הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59167

⸱

7 במרץ 2019

 , 
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

תקציר

פרץ חימצוני או הנשימה משמש לתאר את צריכת החמצן מהירה ויצירת של מינים חמצן תגובתי (ROS) phagocytes בתגובה לגירויים שונים של מערכת החיסון. ROS שנוצר במהלך הפעלת המערכת החיסונית מפעילה פעילות מיקרוביאלית חזק בעיקר דרך היכולת של ROS נזק DNA, חלבונים, גרימת מוות של מיקרואורגניזמים. היכולת למדוד ROS ייצור reproducibly, בקלות הכרחי על מנת להעריך את התרומה של מסלולים שונים, מולקולות מנגנון ההגנה המארח. בנייר זה, אנו מדגימים את השימוש הגששים פלורסנט, flow cytometry לזהות ROS הייצור. למרות בשימוש נרחב, פלורסנט מדידה של ROS הוא מאד בעייתי, במיוחד בכל הנוגע מדידה של ROS שנגזרות לגירויים ספציפיים, לא mitogenic. אנו מציגים מתודולוגיה מפורט כדי לזהות ROS שנוצר בעקבות גירוי FcγR מסוים החל דור מקרופאג לקרקע, מכתים, FcγR cross-linking, סיום עם ניתוח תזרים cytometric.

מבוא

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי או רדיקלים חופשיים, כי הם תוצר לוואי של נשימה אירובית (נבדקה ב 1). אלה כוללים את סופראוקסיד אניון, מי חמצן, מימן על-חמצני, רדיקלי הידרוקסיל ו יוני הידרוקסיל, בין היתר. בתנאים רגילים הפיזיולוגיות, ROS מיוצרים בעיקר על ידי המיטוכונדריה nicotinamide אדנין dinucleotide פוספט (ניקוטין) oxidases, הן במהירות מאושפרת על ידי אנזימים וחלבונים שונים כמו סופראוקסיד דיסמוטאז גלוטטיון. ייצור מוגזם ROS או פגם ביכולת להסיר ROS יכול לגרום סטרס חמצוני, לפיה מינים חמצן תגובתי לקדם את הנזק של חלבונים, ליפידים ו DNA שמוביל מתח סלולארית או מוות ועם מצבי מחלה פתולוגית. עם זאת, הוא מעריך כיום כי ROS יכול גם לפעול מולקולות איתות (חמצון-חיזור איתות), בתיווך ROS שינוי של מולקולות שונות שביל ביניים יכולים להשפיע על חילוף החומרים הסלולר, התפשטות, הישרדות, דלקתיות איתות, והתיישנות2. בתאים phagocytic, רוס ממלא תפקיד חיוני במתן פעילות מיקרוביאלית במהלך כביכול "פרץ הנשימה"1,3,4,5,6. במהלך התגובה של phagocytes לגירויים חיצוניים, מרכיבי אוקסידאז nadph ל מורכבים (p40phox, p47phox, p67phox) translocate מ ציטוזול למוח phagosomal המכילות את gp91phox ואת p22phox subunits, יחד עם הפעולות של Rac1/2, יוצרים מתפקדת במלואה nadph ל אוקסידאז האנזים מורכבים. אוקסידאז nadph ל שהורכב ואז מנצל nadph ל כדי לצמצם את החמצן סופראוקסיד בתוך חלולית phagosomal. סופראוקסיד אניונים ישירות יכול לגרום לנזק או להיות dismutated לתוך מימן על-חמצני. סופראוקסיד והן מימן על-חמצני יכול להגיב עם מולקולות אחרות ליצירת רדיקלים הידרוקסיל תגובתי. נזק מתווך התגובה של אלה ROS עם ברזל-גופרית אשכולות על חלבונים או על ידי גרימת חמצון הבסיס של ה-DNA, המוביל בסופו של דבר מוגבל מטבוליזם מיקרוביאלי או מוות של חיידק5. החשיבות של האנזים אוקסידאז nadph ל מורכבים של ROS המיוצרים במהלך הנשימה פרץ זה מודגם קלינית בחולים עם מחלת גרגירומת ממושכת כרונית (CGD)7,8,9, 10. אנשים עם CGD מחזיקים מוטציות בגן gp91phox, והתוצאה היא חוסר ייצור ROS, רגישות לזיהומים חוזרים ונשנים עם חיידקים ופטריות אשר אינם בדרך כלל בעיה עם immunocompetent יחידים. לכן, אם לומד חימצוני מתח, חמצון-חיזור איתות או הגנה המארח, להיות מסוגל למדוד ROS הייצור בזמן אמת הוא מאמץ שימושי.

כבר מנוצל מספר מבחני הפקה ROS מידה או בתוצאות של סטרס חמצוני11,12,13. בין אלה, אחד בשימוש נרחב ביותר הוא בדיקה פלורסנט 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (2- DCFH DA)14. מולקולה זו הוא חסר צבע lipophilic. פעפוע של DCFH2-DA על פני קרום התא מאפשר לו להיות שכוונת מאת תאיים esterases, אשר deacetylates את זה לתוך DCFH2, טיוח זה תא אטום. הפעולות של מספר סוגים של ROS (מימן על-חמצני, peroxynitrite, הידרוקסיל רדיקלים, תחמוצת החנקן ו רדיקלים peroxy) DCFH2 נישחק זה לתוך DCF אשר פלורסנט (דיווח Ex / Em: 485-500 ננומטר/515-530 ננומטר), ניתן להבחין באמצעות זרם cytometer מצויד עם מסנן סטנדרטי עבור fluorescein (ערוץ FL1). סופראוקסיד אינו מגיב בחריפות עם DCFH2 אבל יכול להגיב עם dihydroethidium בדיקה נוספת (היא) להניב פלורסנט מוצר ה-2-hydroxyethidium (מוצרי פלורסנט סופראוקסיד תלויית חמצון יתר)15. המוצרים פלורסנט של חמצון היא שניתן לאתר באמצעות אורך גל של עירור של 518 ננומטר, אורך גל של פליטה של 605 ננומטר (ערוץ FL2). למרות פשוטה יחסית לשימוש, ניצול של אלה זונדי גילוי של ROS דורש ידע של המגבלות שלהם, תיאגוד זהיר מכתים תהליכים ובקרות לתוך וזמינותו מסוימת המבוצעת על מנת שיהיה תקף ניסיוני תוצאות ומסקנות. הפרוטוקול הבא מדגים את השימוש ערכת זמינים מסחרית העסקת אלה 2 רגשים שעיצב למדוד ROS cytometry זרימה. אנו כתם להתקפת מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם אלו הגששים, זירוז ייצור ROS באמצעות FcγR cross-linking. אנו להציג נציג נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה, הלחץ המתאים אמצעי זהירות זה חייב להתבצע עבור ניסויים מוצלחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול עבור טיפול בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מרכז פלורידה.

