Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Q: What is the significance of PKR in neurodegenerative diseases?

PKR is activated in patients with neurodegenerative diseases, suggesting a role in their pathogenesis.

Q: How does the crosslinking method work?

Formaldehyde crosslinks RNA-PKR complexes, allowing for their stabilization and subsequent analysis.

Q: Can this method be used for other RNA-binding proteins?

Yes, the protocol is adaptable for studying RNA interactors of various RNA-binding proteins.

Q: What techniques are used for analyzing the enriched RNAs?

High-throughput sequencing and qRT-PCR are employed for detailed analysis of the enriched RNAs.

Q: What are the main advantages of this protocol?

The protocol allows for efficient crosslinking and enrichment of RNA interactors, facilitating genome-wide studies.

Sujin Kim; Minjeong Kang; Yoosik Kim

doi:10.3791/59215

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

DOI: 10.3791/59215

March 5, 2019

Sujin Kim¹, Minjeong Kang¹, Yoosik Kim¹

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST),Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

Abstract

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) חברה של החלבונים תגובה חיסונית מולדת, מזהה את המבנה משני גדילי כפול של RNAs ויראלי. PKR כאשר הוא מאוגד כדי כפול גדילי ויראלי RNAs (dsRNAs), עובר dimerization ו- autophosphorylation הבאים. PKR phosphorylated (pPKR) הופכת לפעילה ומשרה זירחון של יחידת משנה אלפא של חניכה האיקריוטים פקטור 2 (eIF2α) כדי לדכא את התרגום גלובלית. הגדלת הראיות עולה כי יכול להיות מופעל PKR בתנאים פיזיולוגיים כגון במהלך מחזור התא או בתנאים מתח שונים ללא זיהום. לעומת זאת, ההבנה שלנו של רנ א. תנתק של PKR מוגבל בשל חוסר שיטה ניסיונית מתוקננת לכידת וניתוח dsRNAs אינטראקציה-PKR. כאן, אנו מציגים את ניסיוני פרוטוקול במיוחד להעשיר ולנתח PKR מאוגד RNAs במהלך מחזור התא באמצעות תאים הלה. אנו מנצלים את הפעילות crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן את מתחמי PKR-RNA ולבודד אותם באמצעות immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs ואז יעובד נוספת כדי ליצור ספריה רצף תפוקה גבוהה. אחד כיתת אינטראקציה-PKR dsRNAs הסלולר העיקרי הוא RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר יכולה להתקיים בתור dsRNAs הבין-מולקולרי כתהליכי משלימים בין סטרנד-הכבד את RNAs אור-strand. ללמוד את strandedness של אלה mtRNAs דופלקס, אנו מציגים גם עבור סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR פרוטוקול. פרוטוקול שלנו ממוטב עבור הניתוח של RNAs מאוגד-PKR, אך שניתן יהיה לשנותה בקלות ללמוד dsRNAs הסלולר או RNA-interactors של אחרים dsRNA מחייב חלבונים.

Introduction

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR), הידוע גם בשם האיקריוטים חניכה פקטור 2-אלפא קינאז 2 (EIF2AK2), היא קינאז מאופיין היטב ששולחות מידע שסופק על-ידי RNAs. זה שייך האלפא יחידה משנית חניכה 2 תרגום האיקריוטים (eIF2α) המשפחה קינאז, phosphorylates eIF2α-סרין 51 בתגובה לזיהום לדכא את תרגום כללי¹. בהקשר זה, PKR מופעל על ידי נגיפי RNAs גדילי כפול (dsRNAs), המספקים פלטפורמה PKR dimerization ו autophosphorylation². בנוסף eIF2α, PKR יכול phosphorylate גם p53, המצע קולטן לאינסולין 1, מעכב κB וקינאז c-Jun N-מסוף (JNK) להסדיר את הפעילות של רבים האות התמרה חושית מסלולים³^,⁴^,⁵^, ⁶.

