מאמר שיטה

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 באפריל 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מינים אחדים למציצת צוף כנימות עש הם חלק המזיקים יבשתי המזיק ביותר ברחבי העולם בגלל הנזק היבול שהם ממיטים ווירוסים צמח שהם וקטור. למרות מחקרים רבים של הביולוגיה של המינים הללו בסביבות שונות, פרמטר היסטוריית החיים, יחסי מין הצאצא, קיבל תשומת לב מועטה, עדיין חשוב לניבוי המלאכותיות. היחס סקס ראשי (יחס מין בבית ההטלה) של כנימת עש הטבק לא דווחה, אך ניתן למצוא על ידי קביעת שיעור הפריה הביצית של החרק haplodiploid. הטכניקה מערבת את dechorionation של ביצים עם אקונומיקה, סדרה של צעדים קיבוע של היישום של הכתם פלורסנט כללי ה-DNA, דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, מחייב הדי הפלורסנט), כדי לאגד pronuclei נשי. כאן, אנו מציגים את הטכניקה, דוגמה של היישום שלה, כדי לבדוק אם החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, השפיע על היחס המין העיקרי של עש. שיטה זו עשויה לסייע לימודי אוכלוסיה של כנימות עש, או לקבוע אם קיימת הקצאת סקס עם גירויים סביבתיים מסוימים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של הקצאת סקס, או את ההשקעה היחסית בצאצאים זכר ונקבה, הוא אבן יסוד של אקולוגיה התנהגותית1,2,3. בנוסף כוחה לבדיקת דגמי התנהגות מסתגלת, לדעת את האסטרטגיה הקצאת סקס של אורגניזם עשוי לשפר את דגמי שלה המלאכותיות. במינים רבים, הקצאת מין נשלטת על ידי אמהות. כדי לקבוע מין ההקצאה, חשוב לקבוע את היחס סקס ראשי או את הפרופורציה של נקבות בזמנו של ביצה התצהיר. למרות היחס מין אצל הבוגרים עשוי לספק רמזים להקצאת סקס, דיפרנציאלי התפתחותית התמותה בין קטינים זכר ונקבה עשויים בדרך כלל להטות היחס סקס למבוגרים באופן משמעותי. במינים מסוימים של דבוראים, הסדר של חרקים המכיל נמלים, דבורים, צרעות, היחס מין העיקרי נקבע עם מבחני cytogenetic, מכתימה את העוברים כדי להציג את ה-DNA הגנטי. בגלל hymenopterans haplodiploid, ביצה זכר התחלתית הוא הפלואידי ומכיל רק את הנקבה pronucleus (n), בעוד ביצים הנשי התחלתית דיפלואידי ומכילים pronuclei גם זכר וגם נקבה (2n). למרות Aleyrodidae, משפחת האכלה sap של פשפשים (פשפשאים) המכונה כנימות עש, גם haplodiploid, לא חלה assay הוקמה כדי למצוא את יחס מין העיקרי חרקים אלה. זה אולי מפתיע בהתחשב האינטנסיביות של מחקר של כמה מזיקים רציניים הקוסמופוליטית במשפחה הזאת ואת החשיבות של יחסי מין באינטראקציות תחרותי של כנימות עש4,5,6,7 ,-8,-9,-10 ב המלאכותיות בדרך כלל. בחרקים haplodiploid גם יחסי מין הם עכבות סקס נחישות מערכות, מתן אפשרות הפריה סלקטיבית, יחסי מין יציב להשתנות עם הסביבה2. כאן אנו מציגים טכניקה כדי לקבוע את היחס המין העיקרי של המתחם מינים של כנימות עש המכונה באופן קולקטיבי כנימת עש הטבק sweetpotato, עש ב. שם זה מין אחד כוללת מינים יותר מ-28 ברחבי העולם11, כולל חלק12,הכללית מזיקים פולשנית המזיק ביותר13. היישום של טכניקה זו לקביעת מין דפוסי הקצאת עש ב ו Aleyrodidae אחרים יאפשרו חקירה קפדנית יותר של משתנים, כולל טמפרטורה, מצמח פונדקאי, endosymbiotic חיידקים או צמח/כנימת עש הטבק גורמי מחלה, שעשוי להשפיע על יחסי המין העיקרי כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק המלאכותיות.

