רכישת נתונים וניתוח בברטומטריה תגובה מעורר בעכברים

היבט מרכזי של פיזיולוגיה המוח היא יכולתה לעבד מידע סביבתי וכתוצאה מכך פלט פנימי או חיצוני שונים, כגון למידה, זיכרון, תגובות רגשיות, או תגובות מוטורי. גישות נסיוניות ואבחון שונות ניתן להשתמש כדי לאפיין את התגובה האלקטרולוגית של סוגי תאים עצביים בודדים או אשכולות/הרכבים של נוירונים בתוך מעגלים עצביים הקשורים גירוי. טכניקות האלקטרופיזיולוגיות הללו מכסות מימדים שונים של מידות על המיקרו-, מזו-ו-macroscale¹. רמת מיקרוסקאלה כוללת מתח ומלחציים הנוכחית גישות במצבים שונים מלחציים טלאי באמצעות, למשל, תרבותי או בחריפות מאוד נוירונים¹. אלה בטכניקות מחוץ לגופית לאפשר אפיון של ישויות נוכחיות הנוכחי ואפנון תרופתי שלהם^2,3. חיסרון חיוני, עם זאת, הוא חוסר מידע מערכתי לגבי אינטגרציה מיקרו המעגלים מידע ועיבוד. ליקוי זה הוא להתגבר חלקית על ידי טכניקות מבחנה של מזוקנה, כגון מערכים רב אלקטרודה אשר מאפשרים הקלטות בו multielectrode בו לא רק הנוירונים בתרבית, אלא גם בפרוסות מוח חריפה^{4, 5}. בעוד מיקרופרטירים ניתן לשמור בפרוסות המוח במידה מסוימת (למשל, בהיפוקמפוס), התקשרויות לטווח ארוך בדרך כלל אבדו⁶. בסופו של דבר, כדי לחקור את הקשרים הפונקציונליים בתוך מכלולים עצביים, מערכתי בטכניקות vivo electroפיסיולוגיים על סולם המקרו הם השיטה של בחירה⁷. גישות אלה כוללות, בין היתר, משטח (אפידורל) ועמוק (גרם) הקלטות EEG אשר מתבצעות בשני בני אדם ודגמי בעלי חיים¹. אותות EEG מבוססים בעיקר על הקלט הסינפטיות מסונכרן על הנוירונים שיניים בשכבות בקליפת המוח שונים שיכולים להיות מעכבות או מרגש בקרן, למרות הדומיננטיות הכללית של קלט מרגש⁸. לאחר סינכרון, מרגש הפוטנציאל המבוסס על משמרות מבוסס על שדות חשמל החילוץ מסוכם ליצור אות של כוח מספיק כדי להיות מוקלט על הקרקפת באמצעות אלקטרודות משטח. בעיקר, הקלטה הקרקפת לזיהוי מן האלקטרודה היחידה דורשת את הפעילות של 10000 של הנוירונים באמצע הפירמידה ואת הארמנטריום מורכבים של התקנים טכניים וכלי עיבוד, כולל מגבר, מסנן תהליכים (המסנן נמוכה לעבור, מסנן מעבר גבוה, מסנן חריץ) ואלקטרודות עם מאפייני מנצח ספציפיים.

ברוב המינים בעלי החיים הניסיוניים (כלומר, עכברים וחולדות), הגישה האנושית המבוססת על EEG הקרקפת היא טכנית לא ישים, כמו האות שנוצר על ידי קליפת בסיס הוא חלש מדי בשל מספר מוגבל של נוירונים מסונכרנים הפירמידה^{9, 10,11}. ב מכרסמים, פני השטח (קרקפת) אלקטרודות או אלקטרודות תת עורי הם מזוהמים באופן חמור על ידי אלקטרוג ' ובאופן מיידי הממצאים אלקטרו yoגראם שעושים הקלטות EEG באיכות גבוהה בלתי אפשרי^{9,11, 12}. כאשר משתמשים בעכברים הנעים ללא הגבלה בחופשיות וחולדות, ולכן חובה להקליט ישירות מקליפת המוח באמצעות אלקטרודות אפידורל או ממבני הגרם העמוקים כדי להבטיח את החיבור הפיזי הישיר של קצה החישה של אלקטרודה מובילה/מושתל לאשכולות האותות העצביים של תאים. אלה גישות EEG יכול להתבצע או מרסנת קשורה מערכת ההתקנה או באמצעות שימוש בלתי מרסן שולחן רדיו EEG הגישה לגשת^9,10,11. שתי הטכניקות יש את היתרונות והחסרונות שלהם והוא יכול להיות גישה רבת ערך באפיון האיכותי והכמותי של התפיסה רגישות/תפיסה של פעילות, מעגלי קצב, אדריכלות שינה, פעילות מנדנוד, וסנכרון, כולל ניתוח תדר זמן, ניתוח מקור, וכו '^{9,10,13,14,15,16,17}.

הואיל ומערכות קשורות וטלמטריה רדיו מאפשרות הקלטות EEG תחת תנאי הרחקה/הרחקה או שאינם מרסמו, בהתאמה, תנאים ניסיוניים קשורים אינם תואמים את הדרישות עבור הקלטות ABR. הביקוש האחרון לגירויים אקוסטיים המוגדרים שוב ושוב לאורך זמן עם עמדות מוגדרות של רמקול ובעלי חיים ניסיוני ורמות לחץ קול מבוקרת (SPLs). זה יכול להיות מושגת על ידי קיבעון הראש תחת תנאי מרסנת או בעקבות הרדמה^18,19. כדי להקטין את הלחץ הניסיוני, בעלי חיים מורדם בדרך כלל במהלך הניסויים abr, אבל יש לראות כי הרדמה יכול להפריע עם¹⁹ר'^,20.