PKR זוהה במקור קינאז זה phosphorylated eIF2α במהלך poliovirus זיהום על ידי זיהוי של poliovirus-dsRNAs-⁷^,-⁸. PKR מצוי יותר ויותר כדי לשחק תפקידים רבת מעבר התגובה החיסונית, aberrant ההפעלה או תקלה שלה היא משתמעת אינספור מחלות אנושיות. PKR מופעל/Phosphorylated (pPKR) נצפית לעתים קרובות במהלך אפופטוזיס, היא מאפיין נפוץ של חולים עם מחלות ניווניות, במיוחד מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון של, מחלת אלצהיימר⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. בנוסף, PKR מופעלת בתנאים מתח שונים כגון מתח מטבולית, חום הלם¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. מצד שני, עיכוב של PKR התוצאה התפשטות תאים מוגברת שינוי ממאיר אפילו¹⁸^,¹⁹. PKR פונקציה חשובה גם בתפקוד מוח נורמלי, במהלך מחזור התא ככל שרמת pPKR גבוהות במהלך²¹^,²²²⁰^,שלב M. בהקשר זה, pPKR מעלימה תרגום גלובלית, מספקת רמזים כדי מערכות איתות mitotic מפתח הנדרשים עבור חלוקת התא המתאים²⁰. יתר על כן, הפעלה ממושכת של PKR הביא בשלב G2/M מחזור התא מעצר בתוך השחלה אוגר סיני תאים²³. כתוצאה מכך, זרחון PKR מוסדר על ידי הלופ משוב שלילי על מנת להבטיח שחרור משרות מהיר במהלך המעבר M/G1²¹.

למרות הפונקציה טווח רחב של PKR, ההבנה שלנו של PKR ההפעלה מוגבלת בשל חוסר גישה ניסיוני מתוקננת של תפוקה גבוהה כדי ללכוד ולזהות dsRNAs לבצע הפעלה PKR. מחקרים קודמים הראו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם dsRNAs הנוצרת על-ידי שני הפוך Alu חזרה (IRAlus)²⁰^,²⁴, אבל האפשרות לקיומו של dsRNAs הסלולר נוספים לבצע הפעלה PKR במהלך מחזור התא, או תחת תנאי הלחץ בתאי אדם היה שאינו גלוי. הגישה המקובלת לזיהוי RNA-interactors של RNA מחייב חלבון (RBP) משתמש אור UV עד crosslink RNA-RBP מתחמי²⁵^,²⁶^,²⁷. מחקר שנערך לאחרונה ליישם גישה זו crosslinking UV מערכת עכבר וזיהה RNAs nucleolar קטן יכול לווסת את הפעלת PKR במהלך מתח מטבולית¹⁶. על ידי ניצול היעילות crosslinking גבוהה של פורמלדהיד, הצגנו שיטה חלופית לזהות אינטראקציה-PKR RNAs במהלך מחזור התא הלה תאים²⁸. בגישה דומה הוחל ללמוד dsRBPs אחרים כגון Staufen ו Drosha²⁹^,³⁰^,³¹. מצאנו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם סוגים שונים של noncoding RNAs כגון קצר וביניהם גרעיני רכיב (סינוס), רב וביניהם רכיב גרעינית (קו), אלמנט הרטרווירוס אנדוגני (ארב) ו RNAs אפילו אלפא-לוויין. בנוסף, הראינו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר dsRNAs הבין-מולקולרי של טופס דרך משלימים האינטראקציה בין סטרנד-הכבד את האור לנטישה של RNAs²⁸. פרסום האחרונות תמיכה נוספת הנתונים שלנו כי כמה mtRNAs קיים בצורה דו-צדדית, והוא יכול להפעיל dsRNA חיישנים כגון מלנומה בידול-הקשורים חלבון 5 לזירוז האינטרפרונים³². חשוב מכך, הביטוי ואת subcellular לוקליזציה של mtRNAs מאופנן במהלך מחזור התא ועל ידי לחצים שונים, אשר עשוי להיות חשוב על היכולת לווסת את הפעלת PKR²⁸.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט crosslinking פורמלדהיד שפותח לאחרונה, immunoprecipitation (fCLIP) שיטת לכידת וניתוח RNAs אינטראקציה-PKR במהלך מחזור התא. נדגים את השיטה כדי להכין דגימות מעצר מחזור התא באמצעות תימידין ו- nocodazole. לאחר מכן נציג את תהליך fCLIP כדי לבודד RNAs מאוגד-PKR, שיטה להכין ספריית רצף תפוקה גבוהה לזהות אלה RNAs. יתר על כן, אנו ניסחו הליכים מפורטים לנתח RNAs PKR מאוגד באמצעות לרביעיית-PCR. באופן ספציפי, אנו מציגים את הליך שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים כדי לנתח את strandedness של mtRNAs. הפרוטוקול המתואר ממוטבת עבור הלה תאים ו- PKR, אך השלבים החשובים כגון הכנת לדוגמה מחזור התא, fCLIP, וניתוח סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR אפשר בקלות לשנות כדי ללמוד dsRNAs הסלולר או כדי לזהות רנ א interactors של אחרים dsRBPs.

