגו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (Press Academies הלאומית. 2010 המתוקן).

1. בידוד של טחולים של עכברים

1. הכן 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 מ"מ HEPES, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
2. המתת חסד בשבוע 10-12-C57bl/6 בן זכר עכברים באמצעות אינהלציה₂ CO. לרסס את החזה ואת הצדדים של העכבר עם 70% אתנול. בצד שמאל, פתח היטב את העור ואת חלל הצפק לחשוף את הטחול.
3. באמצעות מלקחיים קטנים, בזהירות להזיז את המעיים והכבד לצד השמאלי של העכבר, ושימוש מספריים בסדר בעדינ....

תוצאות

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של השלבים המתוארים לעיל. טחולים מאתר מבודד מסודרים עבור CD11c⁺ Dc לתא מגנטי ומיון מצופה מדיה מלח רגיל (NS; 150 mmol NaCl) או מדיה מלח גבוהה (HS; 190 mmol NaCl) עבור ה 48 CD11c⁺ DCs הם מכן הועבר adoptively על ידי רטרו-מסלולית הזרקה לעכברים הנמען תמים. עשרה ימים מאוחר יותר, עכברים מושתלים עם osmotic minipumps במינון נמוך אנגיוטנסין II (140 ng/kg/min) אינפוזיה למשך 14 ימים. במהלך העירוי ל-14 יום של אנגיוטנסין II, לח.......

דיון

בפרוטוקול הנוכחי, לנו יש אופטימיזציה הליכים כדי לבודד CD11c⁺ DCs מ טחולים של עכברים, adoptively להעביר אותם לתוך תמים חיות ללמוד את התפקיד של בקרי קבוצת מחשבים במלח-induced יתר לחץ דם. פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד ולהעביר adoptively קבוצות משנה אחרים תא החיסון כולל מקרופאגים, ומונוציטים מסתגלת תאים חיסוניים כולל לימפוציטים T ו- B. לנו יש אופטימיזציה תהליך העיכול הטחול להשגת הישרדות cell נאותה ויציבות של סמני פני ביטוי DC. יתר על כן, לנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול לגירוי במבחנה של מאתר Dc עם נתרן גבוהות להישרדות.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
APC/Cy7 נגד עכבר CD11c	Biolegend	117324
autoMACS מאגר ריצה	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
קולגנאז D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS ללא סידן ומגנזיום	Corning	21-031-CV
FcR חוסם ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC נגד עכבר CD45	Biolegend	103108
שפופרת GentleMACS C	Miltenyi Biotec	130-096-334
מכשיר דיסוציאטור GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	פרוטוקול שימוש: טחול 04.01
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים סגולה ניתנת לתיקון	Invitrogen	L34964
LS עמודות	Miltenyi Biotec	130-042-401
מפריד QuadroMACs	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 בינוני	ג'יבקו	11835-030