כמאפיין כללי, EEG הוא בנוי על תדרים שונים בטווח מתח של 50-100 μV. תדרי רקע והגברה מאוד תלויים במצב הפיזיולוגי של החיה הניסיונית. במצב ער, ביתא (β) ו גמא (γ) תדרים עם משרעת תחתונה לשלוט מראש. כאשר בעלי חיים הופכים מנומנם או נרדם, אלפא (α), תטא (θ), ו דלתא (δ) תדרים להתעורר, מציג הגביר EEG משרעת²¹. פעם ערוץ חושי (למשל, מסלול אקוסטי) מגורה, הפצת מידע מתווכת באמצעות פעילות עצבית דרך מערכת העצבים ההיקפית והמרכזית. גירוי חושי כזה (למשל, אקוסטי) מעורר תגובות EPs או מעורר תגובה. בעיקר, פוטנציאל הקשורות לאירועים (ERPs) הם הרבה יותר נמוך משרעת מ EEG (כלומר, כמה מיקרוולטים בלבד). כך, כל מערכת ERP בודדת המבוססת על גירוי אחד יאבדו נגד השרעת הגבוהה יותר EEG הרקע. לכן, הקלטה של מערכת ERP דורשת את היישום החוזר של גירויים זהים (למשל, קליקים בהקלטות ABR) והבאים בממוצע כדי לחסל כל פעילות רקע EEG וחפצים. אם הקלטות ABR מתבצעת באמצעות בעלי חיים מורדם, קל להשתמש באלקטרודות תת עורי כאן.

בעיקר, AEPs כוללים EPs השהיה קצר, אשר בדרך כלל קשורים ABRs או הברה, ועוד, מאוחר יותר פוטנציאל התקדמות כגון השהיה EPs (תגובות השהיה [MLR]) ו-EPs השהיה ארוך²². וחשוב מכך, ההפרעה בעיבוד המידע של מידע השמיעה היא לעתים קרובות תכונה מרכזית של מחלות נוירופסיכיאטריות (מחלות מדיאואזיות, סכיזופרניה וכדומה) ומשויכת ל-aep שינויים^{23,24 ,25}. בעוד חקירות התנהגותיות מסוגלים רק חשיפת ליקוי פונקציונלי, מחקרים aep לאפשר ניתוח זמן מדויק של תפקוד שמיעתי הקשורים מבנים נוירואנטומיים ספציפיים²⁶.

ABRs כמו מוקדם, השהיה קצר באופן מהיר מזוהים בדרך כלל על ידי בינוני עד high-אינטנסיבי יישום לחץ, וייתכנו עד שבע פסגות ABRS (W_I-w_VII). הגלים החשובים ביותר (W_I-w_V) קשורים המבנים הנוירואנטומיים הבאים: W_I לעצב השמיעה (החלק המרוחק, בתוך האוזן הפנימית); W_II אל הגרעין של שבלול (החלק האבובי של עצב השמיעה, הפסקת גזע המוח); W_III לקומפלקס האוליארי העליון (SOC); W_IV אל הלגול הצדדי (LL); W_V כדי להפסיק את הלמנוס לרוחב (LL) בתוך הקולקולוס הנחותים (IC) על הצד השני צלעות²⁷ (איור משלים 1). יצוין כי W_II-w_V צפויים להיות יותר ממבנה אנטומי אחד של מסלול השמיעה העולה לתרום להם. בעיקר, הקורלציה המדויקת של הפסגות והמבנים הבסיסיים של דרכי השמיעה עדיין לא הובהר במלואו.

ב audiology, ניתן להשתמש ב-abrs ככלי הקרנה ואבחון עבור ניטור כירורגי^28,29. זה החשוב ביותר עבור זיהוי של הדיסקוזיס, הhyp, ו אלזיס (למשל, באובדן שמיעה הקשורות לגיל, אובדן רעש המושרה שמיעה, אובדן שמיעה מטבולית ומולדים, ו הפסד אסימטרי שמיעה ושמיעה כתוצאה מומים או מומים, פציעות ונצורות. ABRs גם רלוונטיים כמבחן הקרנה עבור ילדים לקויי היפראקטיבי, מבחינה אינטלקטואלית או עבור ילדים אחרים שלא יוכלו להגיב לaudiometry קונבנציונאלי (למשל, במחלות נוירולוגיות/פסיכיאטריות כגון ADHD, MS, אוטיזם וכו '^{29 , 30}) ו בפיתוח והתאמה כירורגית של שתלים שבלול²⁸. בסופו של דבר, abrs יכול לספק תובנה רבת ערך לתוך תופעות לוואי פוטנציאליות של נוירופסיכופרמצבטיקה, כגון antiepileptics^31,32.

הערך של התרגום של ידע נוירולוגי המתקבל מדגמי עכבר תרופתי או טרנסגניים לבני אדם כבר הפגינו הגדרות רבות, במיוחד ברמה של ERPs בתבניות השמיעה של עכברים וחולדות^{33, 34,35}. תובנה חדשה שונה AEPs מוקדם ושינויים משויכים בעיבוד מידע שמיעתי בעכברים וחולדות יכול ובכך להיות מתורגם לבני אדם והוא בחשיבות מרכזית אפיון והקלדה של שמיעתי, נוירולוגי, ו מחלות נוירופסיכיאטריות בעתיד. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כמה ABRs ניתן להקליט וניתח בהצלחה בעכברים עבור מדעי בסיסי, רעילות, ואת המטרות הפרמקולוגית.