Protocol

1. פתרון ותא הכנה

פתרון הכנה
1. עבור המדיום התרבות תאים, היכונו בינוני תרבית תאים הלה על-ידי הוספת 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) עד 500 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco).
  הערה: אנטיביוטיקה ניתן להוסיף המדיום התרבות תאים, אך אנחנו לא משתמשים אנטיביוטיקה.
2. עבור paraformaldehyde 0.1%, להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) עם חימום על פלטה חמה ורכים לעשות 30 מ של 0.1% (v/v) paraformaldehyde על-ידי הוספת 1 x PBS.
  התראה: לבצע את כל השלבים בברדס fume, להיזהר לא להרתיח את הפתרון paraformaldehyde. להגן על הפתרון 0.1% מהאור ולאחסן ב 4 º C. השתמש הפתרון תוך חודש.
  הערה: ה-pH של הפתרון הסופי של paraformaldehyde 0.1% (v/v) צריך להיות בסביבות 7.
3. הכנת מאגר פירוק fCLIP: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 15 מ מ NaCl, 10 מ מ EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) X-100 טריטון, 0.1% (v/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), ו- 0.1% (w/v) נתרן deoxycholate. להוסיף מים מזוקקים טריפל (TDW) 40 מ. חנות ב 4 º C.
4. הכנת מאגר לשטוף fCLIP: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 150 מ מ NaCl, 10 מ מ EDTA, 0.1% (v/v) NP-40 0.1% (v/v) טריטון X-100, 0.1% (v/v) מרחביות, 0.1% (w/v) נתרן deoxycholate. להוסיף TDW 40 מ. חנות ב 4 º C.
5. להכין 4 x מאגר PK: 400 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 200 מ"מ NaCl, EDTA 40 מ מ, ו- 4% (v/v) מרחביות. להוסיף TDW 40 מ. לאחסן בטמפרטורת החדר.
6. הכנת מאגר • תנאי fCLIP: 20 מ של 4 x PK מאגר, g 21 של אוריאה ו- 8.5 מ של TDW. להכין טרי.
7. הכנת מאגר • תנאי ה-RNA: 0.3 M NaOAc ו- 2% (w/v) מרחביות. לאחסן בטמפרטורת החדר.
8. להכין 2 x RNA בטעינת צבע: כחול bromophenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) קסילן cyanol, 5 מ מ EDTA, מרחביות 0.05% (w/v) ו- formamide 95% (v/v). חנות ב-20 ° C.
9. הכנת מאגר x TBE 1: 0.089 מ' טריס-בוראט ו 0.002 M EDTA. הכנת 500 מ"ל TBE המאגר.
הכנת בבידוד-שלב תאים S או M
1. ~ 750,000 הזרע או ~ 1,000,000 הלה תאים לדגימות S או M. בבידוד-שלב, בהתאמה. לגדל תאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂במשך 24 שעות ביממה.
2. לטיפול תאי עם תימידין 2 מ מ, תקופת דגירה של 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסף מדיה טריים, תקופת דגירה של h 9-37 מעלות צלזיוס.
4. עבור תאים בבידוד-שלב S, יטפל בתאים עם תימידין 2 מ מ. עבור תאים בבידוד-שלב M, יטפל בתאים עם 100 ננוגרם למ"ל nocodazole. תקופת דגירה של h 15 תאים 37 ° C וקציר.
  הערה: אחידות הדגימות מחזור התא ניתן לבדוק באמצעות FACS.

