תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את הפעילות Shigellacidal של נוגדנים בסרום. סרום מעורב עם חיידקים, המשלים אקסוגני, מתפשט, ואת תערובת התגובה הוא מצופה על פלטות אגר. חיידקים קיימא יוצרות מושבות הנספרות, באמצעות מונה המושבה אוטומטית, כדי לקבוע את כייל נוגדנים אחרים.

תקציר

סרום מבחני אחרים (SBAs) מודדים את הפעילות פונקציונליים של נוגדנים, שימשו במשך עשורים רבים. SBAs למדוד ישירות נוגדנים הרג פעילות על-ידי הערכת היכולת של נוגדנים בסרום לאגד חיידקים ולהפעיל המשלים. הפעלה זו התוצאה פירוק הריגת חיידקים היעד. מבחני אלה הם בעלי ערך מכיוון שהם מעבר לכימות בייצור נוגדן התירי את תפקודים ביולוגיים שיש נוגדנים אלה, ומאפשר לחוקרים ללמוד את התפקיד נוגדנים שעשויים לשחק למניעת זיהום. SBAs שימשו ללמוד תגובות מערכת החיסון עבור פתוגנים אנושיים רבים, אבל יש אין מתודולוגיה נפוצה ומקובלת שיגלה בזמן הנוכחי. מבחינה היסטורית SBAs היו מאוד עתירי עבודה, הדורשים זמן רב שלבים רבים לכמת במדויק את החיידקים ששרדו. פרוטוקול זה מתאר פשוט, עמיד, ואת תפוקה גבוהה assay כך מדויק נוגדנים פונקציונלי אמצעים בשביל שיגלה בנסיוב במבחנה. השיטה המתוארת כאן יתרונות רבים על SBAs מסורתיים, כולל השימוש של מניות חיידקי קפוא, 96. ובכן assay צלחות, מערכת מיקרו-תרבות וכן ספירת המושבה אוטומטית. כל השינויים האלה להפוך assay זו שדורשת פחות תפוקה גבוהה יותר. פרוטוקול זה הוא פשוט יותר ומהירה יותר לביצוע מאשר SBAs המסורתית תוך שימוש עדיין זמינים ראגנטים וטכנולוגיות פשוטה. הפרוטוקול יושם בהצלחה במעבדות עצמאיות מרובות והוא וזמינותו לשחזור ועמיד. הבדיקה ניתן להעריך תגובות חיסוניות במחקרים קליניים, כמו גם קליני. לכימות shigellacidal נוגדן titers הן לפני והן אחרי חשיפה אנטיגן (על ידי חיסון או זיהום) מאפשר הבנה רחבה יותר של נוגדן פונקציונלי איך התגובות נוצרות ותרומתם חיסון הגנתי. התפתחות זו סטנדרטית, מאופיין היטב assay עשויה להקל במידה רבה שיגלה חיסון עיצוב.

מבוא

שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם, שיגלה flexneri 2a, flexneri ס' 3 א ו ס sonnei, מדגימים השכיחות אפידמיולוגיים ברחבי העולם. המחלה diarrheal הנגרמת על ידי אלה שיגלה מינים השפעות צבאי, מטיילים¹, הוא הגורם המוביל למוות diarrheal בקרב ילדים מתחת לגיל 5 מדינות מתפתחות². כיום יש אין חיסונים מורשה כדי להגן מפני שיגלה, עם זאת, ישנם מספר חיסונים המועמד בשלבים שונים של הפיתוח. רבים מן החיסונים, ואמצעים אחרים מניעתי כעת בפיתוח, מתמקדים נוגדנים המיוצרים כנגד שיגלה ליפופוליסכריד (LPS). LPS הוא מועמד אטרקטיבי החיסון כי זה אנטיגן פני השטח הגדולות ומשרה זיהום טבעי עם שיגלה נוגדנים ספציפיים LPS שניתן מגן מפני הדבקה חוזרת באופן ספציפי serotype. לכן, חיסון שיגלה מוצלח יהיה ככל הנראה צורך רב-עמודים ולנטיין והמטרה 3-4 שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם לזירוז חסינות מפני 70-80% באופן גלובלי לאומיים זנים^{3,4, 5 , 6}. זה דורש כי מבחני להעריך שיגלה חיסון המועמדים להיות ספציפיות עבור מרובים שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם.

מבחני אימונולוגי הנוכחי להערכת המועמדים החיסון מתמקדים לכימות רמות של נוגדן titers, אבל ישנם כמה מבחני מאופיין היטב להערכה תפקודית נוגדנים. הבחינה של יכולת תפקודית נוגדן חשוב כי נוגדנים ספציפיים הפתוגן אחראיות זיהום דרך מספר מנגנונים תפקודית כולל איגוד אנטיגנים השטח חיידקים, ומניעת הדבקה על ו זיהום של תאי אפיתל, מיקוד תאים חיידקיים או opsonization ו- phagocytosis, ו ישירות להרוג פתוגנים על ידי איגוד ויזמות המפל המשלים. הריגת חיידקים באמצעות נוגדנים ישירה מתרחשת כאשר נוגדנים לאגד רכיבים משטח של חיידקים היעד וליזום את המפל המשלים שמוביל ההפעלה של zymogens רבים כי בסופו של דבר התוצאה במבנה הנקבוביות בבקטריאלי תא זה גורם פירוק ומוות בקטריאלי. זה הרג ישיר של חיידקים על ידי העברת נוגדנים וה משלים עשוי להיות מכריע בתחילת קו הגנה במהלך זיהום.

