ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

Summary

אנו מציעים פרוטוקול מתוקננים כדי לאפיין את ההרכב הסלולר של נגעים טרשת עורקים מאתר בשלב מאוחר, כולל שיטות שיטתית של דיסקציה בעלי חיים, רקמות הטבעה, חלוקתה, מכתים, וניתוח של העורקים brachiocephalic מ atheroprone שריר חלק תא שושלת היוחסין עקיבה עכברים.

Abstract

טרשת עורקים נשאר הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, ו, למרות אינספור מחקרים פרה המתאר מטרות טיפולית מבטיחה, התערבויות הרומן נשארו חמקמק. זה כנראה נובע, בין השאר, ההסתמכות על מודלים למניעת פרה חוקרת את ההשפעות של שינויים גנטיים או טיפולי תרופתי על התפתחות טרשת עורקים ולא המחלה הוקמה. בנוסף, תוצאות של מחקרים אלה הן לעתים קרובות מבלבלים עקב השימוש של ניתוחים הנגע שטחית וחוסר אפיון אוכלוסיות תאים הנגע. כדי לסייע להתגבר על מכשולים translational אלה, אנו מציעים של הסתמכות מוגברת על מודלים של התערבות שמעסיקים חקירה של שינויים בהרכב הסלולר ברמה תא בודד על ידי צביעת immunofluorescent קונפוקלית. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקה סוכן טיפולית בשם מודל התערבות מאתר כולל בגישה שיטתית לנתיחה בעלי חיים, הטבעה, חלוקתה, מכתים של כימות של העורק brachiocephalic נגעים. בנוסף, בשל המגוון פנוטיפי של תאים בתוך התרדמה בשלב מאוחר, נתאר את החשיבות של שימוש שושלת היוחסין הספציפי תא, inducible עקיבה העכבר מערכות, כיצד זה ניתן למנף מוטים פלואורסנציה אוכלוסיות תאים הנגע טרשת עורקים. יחד, אסטרטגיות אלו עשוי לסייע ביולוגים וסקולרית דגם התערבויות טיפוליות ולנתח באופן מדויק יותר מחלות טרשת עורקים, בתקווה יתרגם לתוך שיעור גבוה יותר של הצלחה בניסויים קליניים.

Introduction

טרשת עורקים הוא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם הבסיסית הרוב המכריע של מחלת עורקים כללית, מחלות עורקים היקפיים, שבץ מוחי. טרשת עורקים כלילית בשלב מאוחר יכול לגרום סיבוכים חמורים, כולל חשבונאות אוטם שריר הלב כמעט 16% של העולם אוכלוסייה התמותה^1,2. בשל ההשפעה ההרסנית שלו על בריאות הציבור, הפך מאמץ ניכר כדי לפענח את מנגנוני נהיגה התקדמות טרשת עורקים, וכן גם לפתח אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. ובכל זאת, שיעור הסבירות של האישור (LOA) של ניסויים קליניים למחלות לב וכלי דם הוא בין הנמוכים ביותר בהשוואה לשדות קליניים אחרים (רק 8.7% עבור שלב I)³. זו יכולה להיות מוסברת בחלקה על ידי מחסומים רבים טרשת עורקים הזה מהווה לפיתוח תרופה יעילה כולל את הטבע כמעט בכל מקום, התקדמות קלינית-שקט, והטרוגניות מחלה משמעותית. יתר על כן, העיצוב שיוצרת של מחקרים שנעשו בבעלי חיים פרה יכולה גם להיות אחראים חוסר הצלחה בתרגום רפואי. באופן ספציפי, אנו מאמינים שיש צורך ליישם את מחקרי התערבות במידת האפשר לחקור את היעילות של אסטרטגיות טיפוליות. בנוסף, יש צורך קריטי כדי לבצע הליכים סטנדרטיים עבור ניתוחים הנגע כולל אפיון מתקדמים של הרכב הסלולר הנגע טרשת עורקים בשלב מאוחר על ידי מיפוי גורל ו phenotyping.

הרוב המכריע של טרשת עורקים מחקרים להתמקד מודלים למניעת טרשת עורקים המורכב סמים טיפול או ג'ין מניפולציה (הסתרה או טוק-) בעכברים צעירים בריאים, לפני המחלה החניכה, התקדמות. מחקרים אלה חשפו מספר רב של גנים, מולקולות איתות כי תפקיד בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, רוב היעדים הללו נכשלה לתרגם טיפולים יעילים-אנוש. אכן, קשה להסיק את האפקט שהתרפיה על עכברים צעירים בריאים לחולים קשישים עם מתקדם התרדמה. ככזה, ביצוע מחקרי התערבות בצבר ניסיוני פרה סביר מספק תיאור מדויק יותר של רלוונטיות ואת היעילות של חדש טיפולית. הרעיון נתמך על ידי ההשפעות השונות של עיכוב של ציטוקינים פרו-דלקתיים אינטרלוקין-1β (IL-1β) בעת העסקת מניעת^4,5,6 או התערבות האסטרטגיה⁷. ההבדלים בין מניעת התערבות מחקרים מראים כי תהליכים תאיים שונים מתרחשים שלבים שונים של התפתחות טרשת עורקים, מדגיש את העובדה כי מחקרים מניעה צפויים מספיקות לדגמן את התרחיש קליני במידה מספקת.