2. פורמלדהיד cross-linking, immunoprecipitation

תא קציר
1. עבור דוגמה שלב S, איסוף תאים עם תא במגרדת, העברת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. עבור דוגמה שלב M, הקש על הצד של המנה תרבות תא ניתוק התאים בבידוד-שלב M ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  הערה: כדי להגדיל את ההומוגניות של התאים בבידוד-שלב M, אין להשתמש במגרדת תא.
2. Centrifuge התאים ב 380 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש עם 1 מ"ל של PBS קר והעברת לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
3. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב 4 ° C עבור הסרה ס' 30 את תגובת שיקוע לחלוטין.
Crosslinking פורמלדהיד
1. הוסף μL 750 של 0.1% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את התאים.
2. להוסיף 250 μL של 1 מ' גליצין, דגירה נוסף של 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להרוות את התגובה. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב 4 ° C עבור הסרה ס' 30 את תגובת שיקוע לחלוטין.
3. להשעות מחדש עם 1 מ"ל ל- PBS. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב- 4 ° C עבור 30 s והסר תגובת שיקוע.
4. להשעות מחדש עם 400 μL fCLIP פירוק מאגר עם מעכב פרוטאז 0.2% (v/v) ו- 2% (v/v) RNase מעכב. דגירה על קרח למשך 10 דקות, sonicate משתמש של ultrasonicator.
5. הוסף μL 11 של 5 M NaCl להתאמת NaCl ריכוז ~ 150 מ"מ. מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 21,130 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge mL 1.5 מראש צוננת.
  הערה: שומרים על μL 40 של תגובת שיקוע בשפופרת צנטרפוגה חדשים כמו הדוגמה קלט. חנות המדגם קלט ב 4 º C.
Immunoprecipitation
1. הוסף 20 μL של חלבון A חרוזים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
2. לשטוף את החרוזים עם 400 μL fCLIP פירוק המאגר. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP פירוק מאגר בקפידה. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
3. חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
4. מחדש להשעות את החרוזים ב- 300 μL fCLIP פירוק המאגר. הוסף μL 8.3 של 5 M NaCl להתאמת NaCl ריכוז ~ 150 מ"מ. להוסיף 10 μL של PKR נוגדן ולאחר תקופת דגירה של h 3 ב מסובב ב 4 º C.
5. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP שטיפת המאגר. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
6. חזור על השלב לשטוף פעמיים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
  הערה: אף פעם לא השתמש מערבל מערבולת. היפוך הצינור בעדינות בידיים.
7. להוסיף 300 μL של lysate, תקופת דגירה של h 3-4 מעלות צלזיוס על מסובב.
  הערה: זמן דגירה יותר עלולה לגרום באיגוד רקע מוגבר.
8. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP שטיפת המאגר. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
9. חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
10. להוסיף 300 μL fCLIP • תנאי המאגר. דגירה ב thermomixer עבור 3 h ב- 25 ° C עד elute PKR של החרוזים.
  הערה: להכין fCLIP • תנאי מאגר הטרייה.
11. צנטריפוגה ב x 1000 g בטמפרטורת החדר, להעביר את תגובת שיקוע siliconized צינור נקי.
  הערה: צינור microcentrifuge זה גם בסדר, אבל צינור siliconized מועדף כדי למנוע התאיידות במהלך השלב דה-crosslinking (שלב 2.3.12).
12. להוסיף 300 μL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), דגירה בין לילה-65 מעלות צלזיוס.
  הערה: השתמש thermomixer עם מכסה מחומם כדי למנוע התאיידות.
החילוץ-RNA
1. להוסיף μL 580 של חומצה-פנול כלורופורם, מערבולת של Incubate ס' 30-37 מעלות לשעה.
2. מערבולת עבור 30 s ו צנטריפוגה ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
3. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant (למשל, Glycoblue), ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
4. לזרז כדורי מאת צריך שתוציאו במהירות המרבית ב 4 ° C עבור 1 h.
  הערה: אם לא נצפו RNA/DNA כדורי, להוסיף μL 0.5 נוספים של coprecipitant, צנטריפוגה עבור נוספים 1 ח' המשך שלב זה עד כדורי RNA/DNA הם נצפו.
5. הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של 75% אתיל אלכוהול. צנטריפוגה ב x 12,000 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת. להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע ויבש בגדר בטמפרטורת החדר.
6. להוסיף μL 42 של TDW, 5 μL של DNase אני מאגר, μL 1 של מעכב RNase 2 μL של דגירה אני DNase 37 מעלות לשעה.
7. להוסיף 150 μL של TDW וμl 200 של חומצה-פנול כלורופורם. מערבולת עבור צנטריפוגה ס' 30 ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
8. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 20 μL של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ו- 1 מ"ל של 100% אתיל אלכוהול. דגירה בין לילה ב- 80 ° c
9. לזרז כדורי ולשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
10. מחדש להשעות, הכמות המתאימה של TDW.

