הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59132

⸱

28 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Center of Infectious Disease and Signaling Research, National Cheng Kung University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ICR מוסמך (המכון לחקר הסרטן) מודל murine של זיהום מערכת העצבים המרכזית כדי להציג את ההתפתחות של נוירופתיה. ניטור ויראלי חריפה הפרעות נצאליטיות על ידי עשרות מחלה זהה יכול להתבצע על מראה דנגי וירוס המושרה נוירופתיה ב vivo.

תקציר

וירוס דנגה (DENV), וירוס המועבר על-ידי היתושים המועברים על ידי יתוש, עלול לגרום למחלה חמורה הידועה בשם קדחת דנגה מדמם, אשר מאופיין על ידי סיבוכים קטלניים עקב דליפת פלזמה, מיימת, היתוך, מצוקה נשימתית, . דימום חמור וליקוי איברים כמה מקרים של זיהום DENV להציג ביטויים נוירולוגיים; עם זאת, מחקרים לא חקרו באופן נוירופתוגנזה המושרה של DENV יותר. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להשתמש חיסוני מוסמך ICR (המכון לחקר הסרטן) העכבר לחקירת אינדוקציה של מערכת העצבים המרכזית (CN) זיהום עם DENV, ואחריו את ההתקדמות של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה כמו מחלה.

מבוא

DENV, וירוס המועברות על ידי משפחת פליורידיי , מכיל גנום ה-RNA הגיוני מקודד שלושה חלבונים מבניים נגיפי (capsid, טרום קרום, מעטפה) ו שבעה חלבונים לא מבניים ויראלי (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , ו-NS5). ארבעת סוגי הסרווים של DENV (DENV1-4), אשר להדביק כ 390,000,000 אנשים מדי שנה, לגרום נטל גלובלי אף על פי ממשלות ביים מאמצים משמעותיים לקראת וקטור יתושים ושליטה מחלות1. כיום, חיסונים להגנה ותרופות אנטי-ויראליות טיפוליות בשלבי פיתוח ודורשות אימות לטווח ארוך יותר2. בתחום הקליני, למרות חולה דנגה עם זיהום של ה-CN הוא נדיר, זה צריך להיות בחקר נוסף כדי להבין את הגיוון של פיתוח מחלת דנגה3. יש צורך בחקירה ובאימות נוספים; בעיקר, ארגון הבריאות העולמי (אשר) כלל את המעורבות של ליקוי המוח, כגון ליקוי קוגניטיבי, עוויתות, אנצפלופתיה, ודלקת קרום המוח, בסיווג חמור דנגה3,4. בניית מודלים בעלי חיים של זיהום DENV היא הכרחית לחקר נוירופתוגנזה של זיהום DENV.

ליצירת זיהום ה-CN של DENV, מספר מחקרים ביצעו מסלולים שונים של זיהום DENV, כולל (1) גרם חיסונים של C57BL/6 עכברים שקיבלו 4 x 103 פלאק-להרכיב יחידות (pfu) של DENV3 המותאם ל5, 6, (2) הצפק פנימי של עכברים balb/c שקיבלו 7 x 104 pfu של מבחנה נוירומותאמת DENV47, (3) גרם החיסון של עכברים שוויצריים שקיבלו 1 x 105 pfu של vivo neuroadapted DENV18, ו (4) גרם ו-הצפק משותפת של עכברי מוצצים ICR שהתקבלו 1 x 106 pfu של לא מותאם DENV29. על פי ממצאי מחקרים אלה5,6,7,8,9, הזיהום denv בעכברים התוצאה שכפול נגיפי במוח, המוביל נגיפי חריפה תסמונות של דלקת קרום המוח, שינויים התנהגותיים מלווים בשיתוק איברים וחוסר יציבות, מערכת העצבים העצבית והדלקת, דליפת פלזמה כללית ומקומית באמצעות מחסום הדם-מוחי (BBB) וללא השפעה. כל התוצאות ממחקרים אלה5,6,7,8,9 הראו את היכולת של denv להדביק את המוח ואת אינדוקציה של דלקת קרום המוח הנגיפי חריפה כמו מחלה לאחר הידבקות.

בהתבסס על הממצאים הנוכחיים שלנו9,10,11,12,13,14,15, יצרנו מודל murine של זיהום denv כמו ב vivo פלטפורמה כדי לבחון את היעילות הטיפולית של סוכני ממוקדות/גורמים נגד שכפול נגיפי, כמו גם רעילות נוירו. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מנוצל כדי ליצור העכבר icr מוסמך החוצה כדי ללמוד זיהום של הפונקציה וכלה לפקח על פיתוח נזקי עם הרבה הקצבאות שנגרמו על ידי denv. התוצאות מציגות את ההתקדמות המשמעותית של המחלה כמו דלקת קרום המוח בעכברים נגועים DENV באופן תלוי זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים ניסיוניים של מחקר בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי (מספר IACUC: 16-261), על פי ההנחיות שנקבעו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן.