. אנחנו מודעים כל טכניקות דומות מכתים ביצה עבור עש. הפרוטוקול נוח בהשוואה מכתימים שיטות אחרות ביצי חרקים14 כפי שהוא משמיט שלב קיבוע בין לילה, לפיכך, יכול להסתיים בתוך 3 שעות. דוגמה אחת של יישום, של החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, מזוהה עם הטיית נקבה שלנו שורות מעבדה עש ב 1 קטין במזרח התיכון-אסיה (MEAM1)15,16. בשורה אחת דרב עש הטבק MEAM1 מעבדה ("MAC1," שנאספו מן המרכז החקלאי Maricopa), אנחנו נבדוק אם ריקטסיה-נקבות (R.+) נגוע להפרות יותר ביצים מאשר נקבות (R.–) נגוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ודא כי כל העבודה מתבצעת בטמפרטורת החדר, מאוורר או תחת ברדס fume. כל "טיפות" ב פרוטוקול זה מוגדרים µL 5 – 20, בהתאם ההעדפה של המפעיל.

1. ההגדרה הראשונית

  1. לאפשר כנימות עש הנשי oviposit על עלים נקיים. דוגמאות ההטלה ארנאס כוללים קליפ כלובים או עלים וחתוכים על אגר בצלחת פטרי. תעשה חור coverable קליפ כלוב או צלחת פטרי כיסוי כדי להוסיף ולהסיר את המבוגרים. לחלופין, במהירות לשים כלי קיבול של מבוגרים שנאספו על קרח, ואז להפקיד אותם על העלה. להגביל את משך הזמן בין ההטלה ואת הביצה קיבעון על לא יותר מ- 60 דקות, כדי להבטיח את התצפית של המעבר זרע לתוך pronucleus אבהית הביצים.
    הערה: יכול להיות גדלו ביצים לא יוסרו מן העלה לבגרות כדי להקליט יחסי מין למבוגרים.
  2. לפני או במהלך ההטלה כנימת עש הטבק, הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי לנקות אותו עם סבון ומים, ייבוש זה טוב, ומתיחה אז חתיכה של פרפין הסרט מעל קצה אחד, מוודא שהשטח הסרט פרפין לא לשבור (איור 1).
    הערה: הסרט פרפין הידרופוביות, אטום למחצה, ומאפשר נוזלים לטופס טיפות וביצים כדי להיראות יותר בקלות.

2. Dechorionation

  1. עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של אקונומיקה פתרון (0.83% נתרן תת-כלורי) לסרט פרפין.
    הערה: קל לעקוב אחר ביצים אם רק 2-3 ביצים נמצאות כל טיפה. לחלופין, כדי לנהל מספר ביצים גדולות, לאסוף את הביצים בתוך טיפות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    התראה: אקונומיקה היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול אקונומיקה, לא לנשום.
  2. הסר את הרווחת ובצמח למבוגרים העלה.
  3. מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ כדי לראות בבירור את הביצים לאסוף את הביצים ביחידים ובזהירות עם מכשיר בדיקה דק. כדי לבצע בדיקה, להוסיף סיכה נדל minuten ב 45 מעלות או בזווית של עבודה נוח לתוך טיפ פיפטה מומסת (איור 2).
  4. להעביר את הביצים באקונומיקה או 1 x PBS. אם משתמש 1 x PBS, הסר את ה-x 1 PBS עם זכוכית פסטר pipette פעם אחת כל הביצים נאספים, לאחר מכן, להוסיף מלבין הביצים.
    הערה: בעת איסוף ביצים, הרם לאט את הביצה מבסיסו עד pedicel יוסר העלה. Pedicel הוא דביק, הביצה ידבק נפוץ בין קצה המקדח עד זה מוכנס לתוך האקונומיקה.
    הערה: מומלץ לשימוש נפרד זכוכית פסטר סיליקון עבור כל ריאגנטים, ניתן לשנות את מדי סוכר עם חום כדי להצר את הטיפים ולהפחית את הסיכון בטעות כ רפה בעברית ביצים כנימת עש הטבק. כדי למנוע שריפה, זיהום, לנקות מדי של סוכר עם מים יונים לאחר כל שימוש.
  5. המתן 10 דקות. אם יש אינטרס מופרה בביצים שגילן עולה על 1 h, השאירו את הביצים מלבין עד 15 דקות.
    הערה: ביצים שאינן הישן עד 1 שעות, 10 דקות היא מספקת.