3. רצף ספריית הכנה

הסרת rRNA
1. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 28 μL של TDW.
  הערה: הכמות המרבית של RNA הכולל צריך להיות פחות מ- 5 μg.
2. בצע את ההליכים הניתנים על ידי המדריך של הערכה rRNA להסרת להסרת rRNA.
3. לנקות rRNA דלה RNAs על-ידי הוספת μL 160 של beads מגנטי.
  1. לערבב על-ידי pipetting ~ 15 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  2. לצרף את הצינורית על פס מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע.
  3. להוסיף 300 μL של 80% אתיל אלכוהול בזמן החרוזים עדיין מחוברים על הבר מגנטי תקופת דגירה של 30 s.
  4. החלף אתיל אלכוהול פתרון 300 μL טריים. האוויר יבש את החרוזים על הבר מגנטי עבור 12 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מחדש להשעות את החרוזים ב 12 μL של TDW, מיקס על ידי pipetting 15 פעמים.
  6. לצרף את החרוזים על הבר מגנטי והזז את תגובת שיקוע צינור נקי PCR.
4. לרוקן את RNAs ribosomal מפוצלים (rRNAs) בעקבות ההליכים הניתנים על ידי rRNA דלדול קיט.
5. לנקות את RNAs על-ידי הוספת μL 110 של beads מגנטי של צעדים חוזרת 3.1.3.1 כדי 3.1.3.6.
מצדו תיוג, מתאם ה-RNA
1. RNAs מדולדל rRNA, להוסיף 2 μL 10 מאגר x CIAP, μL 1 של מעכב RNase 2 μL של phosphatase אלקליין האנטארקטי. דגירה 37 ° C עבור 1 h ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להשבית את פוספטאז.
2. להוסיף 3 μL 10 מאגר x PNK, μL 1.5 של RNase מעכב, μL 1.5 של אנזים T4 PNK, μL 0.8 של r-ATP ו 1.7 μL של TDW. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות.
3. להוסיף 1.5 μL 10 מ מ ATP, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות נוספות.
4. לעצור את התגובה על ידי הוספת μL 170 המאגר • תנאי ה-RNA.
5. להוסיף 200 μL של חומצה-פנול כלורופורם, מערבולת של צנטריפוגה ס' 30 ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
6. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 20 μL של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ו- 1 מ"ל של 100% אתיל אלכוהול. דגירה בין לילה ב- 80 ° c
7. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5. להשעות מחדש ב- 4.5 μL של TDW ולהוסיף μL 9 של 2 x צבע טעינת ה-RNA.
8. מחממים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, העומס על ג'ל אוריאה-דף 10%.
9. הפעל את הג'ל-370 V למשך 40 דקות.
  הערה: הפעל מראש את הג'ל על 370 V במשך 90 דקות לפני שיטען הדוגמה.
10. לחתוך את הג'ל על האזור נוקלאוטיד ~ 100 – 500 ו לשבור את הג'ל.
11. להוסיף 700 μL של 0.3 M NaCl, דגירה בין לילה ב 4 ° C-מסובב.
12. להעביר את הפתרון העמודה ואת צנטריפוגה-מהירות מירבית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
13. להעביר את eluate לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
מתאם מצדו 3'
1. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA ב- 6.5 μL של TDW ולהוסיף 1 μL של μM 10 3' מתאם.
3. הפתרון להעביר צינור PCR, דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
4. להוסיף 1 μL מאגר מצדו של 10 x 0.5 μL של מעכב RNase, μL 1 של T4 RNA ליגאז 2. דגירה ב 28 ° C עבור h 1, 25 מעלות במשך 6 שעות, 22 מעלות במשך 6 שעות.
5. הוסף μL 12 של 2 x RNA בטעינת צבע וחום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
6. ג'ל לטהר את 3' מתאם מאתרים RNAs כפי שמתואר 3.2.9 כדי 3.2.13.
5' מתאם מצדו
1. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA ב- 4.2 μL של TDW ולהוסיף 1 μL של μM 5 5' מתאם.
3. הפתרון להעביר צינור PCR, דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
4. הוסף μL 0.8 x 10 ליגאז מאגר, μL 0.4 של RNase מעכב, 0.8 μL 10 מ מ ATP, μL 0.8 של T4 RNA ליגאז 1. דגירה ב 28 ° C עבור h 1, 25 מעלות במשך 6 שעות, 22 מעלות במשך 6 שעות.
שעתוק במהופך ו- PCR-הגברה
1. 5' מתאם RNAs מחוברים, להוסיף 1 μL של 4 μM שעתוק במהופך פריימר. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו מיד להצטנן עד 4 ° C.
2. להוסיף 4 μL מאגר FS x 5, μL 4 של 2.5 מ מ dNTP, μL 1 של 0.1 M DTT, μL 1 של מעכב RNase μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז. דגירה ב 50 ° C 1 h, 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
3. להכין PCR-הגברה
  1. לערבב 1 μL של המוצר RT, μL 1 של פריימר RPI μM 25, 1 μL של פריימר RP1 μM 25, 10 μL של 5 x HF מאגר, μL 4 של 2.5 מ מ dNTP, 32.5 μL של TDW ו 0.5 μL של פולימראז אמינות גבוהה.
  2. הפעל תוכנית ה-PCR 11 ~ 13 מחזורים.
    הערה: התוכנית עבור ה-PCR הוא: 98 ° C ל 30 s בתור התחלה חם, 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s עבור הגברה, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הצעד הגברה חוזרת 11-13 מחזורים.
4. לנקות את המוצרים PCR באמצעות μL 40 של beads מגנטי, השלבים הבאים 3.1.3.1 כדי 3.1.3.6 אבל בעזרת 10 μL של TDW elute ה-DNA.
5. להוסיף 2 μL של צבע ההעמסה של ה-DNA x 10. טען את הדגימה על ג'ל אקרילאמיד 6% והשתמש ב- 200 וולט למשך 30 דקות.
6. כתם עם Sybr זהב (0.01% (v/v) במאגר x TBE 1) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. מבטל את כתם במאגר x TBE 1 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לחתוך את הג'ל על האזור נוקלאוטיד ~ 200-700 ו לשבור את הג'ל.
9. להוסיף 700 μL של 0.3 M NaCl, דגירה ללילה בטמפרטורת החדר כדי elute את ה-DNA.
10. להעמיס את הכל על עמודה בעלת צנטריפוגה-מהירות מירבית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
11. להעביר את eluate לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
12. לזרז את כדורי ה-DNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5. להשעות מחדש ב 20 μL של TDW.
13. לנתח את הדגימה תוך שימוש ברצף.