איגוד הלב האמריקני פרסם לאחרונה הצהרה מדעי המפרט המלצות עבור עיצוב ניסיוני נכונה, סטנדרטיזציה פרוצדורלי, ניתוח ודיווח של מחקרים בבעלי חיים טרשת עורקים⁸. זה מדגיש את יתרונותיה וחסרונותיה של השולט טכניקות בשימוש בתחום. לדוגמה, פנים en סודאן הרביעי מכתים של אבי העורקים מבוצע לעתים קרובות כמו read-out הראשון. למרות פנים en סודאן הרביעי מכתים של השומנים התצהיר היא שיטה מתאימה להערכת מהנטל פלאק גלובלי, הוא לא מסוגל להבחין נגעים פס שומני בשלב מוקדם של נגעים בשלב מאוחר יותר מתקדמים. ככזה, הפרשנות של צביעת פנים en לעתים קרובות מעורפלות ולא שטחית⁹. ניתוח זהיר של רקמות חתכי רוחב באמצעות גודל הספינה, הנגע ו לומן פרמטרים מורפולוגיות כימות מדדים של הנגע יציבות מספקת הבנה מדויקת יותר של התוצאה של ניסוי.

לבסוף, histopathology האנושי שמחקרים הראו כי הרכב הסלולר הוא מנבא טוב יותר של קרע יותר מגודל הנגע עצמו, עם נגעים המסכן בתאי השריר החלק (SMC) ועשיר מקרופאגים להיות רגישים יותר להיקרע^{10, 11}. תצפיות אלה התבססו על צביעת עבור סמני בסגנון קלאסי המשמש לזיהוי התא (קרי, ACTA2 SMC, LGALS3 או CD68 עבור מקרופאגים). עם זאת, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת אך ורק לסוג תא בודד בנגעים טרשת עורקים עקב הפלסטיות של שושלות מרובים כולל SMC, תאי אנדותל, התאים מיאלואידית¹². בפרט, זיהוי ברורה וחד משמעית SMC בתוך הנגע טרשת עורקים היה כמעט בלתי אפשרי עד העשור בגלל המאפיין של תאים אלה כדי dedifferentiate וידכא את הגנים שלהם סמן שושלת היוחסין הספציפי (תהליך המכונה בשם מיתוג פנוטיפי) כלי פצוע או חולה¹³. מגבלה זו בזיהוי SMC יש כבר עקפו על ידי הפיתוח של שושלת היוחסין עקיבה^{7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. הוא מורכב לצמיתות labelling הצאצאים שלהם וסנו לאתר שלהם הגורל וההתפתחות פנוטיפי במהלך התקדמות טרשת עורקים על ידי שימוש בשילוב של הביטוי של recombinase Cre מונע על ידי היזמים SMC ספציפיים (קרי, Myh11^{7,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24},^25, Acta2²⁶ ו, SM22α^14,16) והפעלה של כתבים (למשל, חלבונים פלורסנט, β-galactosidase) [הנסקרת ב Bentzon ו Majesky 2018²⁷]. אחד המחקרים הראשונים העסקת SMC עקיבה שושלת היוחסין מחוץ להגדרה מופרה, שפר ואח¹⁴ סיפק ראיות כי SMC יכול לווסת שלהם פנוטיפ, transdifferentiate לתוך תאים chondrogenic במהלך הסתיידות כלי הדם באמצעות SM22α Cre R26R LacZ שושלת היוחסין עקיבה מודל. למרות מחקרים אלה חלוץ SMC שושלת היוחסין עקיבה, הם היו חלקית משמעיות כי כל נתון שאינו-SMC SM22α לביטוי בסביבה של המחלה תווית על ידי הכתב. מגבלה זו הספינה נעקף על ידי פיתוח ושימוש של טמוקסיפן-inducible Cre ERT/LoxP המתיר פקד הטמפורלי של תיוג תא תא תיוג מתרחשת באופן בלעדי במהלך הלידה טמוקסיפן, יוגבלו לתא לבטא את התא ייחודיים לסוג יזם נהיגה Cre ERT ביטוי בזמנו של חשיפה טמוקסיפן, הימנעות העקיבה של סוגי תאים חלופי הפעלת Cre ב הגדרה של התקדמות המחלה. לצורך מעקב אחר שושלת היוחסין של SMC ב טרשת עורקים, טמוקסיפן-inducible Myh11- Cre/ERT2 transgene הקשורים עם כתבים פלורסנט (eYFP^{7,15,17,18 , 21}, mTmG^19,25, קונפטי^20,22,23 ללימודי משובט הרחבה) הוכיחה יעילות יוצאת דופן וספציפיות של SMC תיוג ויש לו היו בשימוש לאוכלוסיות SMC מפת גורל בנגעים טרשת עורקים במחקרים אחרונים. חשוב מכך, מחקרים אלה חשפו: 1) 80% SMC בהישג מתקדמת טרשת עורקים לעשות לא לבטא כל קונבנציונאלי SMC סמנים (ACTA2, MYH11) המשמש בניתוח immunohistological, ולכן צריך כבר טעינו בזיהוי ללא מעקב אחר שושלת היוחסין ¹⁷; 2) קבוצות משנה של SMC אקספרס סמנים של סוגי תאים חלופי כולל סמני מקרופאג או תאי הגזע mesenchymal סמני^16,17,19; ו 3) SMC להשקיע ואכלוס הנגע טרשת עורקים על ידי התרחבות oligoclonal ולשמר SMC שיבוטים פלסטיות למעבר אוכלוסיות שונות phenotypically^20,23. לסיכום, ברור כעת כי תאי שריר חלק להציג מגוון פנוטיפי מדהים טרשת עורקים, יכולה להיות מועילה או מזיקה תפקידים על הנגע פתוגנזה בהתאם לאופי מעברים פנוטיפי שלהם. תגליות אלה מייצגים שדרה מדהים טיפולית חדשה עבור מיקוד SMC קידום athero פנוטיפי מעברים בין טרשת עורקים בשלב מאוחר.