כל הליכי החיות בוצעו על פי ההנחיות של המועצה הגרמנית לטיפול בבעלי חיים וכל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המקומית והמוסד הלאומי לטיפול בבעלי חיים (Landesamt ר ' נאטור, האומה, ורראוצ'רשיץ, מדינה משרד צפון ריין-וסטפאליה, המחלקה לטבע, סביבה וצרכנות (LANUV NRW], גרמניה). המחברים מאשרים עוד כי כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (בפרסומים מס ' 80-23) מתוקן 1996 או בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) 1986 והנחיות משויכות, או הנחיית מועצת הקהילות האירופית ב -24 בנובמבר, 1986 (86/609/EEC) ובספטמבר 22, 2010 (2010/63/האיחוד האירופי). מאמץ ספציפי נעשה כדי למזער את מספר בעלי החיים ששימשו וסבלו (3R [החלפה, הפחתה, ועידון] האסטרטגיה).

1. בעלי חיים ניסיוניים

1. מבחר בעלי חיים ניסיוניים ומינים
   1. לבצע מחקרים ABR בתוך מכרסמים/דגמי מכרסמים (כלומר עכברים או חולדות) הממלאות את הדרישות של הומולוגיה, איזומורפיזם, וחיזוי הקשורות למחלה אנושית ספציפית. מדובר בחשיבות מסוימת במונחים של היבטים בסיסיים במדעי המוח.
      הערה: שקול כי זמין עכבר שונים וזנים עכברוש יכול להראות הבדלים פיסיולוגיים הבסיסי מאפייני פתופסולוגי^36,37,38. אלה העכבר/שורה החולדה הקשורים specificities צריך להילקח בחשבון בתכנון ניסיוני.
   2. לשקול את העכבר-והעכברוש-מאמץ שינויים ספציפיים בפיזיולוגיה ופרמקולוגיה שעלולה להיות השפעה על ניסויים אלקטרופיסיולוגיים (למשל שינוי רגישויות הרדמה, הקצב מעגליות, [אודיוגניים] תפיסת הרגישות, גיל, ורקע גנטי)^39,40,41,42.
   3. כלול את הריבוד הספציפיות למגדר בעיצוב הלמידה. זכור כי המחזור האסטרוס יכול להשפיע באופן חמור על הרגישות הרדמה, מרכזי הקצב, תלות אחראי, ואת הפעילות תפיסה (ויהיו שמיעתי) ו חושי (שמיעתי) עיבוד מידע^{43,44 , 45}. לפיכך, בצע ניתוח ספציפי למין.
      הערה: הגבל לעכברים זכרים אם הקיבולת הפיננסית והניסיונית מוגבלת, אם כי פרמטרים נוירולוגיים שונים מנשים המרכיבה על אופניים בדרך כלל לא נראה להציג השתנות מוגברת בהשוואה לזכרים⁴⁶.
2. דיור וטיפול בבעלי חיים
   1. עכברי בית או עכברושים בכלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי בתוך מתקן בעל חיים.
   2. הזיזו את החיות הנסיוניות ממתקן החי כדי לאוורר ארונות הממוקמים בחדרי מעבדה מיוחדים המיועדים להרדמה, מיקום אלקטרודות ABR והקלטות ABR.
   3. ודא כי בעלי החיים שוכנו בארון מאוורר תחת תנאים סביבתיים סטנדרטיים (כלומר, עם טמפרטורה של 21 ± 2 ° צ', 50%-60% לחות יחסית, ו קונבנציונאלי 12/12 h מחזור אור/כהה). הרשו לבעלי החיים להסתגל ולהתאים לתבנית מעגליות זו לפחות 14 יום לפני הניסויים הבאים.
   4. השתמש בכלובים פוליקרבונט ברור סוג II (26.7 ס מ x 20.7 ס"מ x 14.0 ס"מ, שטח של 410 ס"מ²) עבור עכברים בתים בקבוצות של 3-4 ולהשתמש בכלובים פוליקרבונט ברור סוג III (42.5 ס מ x 26.6 ס"מ x 18.5 ס"מ, שטח של 800 ס"מ²) עבור חולדות. ספק גישה לפרסומות למים לשתייה וכדורי מזון סטנדרטיים.
   5. הימנע הפרדה/בידוד של בעלי חיים ניסיוניים לפני ואחרי הקלטות ABR כמו בידוד יכול להפעיל לחץ חמור המשפיעים על תוצאות הניסוי. כך, למקם את החיות בחזרה לכלוב הבית שלהם לאחר הרדמה, ABR מיקום אלקטרודה, ו ABR הקלטות.
   6. אין להחיל תנאי דיור פתוחים כפי שהם כפופים למגוון של חסרונות ניסיוניים, בעיקר בלימודי שמיעה. ארונות מאוורר, במקום זאת, להגן מפני מתח אקוסטי לפני ובין הליכים שמיעתי ניסיוני אשר יכול אחרת להוביל לאיבוד שמיעה (g., המושרה רעש אובדן שמיעה) ובכך להשפיע על תוצאות.
   7. לנצל את העכבר-ו-עכברוש ספציפי הסניטריים, הרדמה, וציוד טכני כך לא עכברים ולא חולדות יכול לחוש את הנוכחות של השני כמו תפיסה חושית הדדית של מין מתחרה עשוי להצמיח ואצת לבול גורמים במחקרים.