4. ניתוח של אינטראקציה-PKR RNAs באמצעות לרביעיית-PCR

שיטה 1: hexamer אקראיים שעתוק במהופך
1. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 8.5 μL של TDW ולהעביר את הפתרון צינור ה-PCR.
2. להוסיף 0.5 μL של 100 μM אקראי hexamers וμl 4 של מיקס dNTP 2.5 מ מ.
3. חום הפתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומיד תדגור על קרח לפחות 1 דקות
4. גורמות לתגובה לערבב: μL 4 5 מאגר x SSIV, 1 μL של 100 מ מ DTT, μL 1 של מעכב RNase ולאחר μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U μL). להוסיף את תערובת התגובה הפתרון RNA.
5. דגירה התערובת ב 23 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו- 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
6. לנתח את cDNA באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת.
  הערה: התוכנית עבור ה-PCR בזמן אמת זה: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות בשביל התחלה לוהטת, 95 ° C 5 s ו- 60 מעלות צלזיוס במשך 10 s עבור הגברה, ו 95 ° C ל 30 s, 65 ° C ל 30 s, ו 95 ° C ל 30 s עבור להמיס. הצעד הגברה הוא חזר 40 מחזורים.
שיטה 2: ספציפי סטרנד שעתוק במהופך
1. להכין תערובת הבסיס של תחל הפוכה: מערבבים כמויות שוות של גנים ספציפיים שעתוק במהופך תחל המכיל רצף יזם CMV ואחריו ~ 20 נוקלאוטידים של ג'ין רצפים ספציפיים.
  הערה: הריכוז משולב של כל גן ספציפי RT תחל זה 4 μM.
2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 8.5 μL של TDW ולהעביר את הפתרון צינור ה-PCR.
3. להוסיף 0.5 μL של 4 מיקס מאסטר μM של שעתוק במהופך תחל ו 4 μL של מיקס dNTP 2.5 מ מ.
4. חום הפתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומיד תדגור על קרח לפחות 1 דקות
5. הכן את הפתרון התגובה על ידי ערבוב μL 4 5 מאגר x SSIV, 1 μL של 100 מ מ DTT, μL 1 של מעכב RNase ולאחר μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U μL). הוסף את הפתרון התגובה לתערובת RNA-פריימר.
6. דגירה הפתרון ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו- 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
7. לנתח את cDNA באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת.
  הערה: התוכנית עבור ה-PCR בזמן אמת זה בדיוק כמו זה שמתואר בשיטה 1.

Representative Results

מפרטים טכניים עבור התהליך לעצור הלה תאים בשלב S או M של מחזור התא מוצג באיור1. עבור דוגמה מ' בבידוד-שלב, שאנו יכולים לדמיין בבירור עגול בצורת התאים במיקרוסקופ (איור 2 א). לבחון את היעילות של המעצר מחזור התא, התוכן הגרעיני של התא יכול להיות מנותח באמצעות FACS (איור 2B). איור 3 מראה נציג נתונים לבדיקת יעילות immunoprecipitation, שבו הנוגדן D7F7 מראה יכולת מעולה כדי immunoprecipitate PKR. אולי ההבדל הזה היעילות immunoprecipitation לידי ביטוי הפער בחלוקת מחלקה של ספריות רצף תפוקה גבוהה המוכנים שני נוגדנים PKR שונים (איור 4). ייחודה של הנוגדן D7F7 עוד יותר אושר באמצעות ניתוח המערבי כל כתם של PKR immunoprecipitate (איור 5A) והתא סך lysate (איור 5B). איור 6 מציגה את האות radioisotope לפני ואחרי הסרת rRNAs במהלך הכנת ספריה רצף תפוקה גבוהה. איור 7 מציג את העשרת של mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated עם PKR, אך לא RNAs co-immunoprecipitated עם הארנב IgG או תיסמונת תסמונת כרומוזומלית לאזור 8 (DGCR8). איור 8 מראה סטרנד נציג ספציפי לרביעיית-PCR ניתוח של PKR מכורך mtRNAs S או M-פאזי נעצר דגימות.