במסמך זה, אנו מציעים פרוטוקול סטנדרטיים לניתוח בשלב מאוחר מאתר התרדמה כולל שיטות שיטתית לנתיחה בעלי חיים, הטבעה, חלוקתה, מכתים של כימות של העורק brachiocephalic נגעים. כדי לקבוע את ההשפעה של אינטרלוקין-1β עיכוב על גורל SMC, פנוטיפ, השתמשנו השושלת SMC עקיבה ספקיות^{- / -} עכברים שקיבלו תזונה מערבית 18 שבועות לפני קבלת זריקות שבועיות של נוגדן anti-IL1β או שליטה IgG מתאימים isotype.

Protocol

גידול בעלי חיים, טיפול ופרוצדורות אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה, טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פיטסבורג ועל שימוש הוועדה.

1. דור של SMC שושלת היוחסין עקיבה עכברים

1. גזע Myh11זכרים - Cre/ERT2²⁸ (מעבדה ג'קסון; #019079) עם הנקבות R26R-EYFP (מעבדה ג'קסון; #006148) כדי לקבל Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} זכרים.
2. גזע Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} זכרים עם ספקיות^{- / -} עכברים הנשי (מעבדה ג'קסון; #002052). הצלב הוא צאצא ובחר מאת genotyping Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} ספקיות^{- / -} זכר, R26R-EYFP^{+ / +} ספקיות^{- / -} עכברים נקבה כמו מגדלים הסופי. לקצוץ זנבות ולבצע genotyping על הארנבונים מאותה. כל העכברים זכר צריך להיות Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} ספקיות^{- / -} יכול לשמש ניסויי עכברים (איור 1א').
   הערה: פרוטוקולים Genotyping ניתן למצוא באתר האינטרנט של ג'קסון מעבדה. Transgene Cre/ERT2 Myh11 ממוקם על כרומוזום ה-Y, מסלק את השימוש נקבות. מערכות עקיבה אחר שושלת היוחסין יכול לשמש, אך מערכת זו עד היום את האסטרטגיה עקיבה השושלת הכי אמין למפת גורל SMC ב טרשת עורקים.