1. דור של מח העצם נגזר מקרופאגים (BMDMs)

  1. תרבות המדיה הכנה
    1. להכין מדיה הבסיס D10F: כדי של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), להוסיף 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FBS), פירובט נתרן 1 מ מ, 10 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), מ מ 0.05 β-mercaptoethanol.
      הערה: למרות שזה הכי טוב להשתמש במדיה D10F טריים, מדיה הבסיס D10F ניתן להכין עד שבועיים מראש שישמש עבור ניסויים מרובים תוך שבוע. על עכבר אחד, כ 175 מ"ל של מדיה הבסיס D10F היא הצורך (25 mL לרוקן את העצמות) 150 מ כדי להפוך מקרופאג בידול מדיה
    2. להכין LADMAC הצמיחה מדיה: המינימום חיוני בינוני כדי רשנה (EMEM), להוסיף 10% חום להשבית FBS ו- 2 מ מגלוטמין. הכנת הטרייה מדיה, ביום בכוונתך להפעיל את התרבויות.
      הערה: ליטר אחד של מדיה צמיחה LADMAC תגרום כ (19) 50 מ ל aliquots של התקשורת LADMAC ממוזגים.
    3. להכין מדיה DMEM מלאה: כדי DMEM, להוסיף 10% חום להשבית FBS ו- 1 x אנטיביוטיקה-Antimycotic. הכנת הטרייה מדיה, ביום BMDMs יהיה לקצור.
      הערה: עבור עכבר אחד, בסביבות 100 מ של התקשורת מלאה DMEM יידרש. זה כולל מדיה המשמשת עבור הטרמה התאים.
  2. הכנת LADMAC ממוזגים בינוני
    1. לגדול LADMAC תאים confluency בקערה 10 ס מ באמצעות 10 מ"ל של צמיחה LADMAC מדיה (המוגדר ב 1.1.2). דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2-
    2. ב confluency, ניתוק התאים על ידי בכוח dispensing מדיה מעל לתאים. מעבר תאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של תאים מנותקת לתוך מבחנות T-175 המכיל 100 מ של LADMAC הצמיחה מדיה. דגירה תאים עד confluent לגמרי ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (כשבוע). בדרך זו, מנה אחת של 10 ס מ ניתן תשואות T-175 10 מבחנות או כ 1 ליטר של מדיה ממוזגים.
    3. ברגע התאים מוכנים, לאסוף את המדיה ממוזגים צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 5 דקות כדי הצניפה תאים לא רצויים. לסנן את supernatants שנאספו דרך מסנן 0.2 מ מ ולאחסן aliquots 50 מ ב- 80 ° c Aliquots של התקשורת LADMAC-מיזוג יכול להישמר ב-80 מעלות צלזיוס במשך חודשים עם הפסד מינימלי של פעילות.
      הערה: אם ניסויים גדולים הם הצפוי, להכין קבוצות גדולות של ממוזגים LADMAC מדיה במקביל כדי להבטיח עקביות. אם הדבר אינו אפשרי, להשתמש aliquots נגזר באותה אצווה או הרבה ממוזגים LADMAC מדיה עבור ניסוי.
  3. הכנה של מח העצם נגזר מקרופאגים
    1. ביום של הניסוי, להכין טרי מקרופאג בידול מדיה על-ידי הוספת 25% LADMAC ממוזגים מדיה לתוך D10F בעבר מוכן מדיה (1 חלק LADMAC ממוזגים מדיה 3 חלקים D10F). לא להכין מדיה זו מראש! רק להכין כמה שיותר המדיה לפי הצורך עבור התרבות BMDM.
    2. יום 1: בידוד תאי מח עצם העכבר לפי פרוטוקול שתואר לעיל16 עם שינוי ריקון מח עצמות הירך, tibias באמצעות מדיה הבסיס D10F. השתמש 2.5 מ של התקשורת D10F את המים בכל קצה של העצמות (4). ריקון תאים במח העצם ישירות לתוך מסננת תא טרום רטוב 40 מ מ, מניחים על גבי צינור 50 מ. התקשורת הנותרים (~ 5 מ"ל) יכול לשמש כדי לשטוף את מסננת התא.
    3. Centrifuge תאים במח העצם שנאספו ב 350 x גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend את התאים סך של 30 מ של מדיה בידול מקרופאג (לכל עכבר).
    4. להכין, תווית פטרי סטריליות 10 ס מ (6). צלחת 5 מיליליטר מקרופאג בידול מדיה לתוך כל לתוך צלחת פטרי. Aliquot 5 מ של תאים במח העצם resuspended בתקשורת בידול מקרופאג לתוך כל צלחת פטרי עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל לכל תבשיל. תקופת דגירה של 5 ימים בטמפרטורה של 37 ° C, 5% CO2-
    5. יום 5: האחות המדיה מן התאים. לשטוף פעם עם 1-2 מ של PBS ולהוסיף 10 מ"ל של מדיה בידול מקרופאג המוכנים באופן טרי. תקופת דגירה של נוספים 3 ימים.
    6. יום 8: להמשיך לקצור BMDMs כפי שמתואר להלן.