איור 1: סכימטי על הדגימות מעצר הכנה מחזור התא. (A, B) רישומי ההכנה של S (A) או תאים הלה בבידוד-שלב M (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: ניתוח של מחזור התא נעצר דגימות. (א) שלב תמונות בניגודיות בבידוד-שלב דגימות S או M. ברים עולה 250 μm. ניתוח (B) FACS מציג את התוכן הגרעיני של הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: Immunoprecipitation יעילות בדיקת נוגדנים PKR. העשרה מוצלחת של RNAs מאוגד-PKR, נוגדן יעילות immunoprecipitation סופית כמו הנוגדן D7F7 אמור לשמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: RNA שיעור חלוקת רצף ספריות שהוכנו באמצעות נוגדנים PKR שונה. באמצעות נוגדנים PKR שונים עבור fCLIP הביא התפלגות דרגות שונות הקריאות רצף ממופה. הפער סביר עקב הבדלים יעילות immunoprecipitation. איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: ייחודה של הנוגדן D7F7 PKR. (A, B) חשופה כל ניתוח המערבי של PKR immunoprecipitated (א) או הכולל הלה lysate (B) הראה רק אחד הלהקה חזקים המתאימים לגודל של PKR, המציינת כי D7F7 נוגדן ספציפי מאוד בזיהוי PKR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: Radioisotope סיגנל PKR co-immunoprecipitated RNAs. (א) PKR co-immunoprecipitated RNAs יכול יזוהו על-ידי תיוג 5' הקצוות שלהם עם r-ATP. (B) הדירי radioistope אות נצפתה על הסרה מוצלחת של rRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: אימות של אינטראקציות PKR-mtRNA. הרשמו2 העשרה קיפול של mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated עם נוגדנים המצוין. רק PKR co-immunoprecipitated RNA המדגם הראה העשרה חזק של mtRNAs. נוגדנים IgG ארנב, DGCR8 שימשו כפקדי שלילי. איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8: ניתוח לרביעיית-PCR סטרנד ספציפיים של PKR מכורך mtRNAs. (A, B) שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים שימש כדי לנתח את strandedness של mtRNAs שהיו co-immunoprecipitated עם PKR S (A) או תאים בבידוד-שלב M (B). איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

המחברים אין לחשוף.

Disclosures

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה משרד המדע ICT (ה-NRF-2016R1C1B2009886).