2. שריר חלק תא שושלת היוחסין-מעקב העכבר תזונה וטיפולים

1. יש Myh11זכר - Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ +} עכברים^{- / -} ספקיות מקבלים סדרה של זריקות טמוקסיפן 1 מ ג 6-8 שבועות של גיל לתייג באופן קבוע Myh11⁺ SMC עם YFP וכדי לעקוב אחר גורלם (איור 1 A).
   1. חום שמן בוטנים-55 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף טמוקסיפן בשמן בוטנים מחומם מראש כדי להכין פתרון-10 מ"ג/מ"ל, דגירה ב 55 ° C עד התפרקות מוחלטת של טמוקסיפן.
   3. לבצע זריקה בקרום הבטן עם 0.1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל טמוקסיפן פתרון עבור סדרה של זריקות עשר יותר משבועיים.
      הערה: טמוקסיפן חומרים מסוכנים, יש לטפל בזהירות.
2. 5-7 ימים אחרי הזריקה האחרונה עם טמוקסיפן, להחליף צ'או דיאטה עם תזונה עתירת שומן (למשל, הדיאטה המערבית; קק ל-42% שומן; 0.2% הכולסטרול) עבור משך זמן של 18 שבועות כדי לאפשר התפתחות נגעים טרשת עורקים מתקדמת, אשר מפתחת באופן עקבי במיטות כלי דם מרובים כולל את קשת אבי העורקים, שורש אבי העורקים, העורק brachiocephalic, העורק הראשי.
3. אחרי 18 שבועות של דיאטה עתירת שומן האכלה, להתחיל התערבות טיפולית למשך הרצוי (איור 1B).
   הערה: לדוגמה, ביצענו שבועי בקרום הבטן זריקות עם נוגדן anti-IL1β או פקד IgG isotype-התאמה בין 18 ל 26 שבועות של עשיר בשומן.
4. הסר מזון מהיר לעכברים 8 עד 16 שעןת לפני הרקמה קציר לבצע קריאות מדויקות עבור פלזמה כולסטרול, טריגליצרידים.

3. קציר של העורק Brachiocephalic (BCA)

1. המתת חסד בבעלי חיים פעל על פי תקנות ודרישות חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC). המתת חסד העכברים ניסיוני בעזרת₂ CO שנהנתם 5 דקות ולוודא מוות על ידי צביטה הבוהן.
2. שוקל את העכבר, לאסוף את הדם.
   1. שוקל את העכבר
   2. תרסיס הצד הבטני של העכבר עם 70% אתנול
   3. לבצע ניקוב הלב על ידי החדרת מחט 25 גרם מחובר מזרק 1 מ"ל בחלל מהצד השמאלי של חלל החזה. ניתן לאסוף 0.1 עד 1 מ"ל של דם.
   4. להעביר את הדם שפופרת ריק EDTA על ידי שטיפה המזרק ולמקם את הצינורית על הנדנדה או מסובב למשך 10-15 דקות.
   5. העברת דם צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות 250 x g ב- 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לסגת השלב העליון פלזמה בעזרת פיפטה והעצות נאותה, להעביר צינור חדש. לאחסן ב-20 ° C לפני למדידת כולסטרול וטריגליצרידים.
      הערה: דם יכול לשמש עבור מחקרים נוספים כולל תא ספירת דם ורכיבים אחרים-דם כולל ציטוקינים או פרופיל תא החיסון.
3. לעשות חתך של שנהנתם 2 ס מ בעור הבטן התיכונה באמצעות מספריים ומשוך את העור כדי לחשוף את חלל הבטן. חותכים את הצפק עד לעצם החזה מבלי לגרום לו נזק לרקמות. לעשות שני חתכים על קו אמצע בבית השחי דרך בית החזה, נזהר שלא יגרמו נזק ללב ולריאות.
4. הרם את החזה עם פינצטה וחותכים את הסרעפת לחשוף באופן חלקי את הלב. אם הלב אינו נגיש בקלות, לחתוך משם צלעות מספיק כדי להגיע אטריום ימין.
5. Perfuse את העכבר עם מערכת זלוף הכבידה (איור 2א). התקנת מערכת זלוף המשיכה כך הלחץ של הנוזל זלוף שווה ל לחץ דם מאתר הממוצע (איור 2B). מערכת זו מאפשרת עקביות זלוף ושומר שני כלי השיט ריקונים ומורפולוגיה כדוריות דם אדומות.
   הערה: התייחסות, עכברים C57Bl6 יש לחץ דם הפיזיולוגיות בין 120 מ מ כספית (לחץ דם סיסטולי ממוצע) ו- 70 מ מ כספית (לחץ דם דיאסטולי ממוצע)^29,30. לחץ דם סיסטולי, דיאסטולי ממוצע יכול להשתנות עם רקע גנטי העכבר.
   1. לחבר של 23 או 25 גרם פרפר המחט למערכת זלוף הכבידה ולהפעיל מלוחים באגירה פוספט (PBS) דרך המחט לגרש את האוויר מן הצינורות. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ולאבטח את המחט במקום. באמצעות מספריים איריס, עושים חתך קטן (< 2 מ מ) לתוך אטריום ימין או העורקים.
   2. . Perfuse עם 5 מ"ל ל- PBS, ואז 10 מ"ל של פתרון Paraformaldehyde (PFA) 4%, אז 5 מ של PBS להשתמש בפתרון PFA PBS והן 4% בטמפרטורת החדר.
   3. לאסוף את הרקמות של עניין (למשל, כבד, ריאות, טחול) ולמקם אותם בפתרון PFA 4%.
6. לחשוף את BCA
   1. לנקות את אזור הצוואר על ידי הסרת את העור ואת בלוטות הרוק.
   2. לבצע ביתור אחד למטה האמצע של עצם החזה דרך מדויקים באמצעות מספריים. תיזהר המספריים. תישארי קרובה האחורי של עצם החזה כדי למנוע נזק להערכת שממוקם מתחת לעצם החזה. משוך בשני הצדדים של קשת הצלעות עם מלקחיים לחלוטין לפתוח את החזה. לעורק הראש צריך להיות גלוי באופן חלקי.
   3. לנקות על ידי משיכת השרירים ורקמות הסרת שומן עם פינצטה בסדר עד בעורק נכון, העורק brachiocephalic ההסתעפות subclavian את קשת אבי העורקים הם ניקו ו מבודדת של סביב רקמת חיבור ושומן (איור 2C).
7. הסר את BCA
   1. באמצעות מלקחיים, לתפוס בעורק נכון מתחת שלו נגע הסתעפות ולהפוך את החלק הראשוני של מעל המלקחיים (איור 2D).
   2. מחזיק בעורק, לבצע חתך השני דרך העורק בריחי. הסופי שני החתכים דרך הקשת אבי העורקים, משני צדי העורק brachiocephalic (איור 2D).
   3. לאסוף את רקמות אחרות וסקולריים עניין (למשל, העורק הראשי, חלק עליון של הלב המכיל את בסיס אב העורקים).
   4. המקום BCA ורקמות אחרות בפתרון PFA 4% למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הזמן קיבוע יש לשמור עקבי לאורך כל תקופת המחקר.

4. ברקמה ואת חלוקתה

1. להסיר את הרקמה של 4% מחברים, המקום קלטת תוויות רקמות (איור 3א). שימוש קצף דפדפות בקלטת כדי להבטיח את הרקמה שומרים על כיוון שלה, נשאר במגרה לעבור שלב העיבוד (איור 3ב). סגור את הקלטות ולאחר לטבול אתנול 70% עד רקמות עיבוד (24 עד 72 שעות).
   1. תהליך BCA ורקמות אחרות שנאספו היסטולוגית ו immunofluorescent מכתים כדלקמן (דוגמה שגרתית לילה באמצעות מעבד עם חדירה ואקום): 10% נייטרלי buffered פורמלין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (2x), 75% אתנול עבור 60 דקות ב 30 ° C (1 x), 90% אתנול עבור 60 דקות ב 30 ° C (1 x), 95% אתנול עבור 60 דקות ב 30 ° C (1 x), 100% אתנול עבור 60 דקות ב 30 ° C (3 x), קסילן עבור 60 דקות ב 30 ° C (3 x), פרפין במשך 80 דקות ב 62 ° C (3 x).
2. להטביע BCA אנכית, עם קשת אבי העורקים קרוב לפנים בלוק (איור 3ג').
3. חותכים דרך הרחוב פרפין על מיקרוטום סיבוביים (עובי 10 מיקרומטר) עד שהגיע הרקמה מוטבעים.
4. לאחר הרקמה הוא גלוי, נבחן מקטע תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע עמדה. אם מבחינה עדיין גלוי, להסיר עד 10 10 מיקרומטר מקטעים בכל פעם, בחינת מקטע בכל פרק זמן.
5. בזמן קשת אבי העורקים יש כבר למחלקה דרך העורק brachiocephalic גלוי, לשנות את הכיוון של הרחוב כדי למקם את הרקמה לחלוטין בניצב הלהב מיקרוטום.
6. חותכים את BCA-סעיף עובי של 10 מיקרומטר. בנקודה זו, כל המקטעים נאספים באופן סדרתי עם שלושה מקטעים לכל שקופית. לאסוף עד שהגיע ההסתעפות subclavian (איור 3ד').
   הערה: חשוב לחתוך את BCA-סעיף עובי של 10 מיקרומטר עבור ייבוא תמונות קונאפוקלית z עוקבות-מחסנית וספירת תא בודד. עובי זה יאפשר את ההערכה קפדני, הלא-cofounding של האגודה בין גרעין יחיד, cytoplasmic או קרום מכתים בכל העומק של חתך הרוחב.

5. immunofluorescent מכתים

הערה: אפיון מלא של טרשת עורקים כולל הערכה מורפולוגית פרמטרים של מדדי פלאק יציבות או אי יציבות והרכב הסלולר זה לא תהיה המוקד של הפרוטוקול הנוכחי. הנגע מורפולוגיה, קולגן תוכן, דימום intraplaque ניתן לנתח באמצעות^7,Movat¹⁷, ^7,PicroSirius אדום³¹, Ter119 מכתימים ^7,18, בהתאמה. כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח ההרכב הסלולר של נגעים.