2. הרדמה לעכבר

1. לבצע הרדמה באמצעות הרדמה להזרקה. הכינו שילוב של קטמין הידרוכלוריד (מינון מכרסמים: 100 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine הידרוכלוריד (מינון מכרסמים: 10 מ"ג/ק"ג) ב 0.9% הפתרון או הצלצול של החיה ולהזריק intraperitoneally בעלי החיים מבוסס על משקל הגוף שלה.
   הערה: הרדמה באמצעות isofלינה אינו מומלץ כמו הליך ABR בדרך כלל דורש תא החליש קול וכלוב פאראדיי, וכתוצאה מכך מגבלות מרחבית בתוך הגדרת ההקלטה. למרות מפעל הרדמה רבים על מערכת NMDA וכמובן להשפיע על תוצאות ההקלטה ABR, גישה מרסנת ללא הרדמה בהקלטות ABR אינו מומלץ כמו נוהלי הרחקה תחת התודעה לגרום למתח דרמטי לבעל החיים, עם היווצרות חפץ חמור לאחר מכן ב-ABRs.
2. להתבונן בעלי החיים בזהירות לעומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטה זנב, צביטה ברגל, וניטור קצב הנשימה (עכברים: 150-220 נשימות/דקות). בדוק אם יש צורך בנשימה אפשרי ולנטרל.
   הערה: קווי עכבר שונים או מודלים של עכבר תרופתי יכולים להפגין רגישויות שונות להרדמה. אותו הדבר נכון גם לגבי דגמי העכבר המוטאנטים. צנרור לא מחייב בהגדרה ניסיונית זו ולא מומלץ. כמו צנרור מגביר את הסיכון של טראומה לקנה הנשימה וזיהום, היתרון/הסיכון של צנרור האנדוקנה במהלך ההליך ABR הוא שלילי.

3. היבטים כלליים של הסדרי הרדמה ומכשור

1. החלת חמימות משלימה במהלך ואחרי הקלטות ABR באמצעות שמיכת הסקה הביתה לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה הליבה. שמרו על השני ב-36.5-38.0 ° צ' (98.6-100.4 ° פ').
   הערה: היפותרמיה היא גורם סיכון במכרסמים קטנים בשל היחס הגבוה שלהם של משטח הגוף (הגוף משטח העכבר = 10.5 x (משקל g)^2/3; גוף החולדה משטח = 10.5 x (משקל g)^2/3) לנפח הגוף.
2. כסו את עיני בעל החיים עם משחה מלאכותית מבוססת על נפט או 5% דקפאננול במהלך תהליך ההקלטה ABR כולו כדי להימנע מייבוש הקרנית. המשך בהליך זה עד שהרפלקס המהבהב ישוחזר במלואו.
3. לחטא את המכשירים הניסיוניים (לראות את הטבלה של חומרים) באמצעות חיטוי או חיטוי.
   הערה: מומלץ לעשות שימוש בחיטוי מכשיר כירורגי המבוסס על חום עם חרוזי זכוכית.
4. למיקום מדויק של האלקטרודה ABR, להשתמש במיקרוסקופ כירורגי להגדלה כירורגית עם מקור אור קר לתאורה אינטנסיבית באמצעות גמיש או תמיכה עצמית מדריכים מטלטלין אור.
5. השתמש במעיל מעבדה נקי, מסכת פנים, כיסוי ראש וכפפות סטריליות במהלך טיפול בבעלי חיים ניסיוניים וניסויים.
   הערה: כלים ואספקה אופטימליים יכולים להשתנות בין מעבדות ולעמוד בתקנים ספציפיים למעבדה ומוסדיים.

4. הקלטות ABR

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על מערכת ABR זמינה מסחרית להקלטות שמיעה ושמיעה. חשוב מכך, השאלה המדעית להיות ממוען חייב לעמוד במפרט הטכני של מערכת ABR בשימוש. ניתוח ABR של הקלטות שמיעה, למשל, ניתן להשתמש כדי לחקור את הקידוד לרוחב של גירויים שמיעתי במסלול השמיעה וללמוד סימטריה לרוחב היקפי מחלות נוירופסיכיאטריות.

1. בצע כיול של תדרי גירוי בכל יום של הקלטה על-ידי הצבת מיקרופון המחובר למגבר מקדם ולמערכת העיבוד (עיין בטבלת החומרים) בתוך התא החליש את הצליל במיקום הנכון התמצאות שבה האוזן הניסיונית תהיה ממוקמת.
   1. הפעל את מגבר הקדם המחובר למיקרופון לפחות 5 דקות לפני הכיול כדי לאפשר את השפה המועטה של המערכת.
   2. . תדליק את האולוסקופ
   3. הצב את המיקרופון המחובר למגבר מקדים בתוך התא המחליש של הצליל כדי לחקות את האוזן הניסיונית.
   4. פתח את תוכנת העיבוד והרכישה הזמינה מסחרית (עיין בטבלת החומרים).
   5. בחר בקובץ הכיול Cal200K בתוך התוכנה כדי להפעיל את מצב קביעת התצורה של הכיול ובחר פרמטרים בהתאם לתנאים הניסיוניים.
   6. השתמש במערכת המעבד כדי לבצע את פרוצדורת הכיול. ודא כי המפרט הטכני של המיקרופון והרמקול במונחים של מגבלות SPL, טווח תדרים והרמוניה של הפצה.
   7. בחר והפעל את פרוטוקול הגירוי המוגדר מראש ללחיצה.
   8. הפעלת SPL בלחיצה אחת (רצוי, SPL המרבי) כדי לוודא את הספקטרום של גירויים קול כפי שנותחו על ידי מקוון המרה פורייה מהירה (FFT) של מתאים האולוסקופ מתאימה לדרישות (טווח אנרגיה משמעותי).
   9. בחר והפעל את פרוטוקול הגירוי המוגדר מראש של פרץ הטון בטווח הריבית (לדוגמה, 1-42 kHz).
   10. אשר את ספקטרום התדרים של הגירוי האקוסטי המוקלט באמצעות מFFT ומקוונת.
       הערה: הכיול היומי של תדרי המערכת והגירוי הוא הכרחי כדי להבטיח שתדרי הגירוי ו-SPLs נמצאים בטווח העבודה המקובל.
2. הניחו את העכבר המוקטן בתוך תא מחליש קול מרופד בקצף אקוסטי.
   הערה: החדרון כולו צריך להיות מכוסה על ידי כלוב פאראדיי (מתכת מתוצרת אישית או מסחרית) כדי להגן על הקלטות ABR מהפרעות חשמליות חיצוניות ולהגן עליהם מפני רעש.
3. עבור ההקלטה של המוח השמיעתי שמיעה פוטנציאל השמיעה מעורר, הכנס העורי נירוסטה אלקטרודות בקודקוד, צירית של pinnae (חיובי [+] אלקטרודה) ו-ונטרופלרוחב של פינה ימין או שמאל (שלילי [-] אלקטרודה) בהתאם ל אוזן למדידה. להקלטות הבינשמיעה, הציבו את האלקטרודות השליליות בפינה הימנית והשמאלית. הצב את האלקטרודה הקרקעית בירך החיה (איור משלים 1).
   1. לפני ההוספה, טופס צורת וו בקצה של האלקטרודה פלדת אל-חלד כך הקיבעון העורי של האלקטרודות מובטחת⁴⁷.
4. בצע מדידות עכבה של כל האלקטרודות לפני כל הקלטה כדי לוודא מיצוב האלקטרודה הנכונה/מוליכות. השתמש בלחצן בדיקת עכבה על הבמה ארבעה ערוצים כדי לוודא כל רמת העכבה אלקטרודה.
   הערה: העכבה צריכה להיות פחות מ 5 kΩ.
5. הקלטת ABRs תחת תנאי שדה חופשי באמצעות רמקול אחד (רוחב פס בתדר, למשל, ב-1-65 kHz) ממוקם 10 ס מ מול הרוסטרום של החיות (הקצה המוביל של הרמקול בניצב אל ציר השמיעה הפנימי של העכבר). ודא שהמיקום של העכבר הראשי/אוזני העכבר הוא זה של מיקרופון הכיול, בהתאם למרחק הספציפי שנבחר בין הרמקול למיקרופון במהלך הכיול.
   הערה: במקום תנאי שדה חופשי, ניתן גם להשתמש בצינורות האוזן. עם זאת, אמצעי זהירות ובדיקות מיוחדים נחוצים לקביעת SPLs בהגדרות אלה.
6. תכנת את פרוטוקולי הגירוי של הקליקים והטון באמצעות תוכנה מתוכנתת או זמינה מסחרית (עיין בטבלת החומרים). הפרמטרים השונים התמריצים המפורטים להלן צריכים להתווסף לממשק המשתמש הגרפי הקשור.
   1. התחל עם התצורה של ישות הגירוי לחץ (כלומר, המשך הגירוי של 100 μs עם קוטביות מתחלפים [מעבר בין עיבוי לבין ואקום) לבין אנרגיה משמעותית מוגדר. השתמש בישות גירוי זו כדי לנתח ולקבוע ללחוץ על סף, סימטריה ABR של האוזן השמאלית והימנית, ABR W (I-IV) המוני, ו W (I-IV) השהיות מאוחר יותר.
   2. הפעל את התוכנה והשתמש בחלון קביעת התצורה כדי להוסיף את הפרמטרים של הגירוי בלחיצה. לחץ על ביצוע כדי להפעיל את הפרוטוקול.
   3. המשך עם התצורה של הישות הגירוי השני, שהוא פרץ 4.5 ms (sinusoidal הדופק ארעי) של קוטביות לסירוגין עם העלייה המעטפה Hann וזמני הסתיו של 1.5 ms כל אחד (שער/משך זמן המשך). שקול את משך פרץ הטון המינימלי של 3 אלפיות הזאת, במיוחד עבור התפרצויות צליל בתדר נמוך. השתמש בגירוי זה כדי לנתח ולזהות ספי שמיעה ספציפיים לתדר בכל גנוסוגים.
   4. בדומה צעד 4.6.2, השתמש בחלון קביעת התצורה כדי להוסיף הטון פרץ הגירוי פרמטרים ולחץ על הפעל כדי להפעיל את הפרוטוקול (כפי שצוין על-ידי היצרן⁴⁸).
   5. עבור מחקרים פרץ טון, לתכנת את טווח התדר המתאים להיבדק בהתאם לשאלה המדעית (למשל, מ 1-42 kHz ב 6 kHz שלבים). ודא שטווחי התדרים החלים על היכולות הטכניות של הרמקול (במקרה זה, רמקול מגנטי רב-שכבתי עם רוחב פס בתדר של 1-65 kHz עבור תנאים בחינם או בשדה סגור).
   6. בממוצע, הגדר את מספר הגירויים האקוסטיים (לחיצות או צלילים), לדוגמה, ב-300x עם קצב של 20 Hz.
   7. להגדיל את SPLs ב 5 dB שלבים עבור קליקים ו 10 שלבים dB עבור התפרצויות טון, החל 0 dB עד 90 dB (הגדלת מצב SPLS).
      הערה: גם מצבי SPL הגדלה ופוחתת מתוארים בספרות. גודל השלב SPL עשוי להיות מותאם עקב שאלות מדעיות.
7. לקבוע את משך רכישת נתונים ABR של 25 ms, החל בתקופה 5 ms הבסיסית לפני התפרצות אקוסטית בודדים (pre-ABR בסיס) ו עולה על 10 ms ABR בסעיף על ידי אחרת 10 ms בסיס (לאחר ABR בסיס) (איור משלימים 1 ).
8. החל קצב דגימה מתאים לרכישת נתוני ABR (לדוגמה, 24.4 kHz) ומסנן bandpass (מעבר גבוה: 300 Hz, מעבר נמוך: 5 kHz) באמצעות מסנן באטרורת 6-מוט. הפעל את מסנן החריץ במידת הצורך.
   הערה: שיעור דגימה ומאפייני מסנן עשויים להיות מותאמים עקב דרישות נסיוניות.
9. העבר את האותות הביוחשמליים התוצאות שנרשמו מהאלקטרודות התת-עורי לשלב הראש ועוד קדימה למגבר מקדים עם הגברה מתאימה (למשל, 20-קיפול).
10. השתמש בתוכנת עיבוד מערכת ABR ספציפית כדי לתאם בקרת רמקולים ורכישת ABR, עיבוד, חישוב ממוצע וניהול נתונים.
11. נסה לבצע את הפרוטוקולים ABR כולו (ללחוץ-והטון פרץ-שמיעה מעורר סף, משרעת שיא, וניתוח השהיה שיא, וכו ') בתוך כ 45 דקות. זה מתאים לזמן של הרדמה עמוקה באמצעות 100/10 mg קטמין/xylazine intraperitoneally.
12. ודא כי הכיול, התיכנות/התאמות עבור הצגת גירוי ורכישה, הגדרות מסנן, וכו ' פועלים כמצופה לפני שההרדמה של בעל החיים וביצוע ההקלטה בפועל.

5. ניתוח ABR

1. לחץ-והטון פרץ-מעורר שמיעה ABR ניתוח הסף
   1. לבצע זיהוי הסף האוטומטי על בסיס פרסומים מוקדמים כדי למנוע חוסר עקביות פוטנציאלי בקביעת הסף abr על ידי בדיקה חזותית/הערכה^49,50,51,52.
   2. הגדר שלושה חלונות זמן ברורים (TWs) כדי לחשב את יחס אות לרעש (SNR): TW₁ (0-5 ms), tw₂ (5-15 MS) ו-tw₃ (15-25 ms) (איור משלים 1).
   3. לחשב את סטיית תקן הרעש של הבסיס בתוך שני TWs שונים (כלומר, TW₁ ו tw₃) שם aeps לא נצפו. ניתן לבצע חישוב זה באמצעות תוכנה מתוכנתת.
   4. חישוב עבור כל מדידה SPL בתוך רשומת ABR הגדרת הן ממוצע ואת סטיית התקן עבור נתונים במאגר של TW₁ ו-tw₃.
   5. אפס את כל דגימות ההקלטה בנפרד לפי הממוצע המחושב התואם כדי להסיר היסט DC כלשהו.
   6. עבור קביעת הסף שמיעה, לזהות את SPL הנמוך ביותר (dB) שבו לפחות משרעת גל אחד ערך (W_I-w_IV) בחלון זמן התגובה abr (TW₂) חרג מהקיפול של סטיית התקן שחושבה קודם לכן.
      הערה: אם לא התגלתה גל ABR לצורך ניתוח סף לחיצה ותדירות במהלך SPL המרבי, רמת הסף הנומינלית של 100dB מוקצית לאוזן.
2. משרעת גל ABR וניתוח השהיית גל
   1. התנהלות גישה מבוססת אדוה באמצעות כובע מקסיקני אדוה כדי לקבוע את ההסדר הזמני הרציף של גלי (p) גלים (פסגות) כמו גם גלים שליליים (n) באמצעות ברירת המחדל אדוה על-ידי המרה אדוה רציפה (CWT) מבוסס אלגוריתם התאמת תבנית⁵² (איור משלים 1).
      1. מבחינה מתמטית, CWT מיוצג כדלקמן⁵³.
         
         כאן, s (t) הוא האות, הוא קנה המידה, b הוא התרגום, ענבל(t) היא אדוה האם, ענבל_{a, b}(t) הוא שינוי קנה מידה ומתורגם, ו C הוא מטריצה 2d של מקדמי אדוה.
   2. בתחילה, השתמש במדידה 55-dB של כל לרוץ ABR כדי לזהות את הפרמטרים בקנה מידה הטוב ביותר עבור כל גל להיות מועבר CWT, אשר התוצאות בשלושה כיתות: קשקשים 0.5-4 עבור כל n-גלים, 0.5-6 עבור כל p-גלים, ו 0.5-12 עבור W_IV כפי שהוא הרחב נופף בתוך הדגימות
      הערה: 55 dB SPL נבחר כמו גלים הם בדרך כלל בולטים כאן והוא יכול להיות מזוהה באופן אמין.
   3. להוכיח את כל השיעורים כדי לזהות באופן אמין את המיקום הנכון רתים של w_I-W_IV בתוך כל 55 dB מדידות.
   4. כדי לקבוע ABR W_I-W_IV בסדר הזמני מדויק בתוך 55 dB מדידה, p-פסגות ו n-פסגות (בורות) מזוהים ברצף קבוע באמצעות מיקומים יחסיים של פסגות שזוהו בעבר כדי להגביל את חלון הזמן של סריקות העוקבות.
   5. לאחר כל תשעת הפסגות מזוהים ב 55 dB, השתמש בערכים קשורים כנקודות ההתחלה עבור מסגרת החיפוש הזמני עבור מדידות לחץ הקול הסמוך (50 dB ו 60 dB) לפני הזיהוי של פסגות 1-9 חוזר על עצמו.
   6. באופן זה, לקבוע p-ו n-פסגות של כל רמות dB (55-0 dB ו 60-90 dB) במידת האפשר. לאחר p-ו-n-שיא כבר לא מזוהה על ידי ניתוח אדוה, ההסדר הזמני שלה נקבע על ידי חישוב ההיסט הזמני של השיא לכל שיא אחר מזוהה ברמת dB הקודם.
   7. החלת ההיסט הזמני לפסגות לכל p-ו-n-שיא אחר בתוך רמת הדציבל הנוכחית מהווה מקסימום שמונה תנוחות זמן קבועות לפסגות לא מוגדרות בדבר הממוצע נלקח כקירוב הקרוב ביותר.
   8. כדי להעריך את פונקציית הצמיחה משרעת ואת השוואת ההשהיה של כל הגלים (W_I-w_IV), לאפיין את הגברה מקסימלית ומשמעות השהיות של כל אחד p-פסגות בתוך מסגרת הזמן של n-פסגות הקשורים.
   9. לבדוק באופן חזותי את כל התוצאות מבוסס על עצמית מתוכנת אדוה כלי אוטומטי לאחר מכן, ואם יש צורך, להוציא ABR הפרט פועל מתוך הסטטיסטיקה אם הם לא עומדים בקריטריונים הכללה/איכות קפדנית.
      הערה: הן בניתוח אוטומטי והן בבדיקה חזותית של ABRs, מומלץ לגשת כפול עיוור.

6. טיפול שלאחר הניתוח והטיפולים שלאחר-ABR

1. ברציפות לפקח על בעלי החיים עד שהם חזרו התודעה והוא מסוגל לשמור על שכיבה.
2. אין להחזיר בעל חיים שעבר הקלטות ABR לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהחלים לחלוטין.
3. הכנס carprofen (עכבר: 1x 5-10 מ"ג/ק"ג, תת-עורי; עכברוש: 1x 2.5-5.0 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) לטיפול בכאב שלאחר הניתוח.
   הערה: טיפול בכאבים ארוכי טווח אינו נדרש כאלקטרודות הקלטה ABR מוכנסים תת-עורי.
4. בשיתוף פעולה, הזנה של כדורי התחלח על מנת להקל על ספיגת המזון. להתבונן בקפידה מזון (~ 15 g/100 גרם של משקל הגוף/יום; ~ 5 g/24 h) ומים (~ 15 מ"ל/100 גרם של משקל הגוף/יום; ~ 5 מ"ל/24 h) צריכת.
5. עקוב אחר החיות באופן מקרוב להחזרת התנוחות וההתנהגות הנורמליים שלהם.
   הערה: מינהל מערכתי של אנטיביוטיקה כגון enrofloxacin או טרימתאופרים-סולפאמיד אינו מומלץ כאן, כמו הצבת אלקטרודה תת עורי היא של רק באופן פולשני מינימלי. היישום של אנטיביוטיקה צריך להיות מוגבל אלא אם כן סימנים של דלקת מקומית או מוכללת להתרחש.
6. שחזור מעקב אחרי הקלטות ABR על ידי שליטה במשקל הגוף של בעל החיים.

לחץ-והטון פרץ הקלטות ABR מעורר ניתן להשתמש כדי להעריך הבדלים הסף שמיעה, משרעת פונקציה הצמיחה, השוואת השהיה. לחץ-עורר ABRs במצב הגדלת SPL מתוארים באיור 1 עבור פקדים ושני שורות העכבר מוטציה למופת אשר לקויה עבור cav3.2 T-סוג מגודרת מתח ca2 + ערוץ (כלומר, cav3.2+/-ו- ca v3.2 מוטציות Null [Cav3.2-/-]). כפי שמתואר לעיל, חקירה ספציפית מגדר מומלצת בדרך כלל, בשל הבדלים ספציפיים למין בפרמטרים שמיעתי בבני אדם54,55 ועכברים56,57. ABRs כדי ללחוץ על שדה חופשי (0.1 ms) ו פרץ הטון (1 – 42 kHz 6 שלבים kHz, 4.5 ms בסך הכל עם זמן השיפוע 1.5 של מספר אלפיות) גירויים אקוסטיים נרשמו כמתואר בפרוטוקול. שימו לב כי הפוטנציאל הקודקודית-חיובית מותוות כמזמרות כלפי מעלה כפי שמתואר בהקלטות של הקלטות המועלות של הנקבה cav3.2+/+ (איור 1a), Cav3.2+/- (איור 1a ), ו-Cav3.2-/- עכברים (איור 1c). בהגדרה זו, נציג ABRs בנקבות הציע סף שמיעה מוגבר לחץ-העלה והשתנה פונקציה משרעת צמיחה ב-Ca הנקבהv3.2-/- עכברים לעומת Cav3.2+/+ ו-cav 3.2+/- בעלי חיים. הנטייה זהה נצפתה עבור הזכרים אשר הציע מוגבר לחץ-העלה הספי העלייה והגברת המוני הגברה Cav2.3-/- לעומת פקדים ו heterozygous cav3.2+/- עכברים. הטון המופת פרץ-מעורר ABRs מתוארים באיור 2 עבור הנקבה Cav3.2+/+, Cav3.2+/-, ו-cav3.3-/- עכברים (כל החיות היו 20 שבועות של גיל).

כצעד ראשון בניתוח ביצועי שמיעה כלליים, לחץ-עורר ABRs עבור SPLs שונים (0-90 dB) נחקרו באמצעות מערכת זיהוי הסף האוטומטי ABRS המתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול (איור 3). בעלי חיים מנותח היו גיל התאימו כמו הזדקנות יכול להיות השפעה דרמטית על אובדן שמיעה sensorineural58,59. לאחר מכן, שינויים פוטנציאליים רמות סף ABR מעורר על ידי תדרים שונים פרץ הטון (1 – 42 kHz, איור 4) נותחו. בשורות העכבר למופת, Cav2.3+/-ו- cav3.2-/- הציגו לחיצה מוגברת-ו טון הקשורות שמיעה סף לעומת פקדים (כל החיות היו 20 שבועות של גיל).

באמצעות גישה מבוססת אדוה המתואר לעיל, לחץ-העלה משרעת ABR פונקציה הצמיחה ו ABR ניתוח ההשהיה בצורת גל (תאנהUre 5 ו תאנה 4, בהתאמה). האחרון מאפשר תובנה לתוך השפעה בלתי אפשרית הרקתית של הגן של עניין עיבוד מידע שמיעתי בתוך האוזן הפנימית וגזע המוח.

