היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.
מבוא
פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס"מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.
שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,-2<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית.
1. לגרדום הייצור
- להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת החדר.
- ברגע מקורר, לשלב את הפתרונות כדי ליצור תערובת פולימר הסופי של חיית המחמד, פו (20:80).
- Electrospin הפתרון PET+ פו על גבי מוט פלדה אל חלד (1 מ"מ קוטר), ניצול מחט קצה קהה 20 גרם על מזרק 60 מ ל מלא הפתרון PET:PU באמצעות ערכה אספקת החשמל של DC מתח גבוה כדי +14 kV המחט, עוד כוח DC מתח גבוה לספק מו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6.
איור 2 הוא סקירה של לגרדום PET:PU TETG תהליך הייצור. פתרון PET:PU היה electrospun על גבי מחט בוטה 20 גרם כדי להשיג את עובי הקיר TETG הסופי של 300 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על מנת להבין את המנגנונים תאית ומולקולרית משפיע עליהם.
שהראתי כאן הנוכחות של תאי אפיתל (איור 4), כמו גם את היכולת של המודל מסכם את הדברים שתל היצרות (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.9% הזרקת נתרן כלורי | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10 סמ"ק פיפט סרולוגי | פלקון | 357551 | |
| 18 גרם 1.5 אינץ'. מחט | BD | 305190 | |
| 1 מ"ל מזרק | BD | 309659 | |
| צלחת 24 בארות | קורנינג | 3526 | |
| 25 סמ"ק פיפט סרולוגי | פלקון | 356535 | |
| 25G 1 אינץ'. מחט | BD | 305125 | |
| צינור 50 סמ"ק | BD | 352070 | |
| רפידות הכנה לאלכוהול | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| תמיסת Baytril (enrofloxacin) | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/ 6, מעבדות | ג'קסון | 664 | 6-8 שבועות |
| ציטראט מאגר pH 6.0 20x תרכיז | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| אפליקטורים עם קצה כותנה | פישר מדעי | 23-400-118 | |
| ציטוקרטין 14 נוגדן חד שבטי | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 מלקחיים | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 מלקחיים | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 - מלקחיים עדינים | FST | 11274-20 | |
| F4/80 נוגדן נגד עכבר עכברוש | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| מספריים עדינים - חד-קהה | FST | 14028-10 | |
| משקפי כיסוי פרימיום של Fisherbrand | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield הרכבה מדיה עם DAPI | Abcam | ab104139 | |
| עז-אנטי עכבר IgG נוגדן משני Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| עז-אנטי ארנב IgG נוגדן משני Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| עז-אנטי חולדה IgG משני נוגדן Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| איבופרופן | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| רפידות הכנה ליוד | פעמי מקצועי בינלאומי, בע"מ | NDC 10819-3883-1 | |
| נוגדן פוליקלונלי קרטין 5, מטוהר | BioLegend | 905501 | |
| הזרקת קטמין הידרוכלוריד | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| מלקחיים מיקרו-אדסון | FST | 11018-12 | |
| מיקרוסקופ | Leica | M80 | |
| ספוגים לא ארוגים | Covidien | 441401 | |
| משחה | אופטלמית Dechra מוצרים וטרינריים | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (פוליאתילן טרפתלט & פוליאוריטן) פיגומים | פתרונות ננו-סיבים | בהזמנה אישית | |
| צלחת פטרי | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 בינוני | Gibco | 11875-093 | |
| מחזיק מחט TISH / מלקחיים | Micrins | MI1540 | |
| גוזם | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-T ü מספריים אביב bingen | FST | 15008-08 | |
| מחזור מים חמים | Gaymar | TP-700 | |
| תמיסה סטרילית קסילזין | Akorn בריאות בעלי חיים | NDC 59399-110-20 |
מקורות
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proo....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