2. קציר, זריעה, הטרמה של BMDMs

  1. לאחר 7 ימים של גידול BMDMs את התקשורת בידול מקרופאג, הסר את תגובת שיקוע. רחץ מקרופאגים חסיד פעם אחת עם 1-2 מ של PBS. מחוק לגמרי מגניב.
  2. לוותר על 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך מקרופאג כל צלחת ולעזוב אותם בחממה 37 º C למשך 5-10 דקות עם הקשה בתדירות גבוהה כדי לנתק את התאים. מביצועם מקרופאגים trypsinized על ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000 ולאסוף מקרופאגים 50 מ ל צינורות המכיל 10-15 מ של מדיה DMEM מלאה. לשטוף את הצלחת עם mL 2 נוספים מדיה DMEM מלאה למסוק כל מקרופאגים הנותרים.
    התראה: אל תשאירו מקרופאגים בטריפסין יותר מ 10 דקות.
  3. Centrifuge צינורות 50 מ ל- x 350 גרם עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע. בעדינות מביצועם בגדר, resuspend התאים 10 מ"ל של מדיה DMEM מלאה. מקרופאגים ספירה באמצעות hemocytometer בנוכחות הכדאיות לצבוע כגון trypan blue כדלקמן:
    1. לדוגמה, לערבב עם µL 10 תאים µL 90 של Trypan blue לקבלת 1:10 דילול.
    2. תערובת זו, טען 10 µL hemocytometer ולספור הכיכר המרכזית (רשת 5x5). סה כ. ספירת = ספירת x 104 x דילול פקטור x (10) נפח (10 מ"ל).
  4. להתאים את התליה תא יהיה 1 מיליון/מ ל מדיה DMEM מלאה וצלחת 4 מיליליטר ההשעייה תא לתוך כל מנה 6 ס מ.
    הערה: מינימום של 3 צלחות נדרש לכל ניסוי. צלחת אחת של תאים יהיה שמאלה unstimulated, קבוצה שנייה של תאים מגורה דרך cross-linking של FcγRs, הצלחת השלישית של תאים ישמש עבור כל הנוספות ניסיוני בקרות זרימה cytometric.
  5. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  6. למחרת, וארוקן את תגובת שיקוע, שטיפת התאים פעם אחת עם 1-2 מ של PBS. להוסיף 4 מ של המדיה מלאה המכילה 100 ננוגרם למ"ל העכבר IFN-γ בכל צלחת. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  7. אם רצונך בכך, לקחת את aliquot של התאים כדי להעריך את דור המתאים של BMDMs על ידי cytometry זרימה. השתמש עונה 1 פרק 106 תאים לכל מבחן ולהתכונן צינורות FACs פוליסטירן התנאים הבאים: שליטה isotype, מוכתם F4/80 (או לחלופין, מוכתם CD11b).
  8. להכין cytometry זרימה מכתים מאגר על-ידי הוספת 0.1% FBS לתוך 1 x PBS. השתמש רק זה כמות FBS כדי לא לשלול את ההשפעות של סרום-רעב בשלבים מאוחר יותר.
  9. Aliquot עונה 1 פרק 106 תאים לכל שפופרת צנטריפוגה ב x 750 גרם במשך 5 דקות.
  10. לשטוף פעם אחת על ידי decanting או כ רפה בעברית תגובת שיקוע resuspending בתאים 2 מ של מאגר cytometry זרימה. צנטריפוגה ב x 750 גרם במשך 5 דקות.
  11. האחות תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 100 של cytometry זרימה מכתים מאגר. להוסיף 1 µL של העכבר אנטי Fc CD16/32 נוגדן חסימת כל שפופרת. דגירה על קרח למשך 5 דקות.
  12. בלי כביסה, להוסיף 2 µL של FITC נגד העכבר F4/80 או µL 1 של APC העכבר אנטי CD11b נוגדנים "מוכתם" הצינורות וכמות דומה של הנוגדן שליטה isotype המתאימים כדי צינורות "isotype". דגירה על קרח, בחושך, למשך 30 דקות.
  13. רחץ תאים על-ידי הוספת 2 מ של PBS ישירות אל התאים. צנטריפוגה ב x 750 גרם במשך 5 דקות.
  14. האחות תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 150 ל- PBS.
  15. להשיג דגימות על cytometer זרימה באמצעות תנאי העצירה של 100 µL או אירועים 10,000 על השער של עניין ולהבטיח את FL1 FSC, האס, (FITC אנטי-עכבר F4/80) או FL4 (APC אנטי עכבר CD11b) ערוצי נבחרו עבור הפרמטרים להיות מנותח.
  16. באמצעות התוכנה cytometry זרימה, פתיחת מגרש נקודה עבור FSC (בציר ה-x) vs האס (בציר ה-y) וצייר שער מסביב לתאים של עניין, לא כולל תאים מתים ופסולת (תאים מתים ופסולת אירועים הרבה יותר קטן מאשר באוכלוסיה התא העיקרי ומופיעים על לאו r שמאל של העלילה).
  17. Gating על תאים מעניינים, פתוח מגרש היסטוגרמה עם FL1 (FITC אנטי-עכבר F4/80) או FL4 (APC אנטי עכבר CD11b) בציר ה-x.
  18. תריץ את דגימת "isotype". ליצור שער מרקר אז את רוב האירועים מדגם "isotype" הם משמאל לשער (< % 1 חיובית). תבנית זו חלות על הקובץ לדוגמה מוכתם.
  19. תריץ את דגימת "מוכתם". דור מוצלחת של BMDMs תגרום > ביטוי 95% FITC אנטי-F4/80 או APC אנטי עכבר CD11b (איור 1 א'), ואילו תנאים תרבות שגוי עלול לגרום בדור תת אופטימלית של מקרופאגים (איור 1B).
    הערה: אם יצירת BMDMs של אחרים מרובים, שימו הביטוי של סמנים אלה עבור כל אצווה של BMDM שנוצר, במקרה וזה עלול להיות עילה למעט דגימת מניתוח כאשר הדור ROS בתגובה לגירוי מוערך.

3. מגיב, חומר הכנה ROS מדידה

  1. לשקם הכימית זיהוי סטרס חמצוני lyophilized ב µL 60 של DMF נטול מים להניב פתרון מניות 5 מ מ. מערבבים בעדינות לפני השימוש.
    הערה: נכתב במדריך ערכת ROS-ID כי אורך חיי המדף של הכימית משוקם הוא כשבוע ב-20 ° C. Aliquoting בנייתו מחדש מיד לאחר לתוך מבחנות אור-הוכחה קטנה ריאגנט ממזער את החמצון ומגדיל את אורך חיי המדף ב-20 ° C.
  2. לשקם את ריאגנט לזיהוי סופראוקסיד lyophilized ב 60 µL של DMF נטול מים להניב פתרון מניות 5 מ מ. מערבבים בעדינות לפני השימוש.
    התראה: כאמור במדריך קיט, לטיפול ריאגנטים זיהוי שני כמו מוטגנים אפשרי, להתמודד עם כל אחד עם טיפול, השלך כהלכה.
  3. לשקם ROS משרן (Pyocyanin) ב- µL 20 של DMF נטול מים להניב פתרון מניות 50 מ מ.
  4. לשקם את ROS מעכב (N-acetyl-L-ציסטאין) ב- µL 123 של מים יונים להניב בריכוז 0.5 M מניות.
  5. תווית מ ל סביב צינורות פוליסטירן (צינורות cytometry זרימה) עם הפקדים ניסיוני ועל תנאי. (ראה 4. פקדים ותנאים assay)
  6. להכין סרום נמוך DMEM (אין פנול אדום) על-ידי הוספת 0.1% FBS כדי DMEM נטולת פנול אדום.
  7. Aliquot נוגדן anti-BSA לתוך aliquots קטן (תלוי השימוש) ואחסן אותם ב- 80 ° C
  8. להכין מלאי פתרון של 100 מ"ג/מ"ל של BSA ב- HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח) או PBS. Aliquot 100 µL aliquots, חנות ב-20 ° C.
  9. להכין פתרון 2 x של הגששים ROS (2 x פתרון בדיקה): עבור כל 10 מ"ל של נסיוב נמוכה DMEM, להוסיף 4 µL של ריאגנט לזיהוי סטרס חמצוני (צבע ירוק) ו- 4 µL של ריאגנט לזיהוי סופראוקסיד (צבע כתום).
  10. להכין 2 x פתרונות בדיקה המכיל רק ריאגנט לזיהוי סטרס חמצוני (2 x בדיקה פתרון, ירוק בלבד), או שמכילים רק סופראוקסיד זיהוי ריאגנט (2 x בדיקה פתרון, orange בלבד). להכין רק את הכמות של ריאגנט לצורך הניסוי והכן תמיד הפתרון 2 x מיד לפני השימוש.
    הערה: כדי להכין כרכים קטנים של 2 x פתרון זיהוי, השתמש 1:10 ביניים דילול של ריאגנטים זיהוי ירוק וכתום לפני הדילול האחרון ב- DMEM. לדוגמה, כדי להכין 1 מ"ל של 2 x פתרון זיהוי, לדלל 1 µL של כל בדיקה לתוך 9 µL של DMEM (1:10 ביניים דילול). 4 µL זה לדלל 1:10 ביניים דילול לתוך 1 מ"ל של DMEM.

