דג זברה מהונדס lck:eGFP אקספרס GFP מאוד לימפוציטים מסוג T, השתמשו ללמוד פיתוח תא T ו לוקמיה לימפובלסטית חריפה. הקו הזה יכול לשמש כדי מחקר B תאים, אשר אקספרס lck ברמות נמוכות. פרוטוקול זה מתאר טיהור תאי B ממאיר, שאינם ממאירים של דג זברה lck:eGFP .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג זברה (רזבורה rerio) הם במודל רב עוצמה ללמוד פיתוח לימפוציטים. כמו של יונקים, rerio ד בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית הכוללת B ו- T לימפוציטים. מחקרים של דג זברה lymphopoiesis קשים בגלל נוגדנים זיהוי סמני פני שטח התא rerio ד הם בדרך כלל לא זמין, שמסבך בידוד ואפיון של אוכלוסיות שונות לימפוציט, כולל B-היוחסין תאים. קווים הטרנסגניים עם שושלת היוחסין הספציפי fluorophore ביטוי משמשים לעתים קרובות כדי לעקוף את האתגר הזה. הקו הטרנסגניים lck:eGFP שימש ללמוד פיתוח תא T rerio ד , יש גם מנוצל ועד פיתוח מודל T cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). למרות lck:eGFP דגים היה בשימוש נרחב כדי לנתח את T-שושלת היוחסין, הם לא שימשו ללמוד תאי B. לאחרונה גילינו כי הרבה תאים דג זברה B גם להביע lck, אם כי ברמות נמוכות. כתוצאה מכך, lck:eGFP B תאים לבטא גם רמות נמוכות של GFP. על סמך ממצא זה, פיתחנו פרוטוקול לטהר תאים B-השושלת lck:eGFP דג זברה, אשר אנחנו מדווחים כאן. השיטה שלנו מתאר כיצד לנצל את סדרן תא לפעיל על-פלורסנט (FACS) לטהר בתאי B lck:eGFP דגים או שורות קשורים, כגון כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; דגים lck:eGFP . בשורות אלו, בתאי B, במיוחד לא בוגר B תאים, אקספרס GFP ברמות נמוכות אבל לזיהוי, ולאפשר להם להיות מכובד מתאי T, המבטאות GFP מאוד. בתאי B יכול להיות מבודד מח, בלוטת התימוס, הטחול, דם או רקמות אחרות. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטהר את תאי B rerio ד , המאפשר לימודים ממוקד בנושאים כמו התפתחות תא B ו- B לימפוציטים גידולים ממאירים.
מבוא
דג זברה מציעים תכונות רב עוצמה, כגון manipulability גנטי, פוריות גבוהה, המוגבהת אופטי והתפתחות מהירה המאפשרים לימוד פיתוח חוליות שימוש בגישות גנטיות. יתרונות אלו, יחד עם התכונות המשותפות של hematopoiesis teleost, יונקים, להפוך rerio ד אידיאלי עבור ניתוחים ויוו של הפונקציה lymphopoiesis, לימפוציטים, מהמראה שלהם המוקדם בהזחלים לאורך הבגרות. פיתוח דם דג זברה מתבססת שנשמרת היטב תהליכים גנטיים משותפים עם יונקים, אלה להרחיב מערכת החיסון מסתגלת. בנוסף, מולקולרית מנגנונים המסדירים פיתוח הלימפה נשמרים להפליא בין דג זברה ויונקים1.
במהלך העשורים האחרונים 2, הטרנסגניים rerio ד קווים שושלות דם ספציפית את התווית,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בכל ההליכים הכרוכים דג זברה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במרכז למדעי הבריאות באוניברסיטה של אוקלהומה.
1. בידוד שאינם ממאירים B ו- T לימפוציטים מ הטרנסגניים lck:eGFP דגים
- עזים ומתנגד הדג באמצעות tricaine 0.02% (MS-222) במים מערכת דגים.
- בחן דגים בן 2-6 חודש עבור פלורסנט thymi, אשר ממוקמים על ההיבט dorsomedial של חלל branchial של דג זברה, אחרים teleosts14. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence (470/40 עירור גל ו מסנן פליטה 525/50) כדי לזהות GFP.
- להכין מראש 50 מ של עיקור מסנן 1 x רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) המכיל 1% עוברית שור ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השתמשנו cytometry זרימה כדי לנתח, FACS לבודד GFPהלאו ותאים GFPשלום התימוס, מח הכליות, הטחול של דג זברה מהונדס lck:eGFP . ניתוח של דגים בת 3 חודשים גילה שהתימוס הכיל בעיקר לימפוציטים GFP+ . GFP+ תאים במידה רבה הוגבלו לשער הלימפה שתואר קודם לכן על-ידי Traver et al.17. שתי האוכלוסיות GFP+ ברורים GFPהלאו, GFPשלום,יכול להיות שנצפו התימוס. GFPשלום לימפוציטים ייצג א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתח ואנו מספקים פרוטוקול כדי לבודד תאים B lck:eGFP דג זברה מהונדס, הוספת זה דגמים אחרים rerio ד עם B-השושלת תוויות3,4. באופן מפתיע למדי, הזיהוי של ה-GFPהלאו B תאים בשורה זו הלכה מעיניהם מאז התיאור שלו בשנת 2004. באופן כללי, lck נחשבת תא T ספציפי6, אך מחקרים אחרונים מצאו ביטוי בלתי צפוי lck על ידי הרוצח הטבעי, מיאלואידית תאים, כמו גם כמו בתאי B כמוצג כאן18,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
תודות
ברצוננו להודות מייגן מאלון-פרז לטיפול דג זברה, OUHSC הליבה cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים יונדאי תקווה על גלגלים, אוקלהומה המרכז לקידום של המדע והטכנולוגיה (HRP-067), פרס הפרויקט טייס NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF מחזיק את תיאורטית יבשה & תלמה גיילורד הקתדרה של ילדים המטולוגיה-אונקולוגית לילדים החולים קרן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 35 ומיקרו; m רשת | Sefar מסנן טכנולוגיה | 7050-1220-000-13 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור עגול תחתון עם מכסה מסננת תאים | קורנינג מותג | 352235 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 מיקרוסקופ פלורסנט | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | ניקון | ||
| אתיל 3-אמינובנזואט מתאנססולפונט; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| סרום בקר עוברי | תרמו פישר | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | ראה Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | גרסה 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| הומוגנייזרים של מיקרו-צינורות עליים | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 64788-20 | |
| העברת פלסטיק pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | ראה Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
מקורות
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Jo....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