1. דגירה השקופיות הפתרונות הבאים בטמפרטורת החדר ברדס כימי: קסילן במשך 5 דקות (2x), 100% אתנול במשך 5 דקות (2x), 95% אתנול במשך 5 דקות (2x), 70% אתנול עבור 5 דקות (2x), ו- H2O יונים (לשכפל₂O) במשך 5 דקות (2x).
2. דגירה שקופיות בפתרון אחזור אנטיגן על פי הוראות היצרן.
   1. עם חומצה ציטרית המבוסס על פתרון גם ההומניסטית והאוטונומית אנטיגן (ראה טבלה של חומרים), לדלל 3 מ"ל של פתרון ב- mL 320 לשכפל₂O. המקום בשקופיות מאגר מים ומילוי צביעת הדף עם הפתרון אחזור אנטיגן מוכן.
   2. ממלאים כל משבצות ריקות בארון שקופיות שקופיות ריק כדי להבטיח אפילו חימום. מכסים את המיכל עם מכסה כדי לאפשר את הפתרון אחזור אנטיגן לרתיחה ללא אידוי.
   3. מחממים את השקופיות במיקרוגל במשך 20 דקות בכ-675-700 וואט. בדוק השקופיות באופן קבוע ואת החלף התאדו נוזל עם לשכפל₂O כזו סעיפים נותרו שקועים פתרון גם ההומניסטית והאוטונומית בכל עת.
   4. לאפשר שקופיות להתקרר בפתרון לשעה בטמפרטורת החדר.
3. להמיס 6 גר' ג'לטין עור הדג (FSG) ב 1 ליטר ל- PBS. PBS/FSG משמש שטיפה מאגר. להכין פתרון חסימה של סרום נורמלי 10% ב- PBS/FSG.
   הערה: ג'לטין דגים העור משמש את הכנת המאגר חסימה. FSG אינו מכיל חלבונים סרום יכול cross-react עם נוגדנים יונקים, צמצום רעש רקע. עם זאת, אפשרות חסימת אחרת צריך להיות מועדף עם מערכות זיהוי ביוטין FSG מכיל ביוטין אנדוגני. הסוג של סרום הרגיל המשמש מבוסס על הנוגדן משני בשימוש. כאשר החמור נוגדנים משניים משמשים, כדאי לבחור סוס רגיל סרום דילולים חסימה ו נוגדן.
4. דגירה שקופיות ב- PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעגל מקטעי רקמת עם עט הידרופובי. מכסים את הסעיפים עם המאגר חסימה PBS/FSG/רגיל סרום לשעה בטמפרטורת החדר. הכינו את הפתרון העיקרי נוגדן בנסיוב PBS/FSG/רגיל במהלך שלב זה ואילו הרקמות חוסמים.
5. דגירה עם נוגדנים העיקרי מדולל ב- PBS/FSG/רגיל סרום לילה ב 4 ° C בתוך תא לחות. צריך להיות מודגרות מקטע אחד לכל שקופית עם שילוב של נוגדנים IgG שליטה על ריכוז זהה כמו נוגדנים ראשי לפקד עבור נוגדן ראשוני ירידה לפרטים.
6. לשטוף את השקופיות כדלקמן בטמפרטורת החדר: PBS/FSG למשך 5 דקות (3 x), ואז PBS במשך 5 דקות (1 x).
7. תקופת דגירה עם נוגדנים משניים מצומדת fluorophore (ראה טבלה של חומרים), diamidino-2-phenylindole (דאפי) של גרעין counterstaining מדולל בנסיוב PBS/FSG/רגיל לשעה בטמפרטורת החדר. להגן על שקופיות אור.
8. לשטוף את השקופיות כפי שמתואר בשלב 5.6.
9. הר שקופיות באמצעות הרכבה מדיה מתאים קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים).

6. מיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ורכישה z-מחסנית הוא קריטי עבור ספירה תא בודד.

1. הגדרת פרמטרים רכישה כדי לשמש לאורך כל תקופת המחקר: תמונה ברזולוציה (1024 x 1024 או 2048 x 2048 פיקסלים); אופטי ומספר הערוצים, אשר הם פונקציה של השילוב של נוגדנים משניים נבחרת; סריקה מהירות (מומלץ סריקה מהירות: 7-8); וערוץ התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC).
2. באמצעות סעיפים מוכתמים נוגדנים העיקרי ושליטה IgG, להגדיר את גלאי רגישות, עוצמת הלייזר ולאחר קיזוז לכל ערוץ בודדים. הפקד IgG משמש כדי למזער את האות רקע.
3. להגדיר את המיקומים העליונים והתחתונים עבור רכישת z-מחסנית. Predetermine את עובי ואת מספר המחסניות לרכוש. פרמטרים אלה צריכים להישאר עקבי לאורך כל תקופת המחקר.
   הערה: אנו ממליצים על 8-10 הדמיה, ערימות עובי 1 מיקרומטר. להישאר עקבי מספר המחסניות עם תמונה לאורך כל תקופת המחקר.
4. מקטעי רקמת תמונה צבעונית עם ראשי נוגדנים IgG שליטה בכל הערוצים כולל DIC.
5. תווית תמונה אחת לפחות עם בר בקנה מידה לכיול התמונה במהלך ספירת תא בודד.

7. ותא לספור

1. התקנת ופתח ImageJ. במידת הצורך, להוריד תוספים בסעיף להוריד > קלט/פלט של ImageJ אתר אינטרנט כדי לפתוח את קובץ התמונה שנוצר תלוי של הפורמט של תמונות שנוצרו על-ידי מיקרוסקופ קונפוקלי.
2. פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ.
3. כיילו את התמונה עם קנה מידה הפניה בר באמצעות הדימוי שנוצר ב- 6.6.
4. ניסחו את האזור עניין שבו סופר תא בודד, יבוצעו באמצעות הערוץ DIC (איור 4).
   הערה: באפשרותך מאפשרת אזור אחד בכל פעם. בהתאם מהשאלות ניסיוני, תא בודד סופר יכול להתבצע באזור הנגע כולה (ראה 7.3.1) ו/או מיקום של משנה של הנגע. לדוגמה, חקירה של האזור כיפה סיבית (ראה 7.3.2) היא רלוונטית במיוחד מאז את הקומפוזיציה הסלולר שלה הוא מדד חשוב של הנגע הנטייה להיקרע.
   1. ניסחו באזור הנגע על-ידי ביצוע הגבול לומן (איור 4א; החצים הלבנים) לבין פנימי אלסטי הנדן (איור 4א; חיצים צהובים) גלוי על התמונה DIC.
   2. לצורך ניתוח של האזור כיפה סיבית, לקבוע את הגבול הרחוק של 30 מיקרומטר של לומן ולאתר את הגבול ( איור 4B-D).
      הערה: האזור כיפה סיבית בסגנון קלאסי מוגדר כאזור מועשר ACTA2 + תאים, קולגן underlaying לומן (איור 4B). העשרת ACTA2 + תא, הקולגן ממלא תפקיד קריטי ביציבות הנגע. מחקרים קודמים קבעו כי ACTA2 + תא כיפה סיבית עשיר האזור ממוצעים עובי של 30 מיקרומטר של לומן ב- SMC-השושלת עקיבה ספקיות^{- / -} עכברים האכיל דיאטה עתירת שומן 18 עד 26 שבועות (איור 4C). לפיכך, אפיון מדוקדק של ההשפעות של מניפולציה גנטית או טיפול תרופתי על הרכבו הסלולר של אזור כיפה סיבית רלוונטי להפליא.
5. פתח את החלונית ' כלים ערוצי ' (תמונה > צבע > ערוץ כלים) ואת הדמה צבע השונה מכתים ערוצים (איור 5A; box 1).
6. למזג ערוצי הצבע (תמונה > צבעים > צבעים למזג) (איור 5A; תיבת 2). כל הערוצים צריך להיות גלוי על התמונה (איור 5B). להפעיל ולכבות ערוצי צבע בודדים באמצעות החלונית ' כלים ערוץ ' (איור 5A; box 1).
7. להגדיר את הכלי ספירה.
   1. לחץ לחיצה ימנית על הסמל ספירת בסרגל כלי (איור 5C; תיבה 1) ובחר הכלי נקודת מרובה.
   2. לחץ פעמיים על סמל זהה כדי לפתוח את החלונית ' הכלי נקודת ' (איור 5C; תיבת 2).
   3. בחר את סוג וגודל של הפריטים המשמשים לספור תאים.
   4. בדוק הצג הכל.
8. להפעיל בערוץ דאפי רק בחלונית הכלים ערוץ ולבחור את הערוץ מונה 0 (איור 5C; תיבת 3). לחץ על גרעינים בודדים אשר יהיו מתויגות (למשל, צהוב נקודות באיור 5C-D). גלול z-במחסן כדי לספור את כל הגרעינים צבעונית באזור של ריבית. מספר האירועים מסומן מתחת בערוץ מונה בחלונית הכלי נקודת (איור 5C; תיבת 4).
9. . תדליקי ערוץ מכתימים אחר (למשל, eYFP מכתים). בחרו מונה בערוץ 1. לחץ על תאים בהם יש colocalization בין דאפי לבין מכתים. עבור צביעת cytoplasmic, בחירת תאים עם צביעת המקיף את הגרעין של עומק כולו של הגרעין (יש לבדוק מספר z-במחסן).
10. חזור על-ידי שינוי מכתים שילובים ובחירת ערוצים חדשים מונה לספירת האוכלוסיות תא עניין. כל צבע נקודה מייצגת אוכלוסיה תאים שונים (איור 5D). תוצאות ניתן לבטא מספר תאים המספר הכולל של דאפי או מספר תאים אזור לאזור.