4. assay תנאים ופקדים

  1. כוללים את הפקדים הבאים ניסיוני פיצויים cytometric זרימה על ניסוי:
    a) תאים מוכתם ו- unstimulated.
    b) התאים צבעונית רק עם סטרס חמצוני זיהוי הכימית (ריאגנט ירוק), שטופלו משרן ROS.
    ג) התאים מוכתם רק הכימית זיהוי סופראוקסיד (ריאגנט כתום), שטופלו משרן ROS.
  2. עבור כל עכבר או שכפול ביולוגי, כוללים 6 התנאים הבאים:
    a) תאים מוכתם ו- unstimulated
    b) תאי ויטראז'ים ו- unstimulated
    ג) צבעונית תאים שטופלו משרן חיובי
    ד) המוכתם תאים שטופלו משרן חיובי והמעכב ROS
    ה) המוכתם בתאים מופעלת באמצעות FcγR cross-linking
    ו) ויטראז'ים מופעלת באמצעות FcγR cross-linking והתאים שטופלו ROS מעכב
  3. לחשב הסכום של 2 x בדיקה הפתרון הדרוש לפי מספר עכברים והתנאים (200 µL של 2 x פתרון המכשיר ישמש עבור כל תנאי המחייב מכתים).
    הערה: עבור וזמינותו שימוש בעכברים 6, 5 מצבים הדורשים מכתים עם הגששים יהיה צורך לכל העכבר. זה מביא את המספר הכולל של התנאים ל- 30. לכן, הסכום הכולל של פתרון בדיקה x 2, הצורך הוא לפחות 6 מ ל (30 * 200 µL).

5. תא הכנה

  1. לאחר הטרמה של המקרופאגים בין לילה, וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
  2. סרום להרעיב את התאים על-ידי החלפת מדיה באותו אמצעי אחסון של נסיוב נמוך DMEM. עבור כל עכבר, לוח אחד יטופלו עם אנטי-BSA IgG1 ואילו סרום רעבים, בעוד השני יישאר ללא טיפול. להוסיף רק נמוך סרום DMEM צלחות שלא טופלו. להוסיף סרום נמוך DMEM המכילים 2.5 µg/mL מאתר IgG אנטי-BSA1 ללוחות שטופלו.
    הערה: לוח אחד ללא טיפול נוסף נדרש עבור ניסוי עבור הפקדים פיצוי זרימה cytometric.
  3. דגירה הצלחות במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  4. לאחר סרום ברעב, לקצור את התאים על ידי גירוד עדין או באמצעות 0.2 מ מ EDTA ב- PBS. לאסוף אותם ב שכותרתו 5 מ"ל סביב צינורות התחתון, צנטריפוגה אותם ב 750 x גרם במשך 5 דק לשמור על מעקב אחר של התאים טופלו אנטי-BSA מאתר IgG1.
  5. רחץ תא כדורי פעם אחת עם 2 מ של PBS להיפטר אנטי שיורית-BSA מתאי שטופלו.
  6. Resuspend תא גלולה ב 600 µL של נסיוב נמוך DMEM.
  7. מן התליה תא µL 600, aliquot µL 200 לתוך mL 5 עם תוויות ברורות מראש סביב התחתון צינורות כדלקמן:
    1. מן התאים אינו מטופל, לקחת µL 200 עבור צינורות מתויג µL 200 עבור צינורות שכותרתה "חיובי משרן" "unstimulated", µL 200 עבור צינורות מתויג "משרן חיובית + מעכב"
    2. מ ה IgG אנטי-BSA1 תאים שטופלו, לקחת µL 200 עבור צינורות מתויג "FcγR crosslinking/FcγR XL" ל- 200 µL עבור צינורות מתויג "FcγR XL + מעכב"
    3. מתאי לא מטופל כדי לשמש עבור פקדים פיצוי, לקחת 200 µL בים מתויג "מוכתם unstimulated", µL 200 עבור "ירוק + משרן" שליטה ובקרת µL 200 עבור "כתום + משרן".
      הערה: אם התאים מן 5.7.1 5.7.3 נגזרות העכבר זהה, התאים אותו "מוכתם. unstimulated" יכול לשמש עבור הפקד ניסיוני ופיצויים. אם לא, יהיה צורך של µL 200 נוספים של תאים עבור פקד ניסיוני "מוכתם unstimulated" עבור).
  8. לשמור את הצינורות על הקרח עד מכתים וגירוי. במהלך הרעב סרום ואיגוד של IgG1, להכין את הגששים לגירויים ספציפיים, inducers כמתואר להלן.
    הערה: אם ביצוע וזמינותו בפעם הראשונה, אם התבנית לא זמינה, או פיצוי לאחר--למעשה זמין על זרימה cytometer, תוכנה מתאימה, לעורר, כתם הפיצוי בקרות והפעל אלה cytometer זרימה כדי לבצע פיצוי ידנית לפני תוספת של גירויים על דגימות ניסיוני.