איור 1: לחץ-מעורר בקרות בפקדים ועכברים מוטנטים (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). נציג abrs שהתקבל מ(א) cav3.2+/+, (ב) cav3.2+/-, ו (ג) cav3.2-/- עכברים נקבה בעת לחיצה גירוי במצב spl הגוברת (מ 0 – 90 dB עם 5 שלבים dB SPL). בממוצע, כל ישות גירוי הוחלה 300 פעמים ב-20 Hz. תחילת הגירוי האקוסטי מצוין בקו אדום אנכי. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פרץ הטון-מעורר ABRs בפקדים ועכברים מוטנטים (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). נציג abrs מ (א) cav3.2+/+, (ב) cav3.2+/-, ו (ג) cav3.2-/- עכברים נקבה לאחר מפרצי טון של 1 – 42 khz (6 khz שלבים) ב spl של 80 dB. בממוצע, כל ישות גירוי הוצגה 300 פעמים ב-20 Hz. תחילת הגירוי האקוסטי מצוין בקו אדום אנכי. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: לחץ-מעורר המבוסס על סף שמיעה בפקדים ועכברים מוטנטים (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). לחץ-מעורר השמיעה שמיעה הסף של (א) נקבה (ב) זכר Cav3.2+/+ (נקבה : n = 12; זכר: n = 13), Cav3.2+/- (נקבה: n = 10; זכר: n = 9), ו-Cav3.2-/- עכברים (נקבה: n = 10; זכר: n = 9). נתונים מותווים כממוצע ± SEM. חשיבות סטטיסטית נקבעו באמצעות α-רמה = 0.05 ו-p-ערכים שהוגדרו כ *p < 0.05; * *p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הטון פרץ-העלה מבוסס על סף שמיעה מבוססי בפקדים ועכברים מוטנטים (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz שלבים) פרץ טון-העלה מבוסס על סף שמיעה audiometric מבוססי Cav3.2+/+ (נקבה: n = 12; זכר: n = 12; ▲), Cav3.2+/- (נקבה: n = 10; זכר: n = 8; ■), ו-Cav3.2-/- בעלי חיים (נקבה: n = 10; זכר: n = 9; ○). הנתונים מותווים כממוצע ± SEM. ערכים סטטיסטיים נקבעו באמצעות α-רמה = 0.05 ו-p-ערכי המוגדרים כמו *p < 0.05; * *p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הצמיחה משרעת פונקציה על הקלטות ABR מבוסס לחץ על פקדים ועכברים מוטציה (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). WI– WIV משרעת (ב microvolts) מותווים נגד spl הולך וגדל (בדציבלים) לקבלת ניתוח גל מעורר abr ב Cav3.2+/+ (נקבה: n = 12; זכר: n = 11; קו שחור המייצג את ה עקומת שליטה מתקרבת כולל 95% מרווח ביטחון באפור), Cav3.2+/- (נקבה: n = 8; זכר: n = 7; ■), ו-Cav3.2-/- בעלי חיים (נקבה: n = 7; זכר: n = 9 ; ○). שניהם Cav3.2-/- נקבה ועכברים התערוכה התצוגה התעכבה באופן משמעותי את העלייה משרעת הגידול על פני spls הגוברת עבור (A ו- B) wI, (C ו -D) wII, ו (G ו- H)W IV לעומת Cav3.2+/+ ו-cav3.2+/- עכברים. (E ו- F) עבור WIII, רק Cav3.2-/- עכברים זכר מציג עיכוב משמעותי בצמיחה משרעת על פני spl הגוברת בהשוואה לנקבה Cav3.2-/- בעלי חיים. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. חשיבות סטטיסטית נקבעו באמצעות α-רמה = 0.05 ו-p-ערכים מוגדרים כמו *p < 0.05; * *p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח השהיה על-ידי לחיצה על הקלטות מעורר בפקדים ועכברים מוטנטים (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). השהיות (באלפיות שניה) עבור כל גל ABR (wI– wIV) ב 65 dB Spl מתוארים עבור Cav3.2+/+ (נקבה: n = 12; זכר: n = 11), Cav3.2+/- (נקבה: n = 8; זכר: n = 7), ו-Cav3.2-/- עכברים (נקבה: n = 8; זכר: n = 9). שים לב כי ניתוח השהיה יכול להתבצע גם ברמות תחושה ספציפיות. נתונים מתוארים כממוצע ± SEM. חשיבות סטטיסטית נקבעו באמצעות α-רמה = 0.05 ו-p-ערכים שהוגדרו כ *p < 0.05; * *p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: אדריכלות ABR ומיצוב אלקטרודה. (א) הקלטת הנציג abr ב 65 DB spl. בסיס הבסיס הראשוני (TW1, 5 אלפיות הראשונה) ואחריו גירוי הבדיקה (לחץ או פרץ הטון) ו-TW2 (10 אלפיות התשעים) המכיל את המוח מוקדם מעורר מאוד הפוטנציאל. TW2 ואחריו בסיס אחר (tw3, 10 ms). התקופות הבסיסיות שימשו כדי לחשב את ה-SD של רעש הבסיס. בכל פעם גל ABR בודדים (WI-wIV) משרעת חרג SD של רעש הבסיס ב-4 קיפול, סף השמיעה הושגה. עבור משרעת גל השוואה השהיה, "כובע מקסיקני" מבוסס גישה אדוה בוצע כדי לזהות באופן אוטומטי פסגות שליליות (כחול צהוב קווים פסים) ופסגות חיובי (אדום אפור קווים פסים). צלבים ירוקים מציינים את מירב ההגברה המוחלטת של הגלי ואינם מציגים ערכי מאדוה המבוססים על הגישה. (ב) עבור הקלטות abr, אלקטרודות נירוסטה תת עורי עם טיפ בצורת קרס שימשו. האלקטרודה ההפניה הונחה בירך השמאלית, האלקטרודה החיובית (+) הוצבה בקודקוד (צירית של הפינאה), והאלקטרודה השלילית (-) הוכנס ונטה של הפינה הימנית, בהתאם לשאלה אם הקלטה בעלת שמיעה או שמיעה היתה התבצע. איור זה משתנה מ-Lundt et al.60. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

. למחברים אין מה לגלות