אנשים שאינם נגועים באופן טבעי יש נוגדנים עם פעילות shigellacidal סרה שלהם. אלה שיגלה -נוגדנים ספציפיים אותרו באמצעות הרג בתיווך משלים מסורתיים מבחני ^7,8. הדבר מציין כי ייתכן תפקיד עבור נוגדנים אחרים בהגנה כנגד שיגלה. מבחני אחרים מסורתי פשוטים את ביצוע: סרום הוא חום-לא פעיל (להשמיד את פעילות משלים אנדוגני) ומערבבים אותו עם החיידק עניין. תערובת זו על ריכוז מסוים נוסף המשלים אקסוגני. תערובת התגובה מודגרות כדי לאפשר הריגת חיידקים, מצופה ואז לאשר המושבה יוצרי יחידות (CFUs). ברגע CFUs נספרים, ניתן לחשב בעל אינדקס הרג 50% (KI) וקבעה כייל SBA. הליך זה הוא פשוט יחסית, מבחני אלה יכול להיות עתירי וצורך לבצע, התוצאה עלולה להיות משתנה מאוד. בנוסף מגבלות אלו, אין מבחני פונקציונליים טוב מאופיין כיום קיימות עבור שיגלה. לכן, יש לנו בהצלחה פיתחו ואנו מוסמך וזמינותו פשוטה, תפוקה גבוהה כדי למדוד פעילות אחרים שיגלה שלושה ארגזים של זנים הרלוונטית קלינית ביותר⁹. פרוטוקול זה מתאר של SBA עם שינויים העשויים משפרים את יעילות assay הפארמצבטית. הראשון של שינויים אלה הוא השימוש של מניות חיידקי קפוא. הייצור של מניות שימוש אחד מבטל את הצורך התרבות חיידקים טריים כל assay תוך כדי הקטנת assay-כדי-assay השתנות. עוד בזמן ובעבודה שמירת היתרון של פרוטוקול זה הוא השימוש של תבנית assay 96-ובכן צלחת. דבר זה מאפשר דילול טורי של דגימות כך ניתן לבחון את מגוון של ריכוזים.  זה גם מאפשר השימוש פיפטות רב-ערוצי עבור ציפוי דוגמאות על בצלחות פטרי מרובע. כאשר פטרי מרובע אלה משמשים בשילוב עם מערכת תרבות המייצרת מיקרו-מושבות, מספר פלטות אגר הדרושות וזמינותו מצטמצם. זה, בשילוב עם התוכנה זמינה בחופשיות ספירת המושבה, שפותח במקור עבור opsonophagocytic מרובבת pneumococcal הורגת assay (MOPA)¹⁰, מאפשר הספירה המושבה מהירה, אוטומטית ואמין. כל השיפורים להפחית באופן משמעותי את הפעם תרגולים assay יצירת מערכת תפוקה גבוהה ומאפשר לוחות מרובים שיש להפעיל בעת ובעונה אחת.

בעוד פרוטוקול זה הותאם עבור שלושה אשר נגרמו מהזנים אליהם הרלוונטית קלינית ביותר של שיגלה, SBA המתוארים כאן ניתן להחיל בקלות רבים אחרים פתוגנים חיידקיים. בנוסף לשימוש פוטנציאלי של פרוטוקול זה עם חיידקים אחרים, פרוטוקול זה יש פוטנציאל להרחיב מעבר השימוש רק סרום כחומר מוצא, אשר יכול לכלול הניתוח של נוגדנים סוגי הדגימה רלוונטיים אחרים כמו דגימות הרירית, כולל דגימות צואה ורוק. השימוש הזה assay לחקור תגובות חיסוניות לאחר החיסון עשוי לתת תובנה רחבה יותר תגובות חיסוניות שנוצר על ידי חיסון מובילים בעיצוב רציונלית של חיסונים, עזרה בהבנה של חסינות טבעית כיצד מתפתח.

פרוטוקול

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של לוח הגנה WRAIR של הסובייקט האנושי. דגימות המשמשות במחקר זה הן דוגמאות בנסיוב אדם נאספו במסגרת מספר פרוטוקול WRAIR 1328, בהתאם לכל תקנות מוסדיים ו פדרלי המסדירים את ההגנה של בני אדם. הדגימות היו בטל מזוהה, השימוש של הדגימות אנונימי כשטח ניסויים אנושיות מאת IRB UAB (פרוטוקול מס ' N150115001).

1. מכינים Assay ריאגנטים

1. להכין 1% ג'לטין על-ידי הוספת 1 גר' ג'לטין 100 מ ל מים. אוטוקלב וחנות בטמפרטורת החדר.
2. להכין 100 מ"ג/מ"ל TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד) מניות פתרון (1, 000 x) על-ידי הוספת 5 גר' TTC 40 מ ל מים. המכללה הוא נמס במלואו, לכוונן את עוצמת הקול כדי 50 מ עם מים, מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 µm. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C, להגן מפני אור.
   הערה: TTC צובע את המושבות חיידקי והופכת אותם הרבה יותר קל לספור. פתרון TTC יש צבע צהוב קלה. אם הפתרון TTC מתפתח צבע אדום, למחוק, להכין טרי.
3. הכינו 10% נתרן אזיד (נאן₃) מניות הפתרון (100 x) על-ידי הוספת 5 g נאן₃ 40 מ ל מים. לאחר התפרקות מוחלטת, מוסיפים מים עד 50 מ"ל. לאחסן בטמפרטורת החדר.
   התראה: אזיד הנתרן רעל, עלולים להיות רעילים אם בלע או נספג דרך העור או העיניים. זה עשוי להגיב עם עופרת, צנרת נחושת כדי ליצור נפיץ ביותר azides מתכת. על השמטה של ריאגנטים המכיל אזיד הנתרן, לשטוף עם כמויות גדולות של מים כדי למנוע הצטברות אזיד או למחוק בשקית של חומרים מסוכנים.
4. להכין צלחת LBA (צלחת אגר ליברות) על-ידי הוספת 35 גר' אגר LB 1 ליטר של מים ושל אוטוקלב. להוסיף 25 מ ל כל צלחת פטרי מרובע (120 x 120 מ מ²). דגירה צלחות ב RT למשך 10-20 דקות כדי לאפשר אגר לגבש. המקום הצלחות בחזרה לתוך שקיות פלסטיק וחנות ב 4 ° C עד חודש.
5. להכין כיסוי אגר על-ידי הוספת 7.5 גר' של אגר 1,000 מ של מים, החיטוי. דגירה באמבט מים 56 ° C עד שהוא נדרש. לפני השימוש, להוסיף 1 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל TTC, 10 מ של 10% נאן₃ ולערבב היטב.
   הערה: כל צלחת LBA צריך 25 מ של כיסוי אגר. כיסוי אגר תוכלו להיות מוכנים מראש חודש, מומסת במיקרוגל או על פלטה חמה לפי הצורך עבור וזמינותו. ודא כי הטמפרטורה אגר ~ 55 ° C לפני ליישום lba של צלחות.
6. להכין מאגר Assay על-ידי הוספת 5 מ"ל מאוזן מלח פתרון (HBSS של הנקס x 10) עם Ca^{2 +}/Mg^{2 +} ו- 5 מ של ג'לטין 1% 40 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.

2. מכינים המשלים יעד חיידקים

1. להכין ארנב התינוק המשלים (BRC)
   הערה: קריטריונים מפורטים עבור המשלים הרבה בחירה, ניתן למצוא כאן: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. והשתמש BRC קפואים להפשיר עם זורמים מים קרים. לערבב פיזית BRC כל ~ 10-20 דקות עד הקרת לחלוטין. כפופים BRC מחזורים הפשרת ההקפאה חוזרות ונשנות.
   2. בעוד BRC הוא מפשיר, תווית צינורות צנטריפוגה 1.5 mL, 5 מ ל או 15 מ"ל. המקום הנקרא צינורות על הקרח להתקרר מראש. אחסון נאות aliquot BRC כדי הצינורות צנטריפוגה טרום מקורר (לאחר מילוי, מיד לחזור כל שפופרת הקרח). חנות aliquots-≤-70 מעלות צלזיוס בתא ההקפאה.
      הערה: כ- 1 מ' של המשלים נדרשת עבור כל צלחת וזמינותו. Aliquots המשלים לשימוש יחיד, צריך להיות aliquoted בכמויות המתאימות assay פריסות.
   3. כדי להכין BRC חום-לא פעיל, להפשיר aliquot אחד של פעיל BRC. הכנת אמבט מים 56 ° C. אחרי BRC מופשר הוא לחלוטין, להעביר אותו המים הרותחים, דגירה למשך 30 דקות.
   4. לאחר דגירה, להסיר BRC להשבית חום לאמבט מים ומאפשרים כדי להתקרר ב RT למשך 10-15 דקות לערבב נמרצות, ו aliquot µL ~ 150 ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות. חנות aliquots-≤-10 ° C.
2. הכן מטרה מלאי חיידקים
   הערה: ההליך שלהלן משמשת להכנת aliquots 48 של מניות חיידקים היעד; אם aliquots יותר יש צורך בפרוטוקול וניתן לשנותם.
   1. להסיר את החיידקים המניות הראשי בקבוקון מהמקפיא, לגרד את פני השטח חיידקי קפוא כדי להסיר כמות קטנה של קרח הצנצנת על צלחת אגר דם. להחזיר לאלתר את המבחנה מניות מאסטר למקפיא.
   2. פסים זה aliquot קטן של מניות חיידקי צלחת אגר דם ועל כיסוי עם המכסה את הצלחת. דגירה את הצלחת הפוך בין לילה ב- 37 °C/5% CO₂ מגשים.
   3. העברת המושבות חלקה מבודד ~ 10 שפופרת 50 מ ל המכיל 30 מ ל מרק ליברות. תקופת דגירה של 3-5 h ב 37 ° C עם טלטול עדין עד שהמרק תרבות יש את יתר של₆₀₀ של ~0.6-0.7.
   4. למסוק העליון מ"ל של תרבות ושל העברת צינור מ"ל. Centrifuge התרבות ב x 15,000 g למשך 2 דקות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה מלמעלה בטבלה. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 25 מ של 15% סטרילי גליצרול-LB.
   5. מערבבים היטב, לוותר על 0.5 mL aliquots לתוך צינורות סטרילי mL 1.5 מיקרו צנטריפוגה (~ 48 צינורות). חנות aliquots-≤-70 מעלות צלזיוס במקפיא.
   6. לאשר את זהותה חיידקי באמצעות מבחן התלכדות לפני השימוש.
3. הנחישות של האופטימלית דילול גורם עבור מניה חיידקים היעד
   הערה: כל אצווה של מניות חיידקים היעד, חייב להיות טיטרציה בתנאים assay כדי לקבוע צורך תשואות ~ 120 CFU/מקום על לוחות LB הדילול.
   1. מספר רישוי microtiter (דילול צלחת) ולהוסיף 135 µL Assay מאגר טוב 1A. להוסיף 120 µL Assay חמאה כדי בארות 1B - 1H.
   2. הסר בקבוקון של חיידקים היעד קפוא מהמקפיא, להפשיר בטמפרטורת החדר. להוסיף 15ul של מניות חיידקי המופשרים טוב 1A כדי לגרום לדילול המניות חיידקי 10-fold.
   3. להעביר 30 µL של חיידקי פתרון טוב 1A 1B טוב לבצע לדילול טורי 5-fold. המשך 5-fold טורי דילולים טוב 1H סה"כ 8 דילולים (1:10 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
   4. להביא microtiter עוד צלחת (צלחת Assay) ולהוסיף 20 µL Assay המאגר כדי טוב בעמודות 1 ו- 2 בצלחת וזמינותו.
   5. להעביר 10 µL של חיידקים מדולל מכל קידוח בעמודה 1 של צלחת דילול הבארות המתאימים בעמודות 1 ו- 2 של צלחת וזמינותו. 10 µL של חיידקים יועברו מ 1A טוב של צלחת דילול לתוך טוב 1A ו- 2A Assay צלחת, וכו '.
   6. המשך וזמינותו כמתואר בסרום אחרים Assay (SBA) מתחת עבור שליטה A ו- B שליטה, צעדים 3.6-3.12.
   7. לאחר הצלחות יש כבר מתפשט על קרח, להשתמש על פיפטה רב-ערוצי עם 8 טיפים פיפטה לזהות µL 10 מן הבארות בעמודה 1 על גבי צלחת LBA. כמו כן, במקום הבארות מעמודה 2 לצלחת LBA.
   8. המשך וזמינותו כמפורט להלן צעדים 3.14-4.6.
   9. לקבוע דילול חיידקים המניבה ~ 120 ש-CFU/במקום שליטה B, דילול זה ישמש וזמינותו.