6. ביצוע וזמינותו

  1. להכין 2 x חיובי משרן פתרון על ידי דילול של בטחונות Pyocyanin 2 x פתרון בדיקה (להכין בשלב 3.9) 2 x בריכוז של מיקרומטר 500 של pyocyanin (ריכוז הסופי יהיה 250 מיקרומטר). כמו כן, לדלל מטריים pyocyanin לתוך אחד של "2 x בדיקה פתרון ירוק בלבד", "פתרון בדיקה x 2, כתום רק" צינורות שהוכן ב- 3.10.
    הערה: שני התנאים בלוחיות הסבר "משרן חיובית" ולא "משרן חיובית + מעכב" יטופלו עם משרן חיובי. בהתאם לתוכנית בעת חישוב הסכום של 2 פתרון חיובי משרן x כדי להכין. לדוגמה: אם ביצוע וזמינותו עם עכברים 3, 6 תנאים (3 * 2) יטופלו עם משרן חיובי, לכן היכונו 6 * 200 µL = 1.2 מ של 2 x חיובי משרן פתרון.
  2. להכין 2 x BSA פתרון על ידי דילול הפתרון מניות BSA 2 x בדיקה פתרון בריכוז של 2 µg/mL (הריכוז הסופי יהיה 1 µg/mL).
    הערה: שני התנאים בלוחיות הסבר "FcγR XL" ו "FcγR XL + מעכב" יטופלו עם 2 x BSA פתרון. בהתאם לתוכנית בעת חישוב הסכום של פתרון כדי להכין. לדוגמה: אם ביצוע וזמינותו שימוש בעכברים 3, 6 (3 * 2) תנאים יטופלו עם פתרון BSA, אז 6 * 200 µL או 1.2 מ של 2 x BSA הפתרון יהיה צורך.
  3. לפני שמתחילים את גירוי ספציפי (FcγR crosslinking), ודא כי כל ריאגנטים, התאים מוכנים. במקום הצינורות על הקרח לפי הסדר שהם יהיו מגורה.
  4. עבור זרימת cytometers עם תעשיה, שימו לב הזמן שלוקח cytometer כדי לנתח דוגמא אחת ולעבור לאחרת, לרבות כל ערבוב בדיקה שטיפת מדרגות (לדוגמה 3.5 דקות).
    הערה: התזמון הוא מאוד קריטי עבור זה וזמינותו. על מנת עבור כל תנאי להיות נשלט היטב, הגירוי צריך להתבצע במשך הזמן המדויק (30 דקות) עבור כל תנאי. לעורר תאים לפי סדר ולשלב את זמן ההשהיה בין מדגם הרכישה על ידי cytometer הזרימה. לדוגמה, אם והספיגה cytometer לנתח דוגמא אחת ולעבור לאחרת 3.5 דקות, לעורר תאים לפי הסדר שהם ינותחו כל 3.5 דקות.
  5. אם ביצוע ידני פיצוי בשלב זה, לעורר שפורפרות הבקרה שישמשו עבור פיצוי (שלב 5.7.3). להוסיף 200 µL של "2 x בדיקה פתרון ירוק רק" המכיל משרן (מ- 6.1) לתוך הצינורות המסומנים "ירוק + משרן" (שלב 5.7.3). להוסיף 200 µL של "2 x בדיקה פתרון, כתום רק" המכיל משרן (שלב 6.1) לתוך הצינורות המסומנים "כתום + משרן" (שלב 5.7.3).
  6. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחושך.
  7. באמצעות התוכנה cytometry זרימה, ליצור תווית 3 קבצים לדוגמה עבור פקד "מוכתם, לא מטופל", "ירוק + משרן" ואת "כתום + משרן" דגימות, מקפיד לציין הפרמטרים/ערוצי להיות מנותח (FSC, האס, FL1, FL2), רצוי להפסיק תנאים (100 µL, 3 דקות, וכו '.). צור, תווית ערכה דומה של קבצים עבור דגימות ניסיוני.
  8. תריץ את דגימת "וללא רבב, לא מטופל". פתיחת מגרש נקודה עבור FSC (בציר ה-x) vs האס (בציר ה-y) וצייר שער מסביב לתאים של עניין, לא כולל תאים מתים ופסולת (תאים מתים ופסולת אירועים הרבה יותר קטן מאשר באוכלוסיה התא העיקרי, מופיעים בפינה הימנית התחתונה של העלילה).
  9. שימוש שער "תאים" זה, לפתוח עוד נקודה מזימה של FL1 (ציר x) לעומת FL2 (ציר y). לצייר דרך שער רביע הראשונית. להתאים את השערים רביע כך האירועים מופיעים על רביע השמאלית התחתונה של העלילה vs FL2 FL1.
  10. תריץ את דגימת "ירוק + משרן". להתאים את המתח כך האירועים מופיעים על ימין ועל שמאל התחתון את הרביעים העלילה vs FL2 FL1. במטריצת פיצוי זה חלות על כל הקבצים מדגם 3.
  11. תריץ את דגימת "כתום + משרן". להתאים את המתח כך האירועים מופיע העליונה התחתונה נשאר הגזרות של העלילה vs FL2 FL1. במטריצת פיצוי זה חלות על כל הקבצים מדגם 3.
  12. בדוק כל קובץ פיצויים ולהבטיח כי אירועי "מוכתם, לא מטופל" מופיעים על רביע השמאלית התחתונה, אירועים "ירוק + משרן" להופיע נמוך ימינה ושמאלה הגזרות, אירועים "כתום + משרן" מופיע העליונה התחתונה נשאר הרביעים vs FL1 העלילה FL2. חלות המטריקס פיצוי על כל הקבצים מדגם ניסיוני.
    1. ודא כי שכר הולם חלה על כל הקבצים דגימת הבקרה לפני החלת המטריקס פיצוי על כל הקבצים מדגם ניסיוני. עיין איור 2 לקבלת נציג נתונים מציג uncompensated ודוגמאות מדובבים כראוי.
      הערה: cytometers רבים לייעד FL1 סטנדרטי FITC/GFP ערוץ (נרגש כחול 488 ננומטר לייזר, ו זוהה עם סט מסנן 530/30) ו- FL2 כערוץ PE סטנדרטי (נרגש כחול 488 ננומטר לייזר, ו זוהה עם סט מסנן 585/40). אנו משתמשים אמנה זו זהה אבל שים לב משתמשים חדשים cytometry זרימה כדי להתייעץ עם מנהל הליבה שלהם cytometry זרימה כדי להבטיח כי cytometer שלהם מוגדר באופן דומה כי הערוצים המקובלים משמשים כדי לזהות אלו הגששים. בהתאם לדגם של זרימה cytometer, המלווה את התוכנה, ייתכן שתהיה אפשרות לבצע פיצוי לפני או אחרי להיות רכש דגימות. אם לאחר--למעשה פיצוי אפשרי, הצעד פיצוי יכול להתבצע לאחר כל דוגמאות ניסיוני שרכשו מאת cytometer. עבור cytometers עם טווח דינמי, שבו PMT מתח התאמות לא נחוצים, ניתן גם לבצע ניסוי פיצוי ביום נפרד, התבנית ניסיוני (כולל המטריקס פיצוי) ניתן לשמור כדי לצמצם את הזמן הדרוש לביצוע פיצוי ידנית.
  13. ברגע פיצוי ידנית בוצעה, תבנית ניסיוני מתקבל, להתחיל טיפול ניסיוני דגימות. לפני טיפול עם משרן חיובי או גירוי תא FcγR, לסמן אילו צינורות לקבל ROS מעכב. פנקו את התאים האלה עם ROS מעכב לפחות 30 דקות לפני משרן חיובי או גירוי FcγR.
  14. כדי להוסיף את המדכא ROS, הכנת ריכוז הסופי של 5 מ מ על-ידי הוספת 1 µL של המדכא 200 µL של תאים resuspended (ללא אנטי-BSA IgG1).
  15. לטיפול תאי עם הגירוי (או משרן חיובי), לטעון את התאים עם הגששים ROS כמפורט להלן:
    1. עבור תאים unstimulated: להוסיף 200 µL של 2 x בדיקה פתרון ללא כל גירוי µL 200 של השעיה תא מתויג "מוכתם, unstimulated".
    2. עבור פקדים חיובי: להוסיף 200 µL של 2 x פתרון חיובי משרן (להכין בשלב 6.1) µL 200 של השעיה תא מתויג "משרן חיובי" או "משרן חיובית + מעכב".
    3. עבור תאים מגורה על ידי FcγR cross-linking (ספציפי הגירוי): להוסיף 200 µL של 2 x פתרון BSA (להכין ב- 6.2) µL 200 של השעיה תא מתויג "Fcγr XL" או "FcγR XL + מעכב".
      הערה: זכור לשלב את זמן ההשהיה בין דגימת על-ידי הוספת גירוי כל x דקות כאשר x הוא זמן ההשהיה בין רכישת דוגמא אחת הבא.
  16. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחושך. לנתח את הדגימות לפי הסדר שהם היו מגורה באמצעות cytometer של זרימה מצויד עם תעשיה. להשתמש בתבניות של ניתוח שנוצרו במהלך השלבים פיצוי ראשונית. לא לשטוף את התאים לפני ניתוח.