Results

Myh11- Cre/ERT2 R26R-עכברים^{- / -} EYFP ספקיות הוזרקו טמוקסיפן בין גיל לפני שמאכילים בשומן של שש ושמונה שבועות. ב- 18 שבועות בשומן האכלה, שתי קבוצות של שמונה עכברים טופלו שבועי עם נוגדן anti-IL-1β monoclonal עכבר או פקד IgG מתאימים-isotype ב- 10 מ"ג/ק"ג במשך 8 שבועות (איור 1)⁷. עכברים הקריב, perfused עם פתרון מחברים-PBS 4%. העורקים brachiocephalic היו גזור, מעובד, למחלקה כמתואר לעיל (איור 2

Discussion

למרות עשרות שנים של מחקר, ההתקדמות הטכנית בלימוד טרשת עורקים, השדה יש היסטוריה מאכזב של תרגום ממצאים מדעיים כדי טיפולים קליניים^34,35. תופעה זו ניתנת להסבר באופן חלקי על ידי סתירות חייתיים, עיצובים מוטוריים, וניתוחים הנגע. במסמך זה, אנו מתארים של צינור ניסיוני שבהן השתמשנו כדי לנתח את ההרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת באמצעות שושלת היוחסין עקיבה עכברים⁷. שיטה זו מאפשרת חקירה קפדנית של מיפוי גורל תא, phenotyping, אשר הם פרמטרים מרכזיים ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	RT 15710	זלוף וקיבוע רקמות
23G מחט פרפר	פישר	BD367342
25G מחט	פישר	14-821-13D
מיקרוסקופ קונפוקלי A1	מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון
נוגדן ACTA2-FITC (עכבר)	סיגמא אולדריץ'	F3777	נוגדן ראשוני
Alexa-647 אנטי עזים	Invitrogen	A-21447	נוגדן משני
תמיסת חשיפת אנטיגן, מבוסס חומצת לימון	Vector Labs	H-3300	תמיסת אחזור אנטיגן
צ'או דיאטה	Harlan Teklad	TD.7012
Coverslip	Fisher	12-544-14	כל 50 x 24 מ"מ כיסוי זכוכית
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	גרעין פלואורסצנטי נגד
כתמים חמור Alexa-488 אנטי ארנב	Invitrogen	A-21206	נוגדן משני
חמור Alexa-555 נגד חולדות	Abcam	ab150154	נוגדן משני
DPBS 10X ללא סידן ומגנזיום	Gibco	14200166	PBS לדילול תמיסה ושטיפות. לדלל ל -1x במים נטולי יונים
הטמעת קלטת	פישר	15-182-701D
צינור ואקום ETDA	פישר	02-685-2B
אתנול 200 הוכחה	דקון	2701
כרית קצף	פישר	22-222-012
ג'לטין מעור דגי מים קרים	סיגמא אולדריץ'	G7765
נוגדן GFP (עז)	abcam	ab6673	נוגדנים ראשוניים
עז בקרת IgG	מעבדות וקטור מעבדות	I-5000	בקרת IgG
דיאטה עתירת שומן	Harlan Teklad	TD.88137
ImageJ	NIH		תוכנת מחשב https://imagej.nih.gov/ij/
נוגדן LGALS3 (חולדה)	Cedarlane	CL8942AP	נוגדן ראשוני
LSM700 מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss		מיקרוסקופ קונפוקלי
שקופיות מיקרוסקופ, Superfrost Plus	Fisher	12-550-15
להבי מיקרוטום	פישר	30-538-35
עכבר IgG בקרת	מעבדות וקטור	I-2000	בקרת
IgGתוכנת הדמיית אלמנטים NIS	הדמיה Nikon		לרכישת תמונות z-stack
סרום סוס רגיל	Sigma Aldrich	H1270
פאפ עט	פישר	50-550-221
שמן בוטנים	Sigma	P2144
Prolong זהב Antifade mountant	Invitrogen	P36930	מדיום הרכבה
ארנב IgG בקרת	וקטור מעבדות	I-1000	IgG בקרת
חולדה IgG בקרת	מעבדות וקטור	I-4000	IgG
בקרת RUNX2 נוגדן (ארנב)	Abcam	ab192256	נוגדנים ראשוני
	BD	309628	1 מ"ל
טמוקסיפן	סיגמה	T5648
קסילן	פישר	X55K-4
תוכנת הדמיה Zen	Zeiss		Imaging לקליטת תמונות z-stack