3. קיבוע

הערה: השלבים הבאים לקוחים מתוך פרוטוקול Hymenopteran17.

  1. הסר את המלבין (המכיל את השברים chorion) עם זכוכית פסטר פיפטה וזורקים אותו. להוסיף טיפות של חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה, להמתין 3 דקות.
    התראה: להמשיך עם שלב זה ברדס fume. חומצה אצטית היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול חומצה אצטית קרחונית, לא לנשום, במיוחד בשילוב עם המלבין שיורית.
  2. להסיר את חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק (3:1 של כוהל מוחלט: חומצה אצטית) עם זכוכית פסטר פיפטה. חכה עד רוב הפתרון התאדו (או מקסימום 10 דקות).
  3. להוסיף טיפות של 70% אתנול הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה, חכה עד רוב האתנול התאדו (או 10 דקות מקסימום).

4. מכתים

  1. להסיר כל אתנול שיורית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות 1 x PBS הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה כדי לקבל את ה-pH קרוב 7.0. להגדיר את השקופית מיקרוסקופ תא לחות כדי למנוע לייבוש, לדוגמה, בתיבת עצה פיפטה ריק עם מגבת נייר רטובה בפנים (איור 3). המתן לפחות 30 דקות.
    הערה: זו הנקודה הטובה ביותר אם הפסקה נחוצה, כל עוד תא לחות יכול למנוע לייבוש.
  2. הסר את PBS 1 x עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של 0.1 μg/mL דאפי, כתם פלורסנט דנ א, עם זכוכית פסטר פיפטה. הגדר את השקופית מיקרוסקופ בחדר חשוך לחות ולא לחכות לפחות 15 דקות.
    התראה: דאפי היא מטרד, אז תתמודד עם זה עם כפפות.

5. כביסה

  1. הסר את דאפי עם זכוכית פסטר פיפטה.
  2. להוסיף טיפות 1 x TBST (פתרון x 5 זני 30 גרם של טריס, g 43.8 של NaCl, 5 מ של polysorbate 20 ו- 1.0 g של נאן3 [pH 7.5], והביא 1 ליטר מים כיתה ה-PCR) את הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה. להמתין 5 דקות לפני הסרת ה-1 x TBST עם זכוכית פסטר פיפטה. חזור על שלב זה פי 2.

6. הרכבה

  1. לאחר השטיפה הסופית pipette בקפידה כל הביצים מהסרט פרפין לתוך חלק נקי של השקופית מיקרוסקופ. להסיר את עודף 1 x TBST; לאחר מכן, הוסף µL 20 הגוברת מדיה (גליצרול 80% ו-20% 1 x TBST עם 2% n-propyl-מספר) ומניחים שקופית כיסוי נקי על הביצים.
  2. לאחסון לטווח ארוך, לאטום את השקופית כיסוי עם לק ברורה, לאחר מכן, לאחסן את השקופית בחושך ב 2 מעלות צלזיוס או מיד להציג אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבדוק אם ריקטסיה משפיע על הקצב הפריה של עש ב MEAM1 נשים, אנחנו גדלו ריקטסיה-נגוע (R.+) או uninfected (R.–) נולד ב- עש הטבק על לוביה הצמח (Vigna unguiculata) הפרד בין הכלובים-27 ° C, 70% לחות יחסית, של 16 h אור/8 h כהה photoperiod. R+ ו- R– הרביעית לחלל כנימות עש היו בזהירות להסיר עלים, מבודד צינורות רצועת µL 200. כאשר מבוגרים הגיח, הם היו שנאספו בקבוצות של 50% נשים, הועבר עלים נקיים בפטרי (n