7. לזרום cytometry ניתוח נתונים ותוצאות הצפויה

  1. בתוך התוכנה cytometry זרימה, לפתוח את הקבצים שנוצרו בעבר ניתוח על הדגימות ניסיוני (תבניות נוצרו בשלבים 6.7-6.12, דגימות נוהלו בשלב 6.16). ודא כי המטריקס פיצוי מלבצע פיצוי ידנית הונחה כראוי על הדגימות ניסיוני.
    הערה: זרימה cytometers, תוכנה cytometry זרימה מסוגל פיצויים לאחר--למעשה, אם המטריצה פיצוי לא הוחל בעבר על הקבצים מדגם ניסיוני, להחיל אותו בשלב זה.
  2. בדומה אימות הנכון פיצוי ידנית, ודא כי הפקדים בתוך הדגימות ניסיוני להתנהג בצורה בלתי צפויה.
    1. להבטיח כי האירועים "וללא רבב, לא מטופל" יופיע על רביע השמאלית התחתונה של העלילה FL2 לעומת FL1, כי האירועים "משרן חיובי" להראות פלורסצנטיות מוגברת בפינה השמאלית העליונה, העליון נכון, להוריד את חלקי נכון של העלילה FL2 לעומת FL1, וכי" משרן חיובית + ROS המדכא"אירועים להראות ירידה בקרינה פלואורסצנטית בפינה השמאלית העליונה, העליון נכון והורד נכון הרביעים vs FL1 מגרש FL2 בהשוואה של קרינה פלואורסצנטית נצפתה עם המדגם"משרן חיובית".
    2. אם הפקדים בתוך הדגימות ניסיוני אינם מראים כל זריחה מוגברת, לבדוק את כל השלבים assay בוצעו, ודא דור המתאים לקרקע של מקרופאגים הנגזרות מח עצם (2.7-2.19), ולאחר חזור על הניסוי. אם הפקדים בתוך הדגימות ניסיוני להראות המגמות הצפויות, להמשיך לנתח דגימות ניסיוני מגורה דרך FcγR (איור 3 א).
  3. ודא כי הגירוי FcγR ספציפיים פועל כראוי. הפעל את הדוגמאות הבאות מתוך עכבר C57BL/6J WT: "מוכתם, unstimulated", "צבעונית, unstimulated", "מוכתם, מגורה דרך FcγR", ואת "מוכתם, גירוי באמצעות FcγR + ROS מעכב". אלה תואמות דגימות 4.2a, 4.2b, 4.2e, 4.2f בסעיף 4, בהתאמה.
    1. להבטיח כי האירועים "מוכתם, unstimulated" יופיע על רביע השמאלית התחתונה של העלילה vs FL2 FL1, כי אירועי "צבעונית, unstimulated" יופיעו גם רביע השמאלית התחתונה של העלילה vs FL2 FL1, אירועים "מוכתם, גירוי באמצעות FcγR" הזה להראות פלורסצנטיות מוגברת בפינה השמאלית העליונה, העליון נכון והורד חלקי נכון של העלילה vs FL2 FL1, וכי "צבעונית, גירוי באמצעות FcγR + ROS המדכא" אירועים יראה ירידה פלורסצנטיות השמאלית העליונה, הימנית העליונה ולאחר הימנית התחתונה הגזרות של העלילה FL2 לעומת FL1 לעומת הדגימה "מוכתם, מגורה דרך FcγR" (איור 3 א).
    2. אם ציפיות אלו אינם מתקיימים, לדוגמה, המדגם "מוכתם, מגורה דרך FcγR" מציג מינימלי או אין קרינה פלואורסצנטית מוגבר לעומת הדגימה "מוכתם, unstimulated", או מדגם "מוכתם, unstimulated" כבר מראה בצורה ניכרת רמות גבוהות של קרינה פלואורסצנטית לעומת הדגימה "וללא רבב, unstimulated", לבדוק כל השלבים assay בוצעו כהלכה, ודא דור המתאים, הטרמה, וטיפול BMDMs (2.7-2.19), וחזור על הניסוי. אם הציפיות הללו מתקיימים, המשך הניתוח של שאר הדגימות ניסיוני.
      הערה: תאים בהפקת ROS אשר מגיבים עם החללית ירוק (מימן על-חמצני, peroxynitrite, הידרוקסיל רדיקלים, ניטריק אוקסיד, peroxy רדיקלים, וכו ') להופיע העליונה נכון ולהוריד נכון הרביעים יומן FL1 (ציר x) לעומת יומן FL2 עלילה נקודה (ציר y). תאים בהפקת ROS אשר מגיבים עם החללית כתום (במידה רבה אך לא באופן בלעדי סופראוקסיד) יופיעו ברבעים שני העליון של יומן FL1 (ציר x) לעומת יומן FL2 עלילה נקודה (ציר y).
  4. צור היסטוגרמות נפרדות, פיקוח על תאים מעניינים, לניתוח של זריחה FL1 ו- FL2. באמצעות דגימות "וללא רבב, unstimulated", ליצור היסטוגרמה סמן כזה כי כל האירועים "וללא רבב, unstimulated" מופיעים משמאל סמן זה. להחיל את העלילה הזאת עם הסמן לשאר הדגימות ניסיוני (איור 3B).
  5. מציגים את התוצאות של הניסוי כאחוז של התאים חיובי עבור כל אחד את הגששים ROS או על-ידי הצגת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) של הדגימות מגורה לעומת שליטה (איור 3C).