3. סרום Assay אחרים (SBA)

הערה: ההליך המתואר להלן לוח assay אחד, אך ניתן להגדיל את מספר הצלחות וזמינותו.

1. בטל-חום לבחון דגימות על ידי דגימות ומוכנסות באמבט מים 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   הערה: הבדיקה דוגמאות חייב להיות חום-לא פעיל לפני הבדיקה כדי ביטל כל פעילות משלים אנדוגני. זה יכול להיעשות לפני וזמינותו, יכול להיות מחדש קפוא או המאוחסנים ב 4 ° C עד נבדקו דוגמאות מוחלש.
2. מקבל צלחת Assay להוסיף 20 µL Assay מאגר עמודות 1 עד 12 מתוך שורות A באמצעות G. להוסיף 20 µL Assay מאגר עמודים 1 ו- 2 בשורה H, ראו טבלה 1.
3. לטעון µL 30 של כל מבחן מדגם, כפולות, לשורה H של צלחת וזמינותו. כך למשל, לוותר על 30 µL מדגם 1 לתוך בארות 3 H ו- 4 H, לוותר על 30 µL מדגם 2 לתוך בארות 5 H ו- 6 H, וכו '.
4. ביצוע דילולים טורי 3-fold של הבדיקה דוגמאות באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
   1. להסיר 10 ממוצע המדגם מבארות 3H - 12H והעברת ולס המתאימות בשורה G ומערבבים את הדגימה היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 8 - 10 פעמים.
   2. ואז להסיר 10 ממוצע מבארות דור 3-12G ואת העברת ולס המתאימות בשורה F ומערבבים היטב.
   3. המשך אלה דילולים טורי דרך שורה א לאחר ערבוב הבארות בשורה A, להסיר ולמחוק µl 10 מ בארות 3A-12A כך כל בארות להכיל 20 µl.
      הערה: מכיוון µL 20 של נסיוב משמש אמצעי assay סך של 80 µL, יש 4-fold לדילול נוסף ב וזמינותו. דילול זה חייב להילקח בחשבון במהלך חישוב כייל SBA על-ידי הכפלת הדילול של סרום 4. לדוגמה, אם משמש לדילול ההתחלתי של 1:2, דילול בפועל הנבדקת היא 1:8.
5. הסר את בקבוקון אחד של קפואים מלאי חיידקים היעד, להפשיר בטמפרטורת החדר. לדלל את החיידקים ב- 20 מ של מאגר Assay לפי הגורם דילול האופטימלי שנקבע מראש (הגורם לדילול זה נקבע ב סעיף 2.3). להוסיף 10 µL של חיידקים מדולל מכל קידוח של צלחת assay באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
6. הסר בקבוקון אחד של BRC קפוא, בקבוקון אחד של קפוא לא פעיל חום BRC, להפשיר בטמפרטורת החדר עם זורמים מים קרים או במקום על הפתח של בטיחות ביולוגית ארון עם משבי אוויר להפשיר במהירות.
7. להכין פתרון 20% של חום-לא פעיל BRC. מיקס 100 µL של חום-לא פעיל BRC עם 400 µL Assay המאגר. להוסיף 50 µL של פתרון BRC להשבית חום זה 20% כל בארות בעמודה 1 (פקד וולס).
   הערה: BRC להשבית חום משמש פקד לעקוב אחר הרג לא ספציפית (NSK) ב וזמינותו.
8. להכין פתרון 20% של יליד BRC. מערבבים 1 מ"ל של BRC מקורית עם 4 מ של מאגר וזמינותו. להוסיף 50 µL של תערובת זו כל בארות בעמודות 2 עד 12 (בארות שליטה B ומבחן לדוגמה).
   הערה: הריכוז הסופי של BRC בתערובת התגובה הוא 12.5%.
9. בקצרה לערבב Assay צלחת ע י ניעור בעדינות במשך 10-15 s במטרף צלחת או לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה 8 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
10. לשים את הצלחת Assay חממה מיקרוביולוגית 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים (בלי ללחוץ).
11. יבש שתי צלחות LBA על-ידי הסרת המכסים והצבת לוחות פנים למעלה בבטיחות ביולוגית בארון למשך 40-60 דקות.
12. עם השלמת הדגירה 2 h, להעביר את הצלחת Assay רטוב קרח, תקופת דגירה של 10-20 דקות לעצור את התגובה.
13. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, מערבבים הבארות בשורה H, וכך ספוט צלחת 10 µL של תערובת התגובה על גבי תחתית צלחת LBA. מיד להטות את הצלחת ולאפשר המקומות ינסה לברוח ~1.5-2 ס מ. חזור על הליך זה עבור שורה G, F ו- E, לאתר אותם מעל השורה הקודמת על הצלחת LBA. שורה E, F, G ו- H הם הבחינו אל אחד lba של צלחת, ואת השורה A, B, C ו- D הם הבחינו לצלחת LBA השני באותו אופן, ראה איור 1.
14. דגירה הלוחות LBA בטמפרטורת החדר עד הספוחה הוא הפתרון לתוך הצלחות LBA (10-15 דקות). לשים את המכסים על לוחות LBA ולמקם את הצלחות ב- lba של חממה מיקרוביולוגית במהופך על דגירה בין לילה (~ 16-18 h). דגירה ס flexneri 2a ו- 3a ב 29 ° C, דגירה sonnei ס היא 26 מעלות צלזיוס.
    הערה: טמפרטורות אלו תשואות קטן "מיקרו-קולוניות" עם גדלים מתאים עבור ספירה מדויקת על ידי המושבה מונה⁹.
15. לאחר דגירה לילה, להוסיף 25 מ של כיסוי אגר (ב ~ 55 מעלות צלזיוס) המכילה 100 µg/mL TTC, נאן 0.1%₃ כל צלחת LBA.
16. דגירה הלוחות LBA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר את החיידקים ששרדו לפתח צבע אדום, ראה איור 1 שלהלן.
17. צילום צלחות באמצעות מצלמה דיגיטלית, העברת תמונות למחשב שבו הותקנה תוכנה Enumerating המושבה משולב של NIST (NICE), ראה איור 2.
    הערה: תוכנה נחמדה ספירת המושבה הינה זמינה ללא תשלום. לקבלת פרטים והוראות התקנה, ראה רשימת חומרים .

4. ספירת מושבות בקטריאלי

1. תוכנת נחמד פתוח, קלט שם המפעיל, ניסוי מידע, וכל assay פתקים לתוך השדות הריקים. לאחר הזנת הנתונים הזה לחץ על הלחצן עשו .
2. לייבא לוחות המצולם על-ידי לחיצה על לחצן פתח ובחירה שהקבצים הנכונים מהמחשב.
3. כוונן את הפרמטרים assay על-ידי הגדרת מספר השורות 4 ואת מספר העמודות עד 12. להתאים את הגדרת הרקע -3 סיגמא ברזולוציה נמוכה. ראה איור 2.
4. להעביר את האזורים של הריבית (ROIs) על ידי לחיצה וגרירה כך כל רועי ישירות על דוגמא אחת נקודה. להבטיח כי כל מושבות חיידקים בתוך רועי עם אין חפיפה בין הדגימות. לאחר סיום צלחת אחת, לחיצה כפולה לצלחת הבא ברשימה תמונות נתונים מאוחסנות ולהתאים את ROIs. ראה איור 2.
5. כאשר כל הצלחות הותאמו, לחץ על הכפתור הירוק של הרוזן , ראה איור 2 ואיור 3. ספירת תסתיים לחץ על הלחצן ' ייצוא ' כדי לייצא את הנתונים בתבנית.xls/.xlsx. שם ולשמור את הקובץ.xls/.xlsx לניתוח נתונים.
6. לארגן נתונים שיוצאו לתוך תבנית טבלה כך ספירות מסודרות ב טבלה המייצגת את הצלחת assay 96-ובכן, נראה בטבלה 2.

5. חישוב SBA כייל נוגדנים (KI) והרג שאינם ספציפיים (NSK)

הערה: SBA כייל נוגדנים, או הריגתו אינדקס (KI) מוגדרת על הדדיים של דילול סרום שהורג 50% של חיידקים היעד.

1. לחשב את 50% להרוג ערך סף האינדקס (KI) על ידי חישוב ממוצע של CFU של המשלים פעיל שליטה בארות (שליטה ב) ואת חלוקת ב- 2. לחשב את CFU הממוצע עבור כל דילול של כל מדגם זה היה להפעיל שכפול, עיין בטבלה 3.
2. מכיוון לדילול סרום תניב לעתים נדירות בדיוק ערך קי זה 50%, זה יכול להיות אינטרפולציה של שני רציפים סרום דילולים, אחד שהורג פחות מ 50%, אחד שהורג למעלה מ-50%, ראה איור 4. הנוסחה לחישוב הקי SBA עם אינטרפולציה מוצג להלן:
   
   הערה: כייל נוגדנים אחרים, או קי, גם ניתן לחשב באופן אוטומטי באמצעות התוכנה Opsotiter שפותחה על ידי UAB. כדי לבקש Opsotiter, פנה ד ר מון Nahm או מר רוב ברטון. ראה https://www.vaccine.uab.edu לקבלת מידע ליצירת קשר.
3. לחשב את הערך NSK בלקיחת 1 מינוס הממוצע של B שליטה מחולק הממוצע של שליטה א

תוצאות

פריסה 96-ובכן צלחת בשימוש assay טיפוסי מוצג טבלה 1- פריסה זו יש הבארות פקד פעיל המשלים (שליטה ב), הבארות בקרת חום-לא פעיל המשלים (פקד) ודוגמאות חמש כפולים. דוגמאות הן באופן סדרתי מדולל מקופלים ל- 3 למעלה את הצלחת H שורה לחתור המאפשרות דילולים 8 של כל מדגם ייבדק בעת ובעונה אחת. איור 1 מראה שתי צלחות LBA לאחר התוספת הדגירה ולאחר בשכבת-העל של לילה. פיתוח צבע התרחש והם כל המושבות ששרד גלויים באדום. הריגת חיידקים הוא ראה בבירור עבור כל הדגימות שנבדקו ב שלושת דילולים (שורות F-H) כמו דגימות הן מדולל במעלה הצלחת, ירידה להרוג חיידקים נתפסת איפה סרום מרוכז פחות. ממשק התוכנה יפה ניתן לראות באיור2. מיקרו-המושבה סעיפים מתוך התוכנה נחמד ניתן לראות באיור3, כבר מאורגנות ההאשמות לתוך טבלה 2. הרוזן CFU הממוצע עבור כל דילול של כל מדגם מחושב ולא ערך קי 50% מחושבת בטבלה3. ערך קי זה 50% ניתן ליישם את CFUs בממוצע עבור כל בסרום כדי לקבוע את הערכים הדרושים לחישוב הקי SBA בהתאם לנוסחה המתואר באיור4. תוצאה סופית של וזמינותו מוצג בטבלה4.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

פקד

שליטה B

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

דילול 8

B

פקד

שליטה B

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

דילול 7

C

פקד

שליטה B

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

דילול 6

D

פקד

שליטה B

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

דילול 5

E

פקד

שליטה B

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

דילול 4

F

פקד

שליטה B

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

דילול 3

G

פקד

שליטה B

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

דילול 2

H

פקד

שליטה B

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דילול 1

דוגמה 1

דוגמה 2

דוגמה 3

דוגמה 4

דוגמה 5

טבלה 1: פריסת צלחת Assay. עמודים 1 ו- 2 מכילים הבארות שליטה המשלים. פקד נמצא בעמודה 1 והוא להשבית החום משלימים שליטה, המכיל מאגר SBA, חיידקים, המשלים חום-לא פעיל. שליטה B ממוקם בטור 2 והוא הפעיל משלימים שליטה, המכיל מאגר SBA, חיידקים, המשלים. עמודות 3-12 מכילות הדוגמאות סרום. כל מדגם מנוהל על כפולות, באופן סדרתי מדולל מקופלים ל- 3 משורה H שורה A

איור 1: צלחות LBA לאחר פיתוח צבע. נציג flexneri ס 3a חיידקי מיקרו-מושבות גדלו בן לילה לגודל המתאים. כיסוי אגר נוספה ופיתחו מושבות צבע אדום על ידי הפחתה של המתחם TTC, כיסוי אגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: ממשק התוכנה של NIST מונה המושבה משולב (NICE). ייצוג גרפי של ממשק התוכנה יפה. אזורים מעניינים (ROIs) מרוכזים על מושבות בכל מקום לפני שספר. ניתן לייצא נתונים ישירות מתוך חלון נחמד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: lba של צלחות שנספרו בתוכנה נחמדה. הדימויים תצלום צבע מוטענים לתוך תוכנת נחמד, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) נספרים באופן אוטומטי. תמונה זו מציגה שתי צלחות lba של נציג שלהם מידע ספירה של המושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

185	167	145	151	122	134	119	142	124	115	113	123	1:17496	דילול 8
186	152	145	138	132	135	108	116	100	119	105	109	1:5832	דילול 7
179	160	145	135	109	120	54	55	71	75	79	89	1:1944	דילול 6
193	153	146	138	87	105	5	6	6	9	19	30	1:648	דילול 5
184	129	121	143	6	7	0	1	1	1	1	1	1:216	דילול 4
180	145	22	24	2	3	3	1	1	0	0	0	1:72	דילול 3
207	129	1	0	2	2	1	0	4	1	0	1	1:24	דילול 2
201	140	0	0	0	0	1	1	1	0	4	4	1:8	דילול 1
פקד	שליטה B	דוגמה 1		דוגמה 2		דוגמה 3		דוגמה 4		דוגמה 5

בטבלה 2: סעיפים של מושבות חיידקים. ספירות CFU מיוצאים מתוך התוכנה נחמד להצטיין בתבנית. ניתן לארגן ההאשמות לתוך טבלה המציגה שבקטריאלי נחשב עבור כל פקד בארות ודוגמאות כפולים.

פקד	שליטה B	148	128	131	120	118	1:17496	דילול 8
189	147	142	134	112	110	107	1:5832	דילול 7
NSK (1-CtrB/CtrA): 22%		140	115	55	73	84	1:1944	דילול 6
50% קי (CtrB/2): 73		142	96	6	8	25	1:648	דילול 5
		132	7	1	1	1	1:216	דילול 4
		23	3	2	1	0	1:72	דילול 3
		1	2	1	3	1	1:24	דילול 2
		0	0	1	1	4	1:8	דילול 1
		דוגמה 1	דוגמה 2	דוגמה 3	דוגמה 4	דוגמה 5

טבלה 3: חישוב ערך סף של הקי 50% וממוצעים מדגם כפולים. ערך הסף של הקי 50% מחושב על-ידי לקיחת הממוצע של כל פקד B בארות חילוק 2. ממוצעים של כפילויות חושבו עבור כל דילול של כל מדגם שהופעל על שכפל. NSK ערך מחושב גם.

איור 4: סכימטי של האינטרפולציה הלינארית. מספר החיידקים ששרדו (ציר y)-כל דילול של נסיוב שנבדקו (ציר x) היא להתוות (יהלומים שחורים), נקודות בודדות מחוברות על ידי קו שחור דק, מקווקו. הקווים האופקיים מקווקו ומוצקה מציינים 0% ל- 50% להרוג, בהתאמה. דילולים סרום לעיל (דילול 5) ולא מתחת (דילול 4) 50% להרוג קו מחוברים באמצעות קו אדום, ומצוין כייל נוגדנים אחרים (KI). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

	SBA קי
דוגמה 1	72
דוגמה 2	216
דוגמה 3	1994
דוגמה 4	1994
דוגמה 5	648

בטבלה 4: SBA תוצאות כייל נוגדנים אחרים מראה (KI). ערכים SBA קי הסופי שנקבע עבור כל דגימה ומוצגים. ערכים אלה מחושבים באמצעות CFUs הממוצע את ערך הסף של הקי 50%, הנוסחה האינטרפולציה הלינארית.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים פונקציונלי assay המערכת החיסונית כדי להעריך את הפעילות shigellacidal של נוגדנים בסרום. ב וזמינותו הפגינו על נוגדנים חד-שבטיים זה פרוטוקול ספציפיות עבור 3a ס flexneri היו בשימוש⁹ יחד עם שליטה סרה האנושי של חיסון שיגלה הקודם ללמוד¹¹. המקור של הסרום נבדק בחומר הזה assay עשוי להשתנות באופן נרחב מדגימות בעלי חיים פרה-קליניים דגימות קליניות האנושי, הפעילות shigellacidal של דגימת נסיוב ייפגע על ידי חיסונים חשיפות שחווה הפרט. אשיג קצת יתכנו בין הקשורים קשר הדוק אשר נגרמו מהזנים אליהם, במיוחד ס flexneri 2a ו- 3 א ס flexneri אבל אשיג קצת ניכרות אצל זנים אלו בהשוואה sonnei ס'⁹. הבסיס של SBA מתמקד ההפעלה של המפל המשלים על-ידי איגוד נוגדן-אנטיגן. לכן, הטיפול מהתרכובת BRC הוא אחד הצעדים קריטי רבים הכרוכים בביצוע של פרוטוקול זה. BRC נבחר לשימוש הזה assay בשל ביצועים עקביים רמות נמוכות של NSK אחרים אחרים מבחני^12,13,14.  הפעילות של BRC הוא רגיש לטמפרטורה ועל האמצעים המתאימים כדי להבטיח כי להקפיא הפשרת מחזורים ממוזערים, כי BRC הוא aliquoted בודד שימוש באמצעי אחסון, כי aliquots BRC הם הקרת במהירות, מייד לפני השימוש בוזמינותו. מרקם של פעילות משלים תשפיע על הפארמצבטית של זה וזמינותו. עוד צעד קריטי להשפיע assay הפארמצבטית הוא ייצור דילול מניות חיידקי. חשוב כי לפני תחילת וזמינותו דילול מניות בקטריאלי המתאים נקבע, כהצלחה assay הוא בהתאם הייצור עקבית של פקדים A ו- B יש סעיפים CFU בממוצע CFU ~ 120 לכל מקום. על מנת לקבל כתמים כי הן אפשר לספור על-ידי התוכנה, זה גם הכרחי המשמשת צלחת חיידקים מתבצע בהצלחה. התצהיר של פתרון חיידקי, הטיה של הצלחת כך כתמים לרוץ ~ 2-3 ס מ הוא קריטי לייצור מושבות של התפלגות גודל נכון ונכון עבור ספירה מדויקת על ידי תוכנת נחמד. מאסטרינג כל השלבים האלה יבטיחו כי מדויק, עקביות בתוצאות מיוצרים על ידי פרוטוקול זה

גם כאשר כל השלבים הקריטיים מבוצעות טוב עדיין יתכנו מקרים שבהם יש צורך לשנות או לפתור בעיות בפרוטוקול זה. שינויים של פרוטוקול זה להעריך חיידקים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של לילה LBA צלחת הדגירה הטמפרטורה, כדי להבטיח את היווצרות מיקרו-מושבות. זנים אחרים של חיידקים או נוגדן מקורות, מלבד סרום, עשוי לדרוש אופטימיזציה של ריכוז המשלים. צריך גם לפקח NSK וערכים KIs של sera הבקרה כדי להבטיח וזמינותו עובדים כראוי. NSK צריך לא עולים יותר מ-70%. הקי של שליטה סרה לא אמור להשתנות מתכוון יותר ± 2SD. כדי להשיג תוצאות מוצלחות ועקבית בעת שימוש בפרוטוקול זה, יהיה צורך לבצע את כל הצעדים כמתואר פה עם תשומת לב מיוחדת לשלבים הקריטיים שפורטו לעיל.

בעוד פרוטוקול זה ממלא צריך חשובה בקהילה מחקר שיגלה , זה לא ללא המגבלות. פרוטוקול זה מתבסס על חומרים ביולוגיים ו, לכן, תמיד תהיה השתנות קצת קשה לשלוט. וריאציות בפעילות המשלים מגרשים וממקורות עשוי לתרום מבחני דרגות השונות. כדי להמתיק את זה, חשוב לטפל המשלים כראוי ולבדוק החדש הרבה משלים לפעילות לפני רכישה. זה גם עשוי להיות שימושי ליצירת בריכות של הרבה משלים עם פעילות ידוע לקבל באספקה הומוגנית. פרוטוקול זה פשוט על ידי עיצוב, אינו דורש שום ציוד מיוחד, המושבה אוטומטיות מונה התוכנה זמינה בחופשיות. בעוד הפשטות היא יתרון, המאפשר את פרוטוקול זה ייעשה כמעט בכל מעבדה, הוא עדיין דורש דגירה של לילה. תוארו מבחני האחרונות, הרבה דרישות דגירה קצר יותר, אך ידרוש ריאגנטים מיוחדת, הכנה¹⁵. הגבלה נוספת של זה וזמינותו היא במתכונתה הנוכחית שזה רק המסוגלת לחקור זן חיידקי יחיד בעת ובעונה אחת. בשטח שיגלה יש רצון ליצור חיסון multivalent, לאחר מבחני אימונולוגי כך שתוכל להעריך פתוגנים באופן מולטיפלקס הוא בעל ערך רב. Assay הזה יכול להיות שונה בעתיד כדי לענות על צורך זה, אבל במתכונתה הנוכחית, זה וזמינותו יחיד-פלקס.

בעוד assay הזה יש כמה מגבלות, עדיין יש יתרונות רבים על פני שיטות הקיימות או אלטרנטיבית. יתרונות אלו כוללים שיפורים רבים המשלבים כדי להפוך את ההוצאה להורג של שיטה זו שדורשת הרבה פחות יותר תפוקה גבוהה יותר SBAs המסורתי. השימוש של מניות חיידקי קפוא, תבנית assay צלחת 96-ובכן, את ציפוי על בצלחות פטרי מרובע גדול, מוספים המושבות המאפשר לצלם וממשיכים אוטומטי המושבה-, לעזור להפחית את החומרים ואת הזמן הדרוש כדי לסיים את זה וזמינותו. Assay הזה יש גם יתרונות על פני שיטות אחרות תפוקה גבוהה כי זה לא דורש שום נוגדנים מיוחדים או ציוד. הפרוטוקול המתואר יכולה להתבצע עם ריאגנטים בסיסי ותוכנה זמינה בחופשיות, מתן אפשרות עבור היישום שלה בכל סביבה מעבדה.

כל היתרונות פרוטוקול זה מספק תומך השימוש בחקירות רבות בעתיד. וזמינותו הוא אידיאלי עבור הבחינה של תגובות חיסוניות לאחר חיסון או זיהום טבעי. יישום זה מאפשר SBA להיות כלי רב ערך מחקר שיגלה חיסון, שכבר השתמשת בו כדי להעריך את החיסון immunogenicity בחיסונים ביו-המספר המשלים שיגלה איפה זה הוכיח את היכולת של חיסונים אלה זירוז הייצור של נוגדנים פונקציונלי¹⁶. פרוטוקול זה נבדק באופן מקיף על ידי מעבדות מרובים, הוכח לייצר תוצאות אמין, לשחזור⁹. פרוטוקול זה גם מפיקה תוצאות דומות כאשר הדגימות באותו נבדקים באמצעות מבחני אחרים האחרים¹⁷. עקביות נתונים שנוצרו על-ידי זה וזמינותו, והופכת את התאימות שלו לשיטות בוגרים אחרים חזקים כלי להערכת פעילות אחרים הדוגמאות סרום במדויק. הבדיקה בקלות גם ניתן להתאים כדי להעריך את סוגי מדגם נוספים. ואילו סרום זמין בקלות בניסויים קליניים למבוגרים, זה יכול להיות קשה להשיג מספיק סרום בניסויים התמקדות תינוקות וילדים קטנים; אחד של אוכלוסיות היעד בסופו של דבר עבור חיסונים שיגלה . בניסויים אלה, דם באופן שגרתי שנאסף על נייר סינון, ייבוש. היו הצלחות ראשוניות בתבנית דגימה באמצעות SBA מסוג זה. בנוסף דם, דגימות הרירית (כגון רוק, תמציות צואה ושתן) הם גם מטרה שהוא רלוונטי במחקר שיגלה חיסון. כיום, פרוטוקול זה יוערכו על שלושה אשר נגרמו מהזנים אליהם הרלוונטית קלינית ביותר של שיגלה אבל זה גם יכול להיות מותאם spp. שיגלה נוספים, כמו גם אחרים פתוגנים חיידקיים. עבודה עתידיות יתמקדו לייצור assay מולטיפלקס עם הרבה מאפיינים זהים לאלה וזמינותו מתוארת על ידי פרוטוקול זה. וזמינותו מרובבת יאפשר הערכה של מספר שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם בו זמנית, נוסף שימור לדוגמה ואמצעי הידיים בזמן וזמינותו. יש גם עבודה לדרך כדי להעביר זה וזמינותו מעבדות ברחבי העולם. בהערכות הכללית יפיק יותר נתונים לקראת מוקדמות וזמינותו בקנה מידה מחקר גדול, בזמן בו זמנית מספר גדל והולך של מעבדות מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה יש גישה זו SBA להעריך חיידקים, סרום דגימות אסף ממקומות שונים אנדמיים. וזמינותו המתוארים כאן ופשוט תפוקה גבוהה ויש לו את היכולת לשפר את ההערכה אימונולוגי שיגלה שדה, כמו גם יישומים רחבה יותר הערכה של אחרים פתוגנים חיידקיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ג'לטין	Sigma	G9391	סוג B, אבקה, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)	Sigma	T8877	≥ 98.0% (HPLC)
נתרן אזיד (NaN3)	Sigma	S2002	≥ 99.5%
Baby Rabbit Complement	PelFreez	31061-3	HBSS בן 3-4
שבועות עם Ca2+/Mg2+	Invitrogen	14065-56	ללא פנול אדום
LB אגר (Lennox)	Sigma	L2897	אבקה מדיום גידול מיקרוביאלי
Bacto Agar	BD	214010	אבקה, (C12H18O9)n
Glycerol	Sigma	G5516	לביולוגיה מולקולרית, ≥ 99%
LB מרק (לנוקס)	Sigma	L3022	אבקה גידול מיקרוביאלי בינוני
צלחת פטרי מרובעת	סיגמא	Z617679-240EA	120 מ"מ x 120 מ"מ
צלחת בדיקה	Costar	3799	96 באר צלחת U-תחתונה עם מכסה
NICE Software	אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/