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא הראשון כדי ללכוד את קצב הפריה או יחס העיקרי של עש. האתגר של פרוטוקול זה הוא כי הוא דורש חוקרים ללמוד כיצד להתמודד עם הביצים כנימת עש הטבק במהירות, להבטיח כי לא יותר 1 h עבר מאז הביצים היו oviposited עד הם קבועים. במהלך הניסויים ראשוני, ביצים זה תוקנו ב 3 h או postoviposition עוד היו זקן מדי כדי להתבונן הפריה, כפי syngamy אירע חטיבות mitotic בעיצומם. בין 1 עד 3 h, לקח pronuclei בצורה יותר עגול. בעוד נוכחות המוקדמות שני גרעינים מציין ביצה מופרית, קצת אחר כך, הפרד של שני גרעינים כהכנה syngamycan מופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מענק של ה-NSF (דב-1020460) כדי M.S.H. מענק אפריק USDA (2010-03752) כדי M.S.H. המחברים מודים ברנן Zehr על צביעת ביצים כנימת עש הטבק עם הרבה מיומנות, זן. המחברים תודה מייק ריהלה להתרת השימוש שלו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הדמיה. המחברים מודים סוזן וקלי מרקו Gebiola על הדימויים ביצה. המחברים תודה סוזן קלי בג'ימי קונוואי על העזרה ברגעים מכריעים במהלך הניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBSכל
1x TBSTכלתמיסה 5x עשויה מ-30 גרם Tris, 43.8 גרם NaCl, 5 מ"ל Tween-20 ו-1.0 גרם NaN3 pH 7.5, והובאה ל-1 ליטר עם מים בדרגת PCR
אקונומיקהקלורוקסכל אקונומיקה ביתית תעבוד כל עוד ניתן לדלל אותה ל-0.83% נתרן היפוכלוריט
לק שקוףכל
DAPI דילקטטסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc300415
אתנולכלמדולל ל -70% EtOH
ניקון אקליפס 50i שימש בניסוי זה, אך ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן עירור של 340/380 ננומטר והגדלה של פי 4-10 לפחות
חומצה אצטית קרחוניתMallinckrodtUN2789
גליצרולכל
מיקרוסקופWildA Wild M5A שימש לניסוי זה, אך ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ שבו המפעיל יכול לראות בבירור את ביצי הזבוב הלבן
כיסויי שקופיות מיקרוסקופכלהשיטות מיועדות לכיסויי שקופיות בגודל 18 מ"מ על 18 מ"מ. יהיה צורך להוסיף מדיית הרכבה נוספת עבור כיסויי שקופיות גדולים יותר.
שקופיות מיקרוסקופכל
סיכות נדל של Minutenסיכות נדל BioQuip1208SAMinuten הן אופציונליות לעיצוב כבדיקות עם קצות פיפטה
NaClכל
NaN3כל
n-פרופיל-גלאטסיגמא/סנטה קרוז ביוטכנולוגיהP3130/sc-250794
פרפילםפיפטות Bemis
Pasteurפישר סיינטיפיק13-678-20Aפיפטות פסטר חד פעמיות מזכוכית בורוסיליקט 5.75 אינץ'. ייתכן שיהיה צורך גם במבער בונסן אם המפעיל ירצה להאריך ולהצר פיפטות
בדרגת PCRכל
קצות פיפטהכלקצות פיפטה הם אופציונליים לעיצוב כבדיקות עם סיכות נדל דקות
נורת טפטפת קטנהכלחובה להתאים לפיפטה פסטר
טריסכל
טווין-20כל
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניקון מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DechorionationDAPIRickettsia

מאמרים קשורים