8. תא השטח מכתים בשילוב עם ניתוח cytometric תזרים של ROS הייצור (אופציונלי)

הערה: שלב זה מספק פרוטוקול עבור צביעת מקרופאגים עם סמן התא-פני לפני גירוי של המדידה FcγR ו- ROS. זה עשוי להיות שימושי בהערכת ייצור ROS אוכלוסיות מעורבות לתאים. חשוב לבחור נוגדן עבור מקרופאג סמן משטח מצומדת הולם עבור חיל הים זה לא מפריע זריחה של ריאגנטים זיהוי חימצוני מתח או סופראוקסיד. ב פרוטוקול זה, משמש נוגדן עבור העכבר ש-f4/80 מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647.

  1. צור BMDMs, הקציר, פריים אותם כפי שתואר קודם לכן (סעיפים 1 ו- 2).
    הערה: מינימום של שלושה ס מ 6 צלחות הדרושים על מנת לבצע כל הפקדים ניסיוני ועל התנאים כמפורט להלן. לוח אחד יטופלו עם אנטי-BSA IgG1 ואילו סרום ברעב, ואילו שאר הצלחות שני יישאר ללא טיפול.
    1. כוללים פקדים ניסיוני 4 אשר ישמשו עבור זרימת פיצוי cytometric (לכל ניסוי):
      a) תאים מוכתם ו- unstimulated.
      b) תאי מטופלים עם ריאגנט לזיהוי סטרס חמצוני (ריאגנט ירוק) ואת משרן ROS.
      ג) תאים שטופלו עם ריאגנט לזיהוי סופראוקסיד (ריאגנט כתום) ואת משרן ROS.
      ד) תאים מוכתם רק עם אנטי-העכבר F4/80 מצומדת כדי אלקסה 647.
    2. עבור כל עכבר או שכפול ביולוגי, כוללים 3 התנאים הבאים:
      a) מוכתם F4/80 ושמאלה unstimulated
      b) מוכתם F4/80 ומופעלת באמצעות FcγR
      c) מוכתם F4/80 מופעלת באמצעות FcγR ואת שטופלו ROS מעכב
  2. לאחר הטרמה של המקרופאגים בין לילה, וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1-2 מ של PBS. סרום להרעיב את התאים על-ידי החלפת המדיה באותו אמצעי אחסון של נסיוב נמוך DMEM. עבור כל עכבר, לוח אחד יטופלו עם אנטי-BSA IgG1 ואילו סרום ברעב, בעוד השניים האחרים לוחות להיות מטופל. דגירה הצלחות במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  3. לאחר סרום ברעב, לקצור את התאים על ידי גירוד עדין או באמצעות 0.2 מ מ EDTA ב- PBS. לאסוף את כל צלחת ב שכותרתו 5 מ"ל סביב צינורות התחתון, צנטריפוגה אותם ב 750 x גרם במשך 5 דק לשמור על מעקב אחר של התאים טופלו אנטי-BSA מאתר IgG1.
  4. רחץ תא כדורי פעם אחת עם 1-2 מ של PBS להיפטר אנטי שיורית-BSA מתאי שטופלו.
  5. Resuspend אחד של כדורי תא מהצלחת אשר לא קיבלה anti-BSA IgG1 ב 600 µL של נסיוב נמוך DMEM. תאים אלה יהיה לא יהיה נתון מכתים פני שטח התא. השתמש אלה עבור פקדים פיצוי. Aliquot 200 µL של ההשעייה תא אל (3) מ ל לעגל התחתון צינורות שכותרתו a) וללא רבב, unstimulated b) ירוק סטרס חמצוני ריאגנט + ROS משרן, ריאגנט לזיהוי סופראוקסיד ג) כתום + משרן ROS.
  6. Resuspend אחד של התא. גללים מהצלחת אשר לא קיבלה anti-BSA אג1, ב- 300 µL של cytometry זרימה מכתים מאגר (PBS + 0.1% FBS). Aliquot 100 µL של ההשעייה תא אל (2) מ ל סביב צינורות התחתונה עבור צביעת עם אנטי-העכבר 647 אלקסה F4/80.
  7. Resuspend כדורי תא מהצלחת אשר קיבל אנטי-BSA IgG1 ב- 300 µL מאגר מכתימים cytometry זרימה. Aliquot 100 µL של ההשעייה תא אל (2) מ ל סביב צינורות התחתונה עבור צביעת עם אנטי-העכבר 647 אלקסה F4/80.
  8. כתם התאים, אשר היו aliquoted 8.6, 8.7, עם 5 µL של אלקסה 647 אנטי עכבר F4/80 במשך 30 דקות על קרח, בחושך.
  9. לאחר צביעת, שטיפת תאים על-ידי הוספת 2 מ"ל של PBS, צנטריפוגה ב x 750 גרם, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend כל שפופרת ב 200 µL של נסיוב נמוך DMEM ללא פנול אדום. להפריש שפופרת לא מטופל אחת כדי לשמש ביחידים מוכתמים FL4 הבקרה. להכין הגששים, משרן, גירוי FcγR, מעכבי ROS כפי שמצוין בסעיפים 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 ו- 6.14.
    1. עבור תאים לא קבלת אנטי-BSA אג1, תווית צינורות עם הבאות:) אין גירוי או משרן ב) ROS.
    2. עבור תאים אשר קיבלה anti-BSA אג1, לתייג את הפעולות הבאות:) Fc XL או b) Fc XL + מעכב.
  10. לעורר את הדוגמאות כדי לשמש לפיצוי על פי הטיפולים המתאימים שלהם כפי שמצוין ב- 6.5-6.6, בסדר שבו הם יקראו על cytometer זרימה, המאגדת את זמן ההשהיה בין רכישת דוגמא אחת ולמחרת.
  11. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחושך. לנתח את הדגימות לפי הסדר שהם היו מגורה באמצעות cytometer של זרימה מצויד עם תעשיה.
  12. לבצע ידנית פיצוי כפי שמתואר 6.7-6.12 וניתוח נתונים כמתואר בסעיף 7.
  13. באמצעות התוכנה cytometry זרימה, ליצור עם מדבקה 4 קבצים לדוגמה עבור הפקד "מוכתם, לא מטופל", "ירוק + משרן", "כתום + משרן" ו "מוכתם F4/80" דגימות, מקפיד לציין את הפרמטרים/ערוצי להיות מנותח (FSC, האס, FL1, FL2, FL4) תנאי עצירה הרצוי (100 µL, 3 דקות, וכו '.).
  14. הפעל את הדגימות וצור נקודה חלקות לבצע ידנית פיצוי.
    1. עבור צביעת משטח תאים, ליצור שני מגרשים נוספים: FL1 (ציר x) לעומת FL4 (ציר y) ו FL2 (ציר x) לעומת FL4 (ציר y). התאם את המתחים כדי להבטיח שלנפגעים מוחל כפי שמוצג איור 7 א. לאחר כל פיצוי בוצעה כראוי, להחיל המטריקס פיצוי על כל הקבצים מדגם ניסיוני.
  15. לאחר פיצוי ידנית בוצעה תבנית ניסיוני מתקבל, להתחיל טיפול ניסיוני דגימות כמצוין ב- 6.13-6.15.3 ולרכוש דוגמאות על cytometer זרימה כפי שמתואר 6.16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול שמתואר בתוך, אנו מציגים את הנתונים נציג הדגמת זיהוי cytometric זרימת הייצור ROS הנובע גירוי של WT C57BL/6J BMDMs דרך FcγR. כצפוי, שאנו צופים שינויים מינימאליים ב FL1 או FL2 זריחה מעל רקע רמות בתאי unstimulated (איור 3A, להשוות לעומת "מוכתם, unstimulated" נקודה "וללא רבב, unstimulated" מתווה). אנו מבחינים עלייה ב- FL1 ו- FL2 זריחה כאשר התאים הם גירוי עם FcγR cross-linking הסוכן (איור 3 א, להשוות בין "מוכתם, מגורה באמצעות Fc cross-linking" לעומת ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

DCFH2-DA ומבוסס-היא גילוי של ROS היא טכניקה נפוץ14,15. קלות שימוש והתאמה של אלה ROS זונדי תבניות microplate קינטי, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או זרימה cytometric ניתוח תרם הפופולריות שלהם. עם זאת, במחקרים שלנו של פונקציות מקרופאג בתיווך FcγR, שם לא נראה להיות פרוטוקול תקני עבור ביצוע וזמינותו הזה עבור ניתוח תזרים cytometric של תאים צולבים FcγR. בהתחשב באופי תגובתי של analytes המוערך, מצאנו כי התזמון היא בעלת חשיבות מכרעת לוודא כי הפארמצבטית מושגת. למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות חברים אחרים של המעבדה Tigno-ארנחואס כולל ומדלין ה. מילר, עומר קרדונה, Andjie Jeudy, Roopin סינג על עזרתם בתחזוקת המושבה האחזקה ועכבר מעבדה. תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי גרנט R00 HL122365 וקרנות סטארט-אפ J.T.T-איי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחקר חדשני נגד BSA IgG1IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b ו-kappa; איזוטיפ Ctrl נוגדןBioLegend400626
נוגדן נגד עכבר CD16/32BioLegend101302
נוגדן נגד עכבר F4/80 מצומד ל-Alexa Fluor 647BD Biosciences565853
נוגדן נגד עכבר F4/80 מצומד ל-FITCBioLegend123108
נוגדן CD11b נגד עכבר/אנושי מצומד ל-Alexa Fluor 647 BioLegend101218
בטא-מרקפטואתנול (BME)SigmaM3148-100 מ"ל
סרום בקר אלבומין (BSA) FractionVFisherBP1600-100
C57BL/6J מעבדות ג'קסוןמלאי מס' 000664
CM-H2DCFDAבדיקות מולקולריותC6827יכול להוות תחליף למגיב לזיהוי מתח חמצוני בערכת Enzo
Dihydroethidium (DHE)בדיקות מולקולריותD11347יכול להוות תחליף למגיב לזיהוי סופראוקסיד בערכת Enzo
DMEM 1xCorning10-013-CV
DMEM ללא פנול אדוםGibco31053-028
DMF נטול מים Acros Organics61094-1000
סרום בקר עוברי (FBS)VWR97068-085
FITC Rat IgG2a, κ איזוטיפ Ctrl נוגדןBioLegend400506
HEPES (1M)Gibco15630-080
L גלוטמיןGibco25030-081
תאי LADMACATCCCRL-2420
MEMCorning10-010-CV
עכבר IFN-gGoldBio1360-06-100
N-אצטיל-L-ציסטאיןEMD Milipore106425יכול להוות תחליף למעכב/נבלות ROS בערכת
Enzo ציטומטר זרימה נובוציט עם דגימה אוטומטיתAcea2060R
Pyocyanin (משרה ROS)10009594 כימי קיימןיכול להוות תחליף למשרה בערכת Enzo
ROS-ID ערכת זיהוי ROS/סופראוקסיד כוללתENZOENZ-51010
נתרן פירובט (100 מ"מ)גיבקו11360-070
טריפסין-EDTA (0.25%)גיבקו25200-056
ערכת

מקורות

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ציטומטריה עם זרימהמדידת ROSהפעלת מקרופאגיםקולטן Fc גמאזיהוי עקה חמצוניתגששים פלואורסצנטייםמקרופאגים ממקור מחלקה גרמיתבקרות פיצוימעכב ROSגירוי באמצעות פיוציאנין
מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.