1. הליך זיהום

  1. להכין DENV2 לא מותאם (זן PL046) מניות9 (התקבל במקור מן המרכזים לבקרת מחלות בטייוואן, החל 2.5 x 107 אל 1 x 109 pfu/mL).
  2. לדלל את המניה וירוס 1 x 106 pfu עם רוזוול פארק הזיכרון מכון (RPMI) 1640 בינוני לנפח הכולל של 40 μl.
  3. מילוי מזרק אחד 0.3 mL מצויד עם מחט של 30 גרם עם 10 μL (2.5 x 105 pfu) של וירוס מדולל, ולמלא 0.3 עוד מזרק מדגם mL מצויד במחט 30 G עם 30 μl (7.5 x 105 pfu) של וירוס מדולל.
  4. להחזיק את 7 יום בן היניקה העכבר ICR ולנהל את השלבים הבאים.
    1. עבור הזרקת גרם, להחזיק את העכבר בתנוחה נוטה על ידי לחיצה על מאורקל בין האצבע המדד והאגודל, ו תאיים להזריק 10 μL של וירוס מדולל לאזור למדא, הנקודה בהצטלבות של משונן ותפר למדוגת . שישה עשרה
    2. לאחר הזרקת גרם, להחזיק את העכבר במצב פרקדן באמצעות האצבע המדד והאגודל ו intraperitoneally להזריק 30 μl של וירוס מדולל בעדינות לתוך הabdomenl murine.
      הערה: כדי להימנע מקניבליזם, 75% אלכוהול משמש ליצירת אובדן זמני של תחושת הריח של האם. בנוסף, הציע לכסות את הציפוי בצואה ובשתן של אימם.
  5. הניחו את עכברי היניקה בחזרה בכלובים שלהם והמתינו 5 דקות כדי לבדוק את בטיחות הגירוי שלהם עם האוויקות של עכברים, כולל הליכה וחלב אם יניקה.
    הערה: לרוב, עכברים להפגין הגירוי הרגיל של פעילות הפוסט, אין נראה כל השפעות מזיקות בעקבות האתגר הטכני. במהלך ניסוי זה, החיות היו מתוחזקים על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי, טייוואן.
  6. להעריך את ההתקדמות היומית של העכברים במונחים של משקל הגוף (באמצעות איזון יקרוגרם), מחלה נגיפית חריפה של דלקת קרום המוח (על ידי מחלה הבקיע כפי שמתואר בסעיף 2), ושיעור ההישרדות9,10,11 ,12,13,14,15.

2. ניקוד מחלות

  1. לעקוב אחר כיתה של דלקת קרום המוח הנגיפית חריפה כמו. הקצאת ניקוד של 0 לעכברים בריאים; 1 לעכברים עם תסמיני מחלה קלה, כולל ירידה במשקל, ניידות מופחתת וכיוון גוף הגיבן; 2 לעכברים המוצגים התקף ללימבי; 3 לעכברים את החולשה הלימבית התערוכה, כולל נע עם קושי האיבר הקדמי או חולשה האיבר האחורי; 4 לשיתוק; . חמש למוות
    הערה: לאחר הניקוד מגיע 3, תסמיני המחלה נחשבים להתפתח במהירות.
  2. להתוות את הניקוד של המחלה, על פי שלב 2.1, עבור כל יום כדמות עקומה מבוססת באמצעות ממוצע ± SD של תוצאות המבחן היומי בכל קבוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חמור קדחת דנגה הקשורים סיבוכים נוירולוגיים דווחו בחולים עבור פתוגנזה דנגה4. למרות המקרים האלה הם נדירים במרפאה, יצירת מודל מורלא מוסמך של זיהום DENV ניתן להשתמש לא רק לימוד immunopathogenesis אלא גם לחקירת זיהום של הפונקציה, נוירודלקת, נוירורעילות, ו ויראלי חריפה מחלה כמו דלקת קרום המוח. במחקר זה, על פי המודל הנוכחי שלנו9,10,11,12,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הזיהום denv זוהה ב-cn של מטופלים חמורים דנגה3,17, מציע את האפשרות של ביטוי של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה התרחשה במהלך פתוגנזה דנגה. כאן, אנו מדווחים על מודל vivo murine של זיהום DENV לחקר מעורבות של התפקוד העצמי של ה-CN דנגה, במיוחד עם דגש על DENV המושרה דלקת קרום המוח ויראלי כמו מחלות. לעומת הדגמים הקודמים, במיוחד עבור זיהום אחד במסלול (לעירוי בלבד, תוך הצפק בלבד, או גרם בלבד), סיכוייו גבוה מאוד (1 x 108 pfu) של denv מנוצל עכברים המוסמכת. עם זאת, ב עכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST107-2321-B-038-001) ואת מימון הפנים הפנימי 106TMU-CIT-01-2, טאיפיי, טייוואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכון הזיכרון רוזוול פארק 1640 בינוני (RPMI)Gibco11875-085וירוס מדלל
0.3 מ"ל מזרק אינסולין BD Ultra-Fine­II328838הזרקה תוך מוחית ותוך צפקית
MicrobalanceMETTLER TOLEDO's LabXAL104עכבר משקל
DENV2 לא מותאם (זן PL046)המרכזים לבקרת מחלות של טייוואן-עכברמדביק
המכון לחקר הסרטן (ICR) עכבר יונקBioLASCO טייוואן ושות', בע"מ-מודל העכברים שלנו

מקורות

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055(2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23(2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670(2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000(2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910(2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715(2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91(2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240(2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דלקת מוחה של נגיף הדנגימודל עכברים בעלי מערכת חיסון תקינההזרקה תוך-מוחיתהזרקה תוך-פעריתדירוג התקדמות המחלהמדידת משקל גוףהערכת תנוחת גב כפוףניטור פרכוסים לימבייםצביעת המטוקסילין-אוזיןבדיקת יצירת פלאקים
מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.