Materials

3' מקדם CMV רצף פריימר 3115879001-qPCR בדרגת PCR ערכת הסרת

0.5 מ' EDTA, pH 8.0	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9260G
1 מ' טריס, pH 7.0	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9855G
1 מ' טריס, pH 8.0	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9855G
1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Axygen	MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)	Biosolution	BN015
10X מאגר טעינת DNA	TaKaRa	9157
15 מ"ל צינור חרוטי	SPL	50015
מתאם			5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3
M נתרן אצטט pH 5.5	תרמו פישר מדעי	AM9740
5' מתאם			5'-GUU CAG UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl	Thermo Fisher Scientific	AM9760G
צינור חרוטי 50 מ"ל	SPL	50050
חומצה-פנול כלורופורם, pH 4.5	Thermo Fisher Scientific	AM9722
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	חרוזים מגנטיים DNA / RNA ניקוי
פוספטאז אלקליין אנטארקטי	ניו אינגלנד Biolabs	M0289S
Anti-DGCR8			תוצרת בית
Anti-PKR (D7F7)	טכנולוגיית איתות תאים	12297S
Anti-PKR (Milli)	Millipore EMD	07-151
ATP (100 מ"מ)	GE Healthcare	GE27-2056-01
מלח נתרן כחול ברומופנול	סיגמא-אולדריץ'	B5525
פוספטאז אלקליין במעי עגל	מגרד תאים TaKaRa	2250A
25 ס"מ 2 מצבים	Sarstedt	83.183
רצף			5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'מדיום
הנשר השונה של Dulbecco	Welgene	LM001-05
תערובת dNTP (2.5 מ"מ)	TaKaRa	4030
אתנול, אבסולוט, ACS כיתה	Alfa-Aesar	A9951
סרום בקר עוברי	Merck	M-TMS-013-BKR
פורממיד	Merck	104008
גליצין	ביו-בייסיק	GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 מ"ג/מ"ל)	Thermo Fisher Scientific	AM9516
Isopropanol	Merck	8.18766.1000
ערכת דלדול RRN נוספת של NEBNext	ניו אינגלנד Biolabs	E6318	rRNA Depletion
Kit Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404
ארנב רגיל IgG	Cell איתות טכנולוגיה	2729S
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	6148
PCR קדימה פריימר (RP1)			5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
פריימר הפוך אינדקס PCR (RPI)			5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR
צינורות עם מכסה שטוח, 0.2 מ"ל	Axygen	PCR-02-C
פוספט מלח (PBS) טבליה	TaKaRa	T9181
Phusion פולימראז DNA בנאמנות גבוהה	ניו אינגלנד Biolabs	M0530	פולימראז
בנאמנות גבוההמיקרו-צנטריפוגה של PlateFuge עם רוטור מתנדנד החוצה	Benchmark	c2000
Polynucleotide kinase (PNK)	TaKaRa	2021A
Proteinase K, רקומביננטי,	סיגמא-אולדריץ'
: CO1 כבד			קדימה/אחורה: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CO1 אור			קדימה/אחורה: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CO2 כבד			קדימה/אחורה: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CO2 אור			קדימה/אחורה: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGTAGGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CO3 כבד			קדימה/אחורה: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CO3 אור			קדימה/אחורה: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CYTB כבד			קדימה/אחורה: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGGTG-3′
רצף פריימר qPCR: CYTB אור			קדימה/אחורה: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: GAPDH			קדימה/אחורה: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND1 כבד			קדימה/אחורה: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND1 אור			קדימה/אחורה: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGGGAGAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND4 כבד			קדימה/אחורה: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND4 אור			קדימה/אחורה: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND5 כבד			קדימה/אחורה: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND5 אור			קדימה/אחורה: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND6 כבד			קדימה/אחורה: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
רצף פריימר qPCR: ND6 אור			קדימה/אחורה: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
הקסמר אקראי	Thermo Fisher Scientific	SO142
דנאז רקומביננטי I (ללא רנאז) (5 U/μ L)	TaKaRa	2270A
מעכב רנאז רקומביננטי (40 U/μ L)	ערכת הסרת TaKaRa	2313A
Ribo-Zero rRNA	Illumina		MRZH116 rRNA
מסובב	FINEPCR, ROTATOR AG	D1.5-32
רצף פריימר RT: CO1 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTGTGTTAGTAG-3′
רצף פריימר RT: CO1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
רצף פריימר RT: CO2 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCTAGGTAGGTAGGTAGGG-3′
רצף פריימר RT: CO2 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTCC-3′
רצף פריימר RT: CO3 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
רצף פריימר RT: CO3 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGCCTTACCACTCCAGCCTAG-3′
רצף פריימר RT: CYTB כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
רצף פריימר RT: CYTB Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
רצף פריימר RT: GAPDH			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3′
רצף פריימר RT: ND1 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAAGGTGGAGAGG-3′
רצף פריימר RT: ND1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
רצף פריימר RT: ND4 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGTGTTTTTCGTAGGCAGATGG-3′
רצף פריימר RT: ND4 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
רצף פריימר RT: ND5 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGTGTTTGGTGAGGTGATG-3′
רצף פריימר RT: ND5 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
רצף פריימר RT: ND6 כבד			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGTGGTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
רצף פריימר RT: ND6 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
פוליפרופילן סיליקון 1.5 מ"ל G-tube	Bio Plas	4167SLS50
נתרן דדציל סולפט	Biosesang	S1010
נתרן דאוקסיכולט	סיגמא-אולדריץ'	D6750
SUPERase במעכב Rnase	Thermo Fisher Scientific	AM2694
SuperScript III טרנסקריפטאז הפוך	Thermo Fisher Scientific	18080093	טרנסקריפטאז הפוך להכנת ספרייה
SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוך	Thermo Fisher Scientific	18090010	טרנסקריפטאז הפוך עבור qRT-PCR
SYBR חומצת גרעין זהב כתם gl	Thermo Fisher Scientific	S11494
T4 פולינוקלאוטיד קינאז ניו	אינגלנד Biolabs	M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)	ניו אינגלנד Biolabs	M0204
T4 RNA ligase 2, קטום KQ	ניו אינגלנד Biolabs	M0373
Thermomixer	Eppendorf ThermoMixer C עם ThermoTop
Thymidine	Sigma-Aldrich	T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)	TaKara	T9122
Triton X-100	Promega	H5142
Ultralink חלבון A חרוזי ספרוז	תרמו פישר מדעי	22810	חלבון A חרוזים
אולטרסאונד	ביו-רופטור
אוריאה	ביו-בסיסי	UB0148
מערבל מערבולת	DAIHAN Scientific	VM-10
קסילן ציאנול	סיגמא-אולדריץ'	X4126
γ-³²P-ATP (10 μ צ'י-מו; L, 3.3 μ מ)	פרקין אלמר	BLU502A100UC

References

Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית