דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Hiroko Bannai; Matsumi Hirose; Fumihiro Niwa; Katsuhiko Mikoshiba

doi:10.3791/59246

מאמר שיטה

דיסקציה של Ca מקומי^{2 +} אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca^{2 +} אינדיקטורים

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59246

⸱

22 במרץ 2019

Hiroko Bannai¹^,² , Matsumi Hirose² , Fumihiro Niwa²^,³ , Katsuhiko Mikoshiba²

¹Japan Science and Technology Agency, PRESTO, ²Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, ³École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור Ca^{2 +} הדמיה של נוירונים ותאי גלייה, המאפשרת את הקרע של Ca^{2 +} אותות ברזולוציה subcellular. תהליך זה הוא החלים על כל סוגי תאים לאפשר הביטוי של Ca מקודדים גנטית^{2 +} מחוונים.

תקציר

יון סידן (Ca^{2 +}) הוא מולקולה messenger תאיים אוניברסלי כוננים מרובים איתות המסלולים, שמוביל פלטי ביולוגי מגוונות. התיאום של Ca שני^{2 +} אות מקורות – "Ca^{2 +} זרם" מ שנמצא מחוץ לתא "Ca^{2 +} שחרור" מתאיים Ca2 + חנות (ER) רשתית תוך-פלזמית – נחשבת ביסוד דפוסי-עתיים מגוונות Ca ^{2 +} איתותים שגורמים מרובות פונקציות ביולוגיות בתאים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר Ca^{2 +} הדמיה שיטה חדשה המאפשר פיקוח הרגע של "Ca^{2 +} זרם" ולשחרר "Ca^{2 +} ". השניה-GCaMP6f הוא מקודד גנטית Ca^{2 +} מחוון (GECI) הכוללת GCaMP6f, אשר מיועד הממברנה החיצונית ER. השניה-GCaMP6f יכולים לפקח על Ca^{2 +} שחרור ברזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר מאשר GCaMP6f קונבנציונלי. בשילוב עם GECIs, ממוקדות קרום פלזמה, ניתן לתאר-עתיים Ca^{2 +} אות התבנית ברזולוציה subcellular. Subcellular במיקוד Ca^{2 +} הסימנים המתוארים כאן, באופן עקרוני, זמין עבור כל סוגי תאים, אפילו בשביל ויוו הדמיה של נוירונים Caenorhabditis elegans . ב פרוטוקול זה, אנו להציג Ca^{2 +} הדמיה בתאים שורות תאים, נוירונים, תאי גליה בתרבויות העיקרי הפומבית, לתאר את הכנת מלאי קפוא של החולדה הנוירונים קורטיקלית.

מבוא

Ca^{2 +} אותות מייצגים את העלאת רמת הריכוז^{2 +} Ca תאיים. Ca^{2 +} הוא השליח השני אוניברסלי עבור התאים האיקריוטים. באמצעות Ca^{2 +}, התאים לתפקד באמצעות מגוון תאיים איתות המסלולים, זירוז פלטי ביולוגיים שונים. לדוגמה, בנוירונים, שלפוחית סינפטית השחרור במסוף presynaptic, ביטוי גנים גרעין ולאחר אינדוקציה של פלסטיות סינפטית ב postsynapse מוסדרים על ידי Ca^{2 +} אותות ברורים במדויק להפעיל המתאים אנזימים במורד הזרם באתרים נכון ועם תזמון מדויק¹.

דפוסים מסוימים ייתכן של Ca^{2 +} איתותים להפעיל את אנזימי במורד הזרם הספציפי. Ca^{2 +} מאותת מופקים על ידי התיאום בין שני Ca^{2 +} מקורות שונים: Ca^{2 +} זרם מרחב חוץ-תאית, Ca^{2 +} לשחרר רשתית תוך-פלזמית (ER), אשר משמש Ca תאיים^{2 +}לאחסן. משמעותית ייתכן Ca^{2 +} איתות התבנית לזירוז פונקציה תא ספציפי נתמך גם על ידי nanodomains של 10 – 100 מיקרומטר Ca^{2 +} שנוצר באזור Ca^{2 +} ערוצי קרום פלזמה או קרום אר². חשוב, המקור של Ca^{2 +} אותות הוא אחד הגורמים הקריטיים ביותר בקביעת הפלט ביולוגי במורד הזרם. בנוירונים, Ca^{2 +} זרם ושחרור^{2 +}Ca יש מול השפעות על קיבוץ באשכולות של גאמא אמינו בוטירית (GABA)_של קולטנים (GABA_AR)-הסינפסות GABAergic, אשר אחראית על עיכוב של דעתנית עצביים³. Ca^{2 +} זרם מלווה על ידי עירור עצביים מסיבית המניע את הפיזור של אשכולות GABA_AR סינפטית, ואילו Ca מתמידים^{2 +} שחרור מחדר המיון מקדמת את קיבוץ באשכולות של ר'_אגאבא סינפטית. קבוצות אחרות דיווחו גם כי הכיוון כוונון של קונוסים הצמיחה תלויה באופן ביקורתי מקור האות^{2 +}Ca: Ca^{2 +} זרם מעוררת סלידה, בעוד Ca^{2 +} שחרור מנחה את המשיכה של הגידול עצביים קונוס⁴. לכן, כדי להבין באופן מלא את Ca^{2 +} מסלולי שבבסיס פלטי סלולרית ספציפית איתות, חשוב לזהות את המקור של Ca^{2 +} אותות דרך המתאר Ca^{2 +} אותות ברזולוציה subcellular.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים Ca^{2 +} הדמיה שיטה לדווח Ca^{2 +} אותות ברזולוציה subcellular, אשר מאפשר הערכת המקורות Ca^{2 +}אות (איור 1). Ca^{2 +} microdomains מתחת קרום פלזמה בהצלחה המפוקחים על-ידי מקודדים גנטית Ca^{2 +} אינדיקטורים (GECIs) המיועד קרום פלזמה באמצעות ההחזקה של האות קרום פלזמה-לוקליזציה Lck בתוך Src קינאז ל N-טרמיני GECIs⁵. כדי לזהות את Ca^{2 +} אות הדפוס באזור המיון ברזולוציה יותר יכולות, לאחרונה פיתחנו השניה-GCaMP6f, באיזה GCaMP6f⁶ מטרות המיון הממברנה החיצונית, באמצעות טראנסממברנלי את חדר המיון. השניה-GCaMP6f יכול לדווח ברגישות Ca^{2 +} השחרור מחדר המיון ברזולוציה ייתכן טוב יותר מאשר GCaMP6f nontargeted המקובלת ב- COS-7 תאים⁷ ו- HEK293 תאים⁸, על ידי הימנעות פעפוע של Ca^{2 +} ו- GECIs . אנחנו גם אישר כי Ca ספונטנית^{2 +} גובה ב בתרבית האסטרוציטים בהיפוקמפוס שדווחו על-ידי השניה-GCaMP6f הראו דפוס ייתכן שונה בהשוואה זה בפיקוח, ממוקדות קרום פלזמה GCaMP6f (מזל-GCaMP6f)⁷ ^,⁹, המציין כי Ca^{2 +} הדמיה עם השניה-GCaMP6f בשילוב עם מזל-GCaMP6f תורם הקרע של Ca^{2 +} אותות ברזולוציה subcellular לזהות את המקורות שלהם.

תוך זמן קצר, אנו מפרטים את פרוטוקול Ca^{2 +} אות רוברט הלה תאים, תא עצב-אסטרוציט לערבב תרבויות מצופה על coverslips זכוכית דקה. Ca^{2 +} טכניקת דימות עם GECIs שצוין כאן, מזל-GCaMP6f, פלזמה-ממברנה-ממוקד RCaMP2¹⁰ (מזל-RCaMP2), ואת השניה-GCaMP6f (איור 1) חלים על כל התאים בו ניתן לבטא את GECIs האלה.

פרוטוקול

כל הניסויים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת בטיחות RIKEN ועדת ניסויים בבעלי חיים, על פי שזמן שהונפקו על ידי היפנים משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה.

1. הכנת תאים

הכנת פוליפוני (ethyleneimine)-מצופה coverslips
הערה: ציפוי Poly(ethyleneimine) (פיי) מומלצת המנגנון זכוכית, שכן היא מאפשרת נוירונים, האסטרוציטים כדי לצרף בחוזקה coverslips מבלי למנוע את התפתחותם. עם זאת, שיטות ציפוי אחרות (למשל, פולי-ornithine, פוליפוני L-ליזין, laminin ציפוי) זמינים גם, במידת הצורך, זכוכית-התחתון מנות.
1. מקום coverslip זכוכית של 18 מ מ קוטר כל טוב של צלחת 12-. טוב. להכין פתרון פיי 0.04% (צלחת mL/12-ובכן 12.5) באמצעות מים מעוקר.
2. להוסיף 1 מ"ל של 0.04% פיי פתרון טוב לכל. ודא כי ישנם אין בועות מתחת coverslips.
3. דגירה הצלחות בסדרה חממה₂ CO בן לילה ב 37 º C.
4. למחרת, לשטוף את coverslips מצופה 3 x עם 1 מ ל מים מעוקר. להסיר את הפתרון פיי עם העצמות להוסיף 1 מ"ל של מים סטיריליים מכל קידוח, לנער את הצלחת 12-ובכן כך הפתרון פיי בין coverslip את הלוח ניתן לשטוף ביסודיות. כמו שאר פיי הוא רעיל עבור תאים, להבטיח כי המים לאחר כביסה הסופי הוא aspirated לחלוטין.
5. יבש ולחטא את coverslips בתוך המנוע עם אולטרה סגול (UV) אור למשך 15 דקות לפחות. ניתן לאחסן את המנה מצופים פיי ב 4 ° C עד 2 חודשים. להאיר את הכלים עם UV אור למשך 15 דקות לפני השימוש.
6. הוסף 5 מ ל מים מזוקקים סטריליים במרחב שבין הבארות כדי למנוע אידוי של המדיום תרבות.
שורות תאים יופיצ
הערה: פרוטוקול זה מספק דוגמה אחת של תרביות תאים לתוך תאים בתרבית של תאים שורות, כגון הלה תאים ותאים COS-7. המשתמשים יכולים להחיל פרוטוקולים אחרים תרביות תאים שעברו אופטימיזציה עבור הניסויים שלהם. בסעיף זה, נתאר פרוטוקול התרבות התא הלה, אשר גם הוא החלים COS-7 תאים.
1. ביום שלפני תרביות תאים, התרבות התאים לצלחת תרבות 10 ס מ עד ובהישגיות הנהרות 70% – 90%.
2. Prewarm המדיום תרבות (ראה טבלה של חומרים) ל- 37 מעלות צלזיוס.
3. לשטוף את התאים 2 x עם באגירה פוספט תמיסת מלח ללא Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +} (PBS [-]).
4. מחוק לגמרי את PBS(-), להוסיף 1 מ"ל של 0.5% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 s עד ובהישגיות עגול.
5. להוסיף 9 מיליליטר בינוני תרבות prewarmed להפסיק את trypsinization. לדלל את התאים תרבות בינונית ביחס של 1:6.
6. זרע 1 מ"ל של התאים מדולל על coverslips מצופים פיי לוחית 12-. טוב.
הכנת בהיפוקמפוס נוירון-אסטרוציט מעורב תרבות חולדות או עכברים
הערה: סעיפים 1.3 ו 1.4 קודם דורשים בדיקה שאושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה להשתמש ו לציית באופן רשמי שאושר נהלי טיפול ושימוש חיות מעבדה. תרשים הזרימה של פרוטוקול תרבות עצביים מוצג באיור2.
1. להכין את כל ריאגנטים מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית. הנשר של המקום Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) לתוך שני 100 מ מ תרבות מנות (כ 20 מ ל/תבשיל) כי הם במקרר.
2. הכנת 50 מ של המדיום ניתוח מורכב DMEM וחומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 20 מ מ 4 (HEPES) (ראה טבלה של חומרים) ונותנות המדיום 60 מ מ 3 תרבות מנות (כ 7 מ ל/תבשיל), שמונה 35 מ מ תרבות מנות (כ 2 מ ל/תבשיל). מקם את הכלים הקפאה נוספת.
3. הכנת 50 מ ל תמיסת המלח דגירה, המורכבת של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס, בתוספת 20 מ מ HEPES (ראה טבלה של חומרים), ומניחים 8 מ ל תמיסת המלח פנימה צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
4. להכין את המדיום ציפוי בינונית מזערי חיוני (מאמ) בתוספת B-27, גלוטמין ו פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלה של חומרים). לשמור על בינוני בטמפרטורת החדר (20-28 מעלות צלזיוס).
5. לעקר את מכשירי הניתוח עם 70% אתנול.
6. מניחים מגבת נייר בתוך צנצנת זכוכית עם מכסה, 1 מ"ל של איזופלוריין. תן את איזופלוריין להתאדות במשך 1 דקה.
7. במקום עכבר או חולדה בהריון בצנצנת המוכנים לפי שלב 1.3.6 ולשמור את בעל החיים בצנצנת עד זה עמוק. הוא מורדם (כ-30 s כדי 1 דקות).
8. הביאו את החיה anesthetized מצנצנת ולחטא את החיה ואת הציוד לנתיחה על ידי התזת אותם 70% אתנול. לחתוך האמצע הגחון עם פינצטה ומספריים סטנדרטיים ויבתר ולחלץ את הרחם בהריון חולדה או עכבר.
9. לחלץ E18-19 העוברים מן הרחם של מרדימים עכברוש נקבה או העכבר, באמצעות מספריים ויבתר עדין, והניחו העוברים שחולצו עם מלקחיים טבעת אל תוך קר כקרח DMEM בקערה 10 ס מ עבור הרדמה קר.
10. לערוף את העובר עם מספריים לנתיחה בסדר ולמקם את הראש DMEM קר כקרח בקערה 10 ס מ.
11. לחלץ את המוח כל העובר עם מלקחיים Semken 13 ס מ מעוקל, מלקחיים עם טיפים בסדר. שמור את המוח המדיום לנתיחה כקרח בקערה 60 מ מ.
12. להסיר את hippocampi, באמצעות מלקחיים שני טיפים בסדר, במדיום לנתיחה כקרח במנות 35 מ מ ולשמור על הרקמה מבודד בתמיסת המלח הדגירה למקם צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
13. לשטוף את hippocampi בתמיסת דגירה, דגירה טריפסין (1.25 מ"ג/מ"ל), DNase אני (0.25 mg/mL) בתמיסת המלח הדגירה למשך 5 דקות ב 37 º C. אמצעי האחסון הדגירה המומלץ הוא 2.7 מ"ל של תמיסת המלח דגירה, 150 µL של 20 x מניות טריפסין µL 150 x 20 מניות DNase (ראה טבלה של חומרים).
14. לשטוף את hippocampi 3 x בתמיסת הדגירה קר כקרח.
15. ריקון נוזלים מלוחים הדגירה ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום ציפוי המכיל DNase אני (10 µL של פתרון מניות; ראה טבלה של חומרים). להשעות את הרקמה על ידי יותר מ 20 x pipetting ולמדוד את צפיפות התאים קיימא, באמצעות מונה תא Trypan blue וזמינותו.
16. לדלל התאים בהיפוקמפוס צפיפות של 1.4 x 10⁵ קיימא תאים למ"ל על חולדות ו 2.5 x 10⁵ קיימא תאים למ"ל על עכברים. זרע 1 מ"ל של המתלים תא מדולל על גבי coverslips מצופים פיי ב 12-ובכן תרבות צלחות.
17. לשמור על התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה CO2 2-3 ימים.
18. הסר את המדיום ציפוי. אל תתנו את התאים להתייבש. בעדינות ובמהירות להוסיף המדיום תחזוקה prewarmed (ראה טבלה של חומרים).
הכנה של עכברוש קורטיקלית נוירון-אסטרוציט מעורב תרבות תאים קפואים, ואת התחייה המחודשת של התרבויות קפוא
הערה: שיטת הקפאה קריוגנית תאים קורטיקליים היה previously11 המתואר. כאן, מסופק ששונה פרוטוקול שבו תאים קורטיקליים שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 חודשים. תרשים הזרימה עבור פרוטוקול זה מוצג באיור2.
1. להכין DMEM, דיסקציה בינוני, דגירה תמיסת מלח ו ציפוי בינוני כפי שמעידה צעדים 1.3.1–1.3.4, ואת הטבלה של חומרים.
2. להכין המדיום שטיפת היוו של DMEM חום-להשבית את העובר סרום שור, פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלה של חומרים), במידת הצורך.
3. תמצית E18-19 העוברים מן הרחם של מרדימים עכברוש נקבה או העכבר, באמצעות מספריים דיסקציה עדינה, ולהשתמש טבעת מלקחיים כדי למקם את כל העובר שחולצו DMEM קר כקרח עבור הרדמה קר.
4. הסר את השכל של העוברים ולשמור אותם לנתיחה כקרח בינוני. להסיר את cortexes ולתחזק אותם בתמיסת המלח הדגירה למקם צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
5. לשטוף את cortexes בתמיסת דגירה, דגירה של cortexes עם טריפסין (1.25 מ"ג/מ"ל), DNase אני (0.25 mg/mL) בתוך תמיסת מלח הדגירה למשך 5 דקות ב 37 º C. 5.4 מ של תמיסת מלח דגירה, µL 300 של 20 x מניות טריפסין µL 300 x 20 מניות DNase שאמצעי האחסון הדגירה המומלצת עבור 12 cortexes אני.
6. לשטוף את cortexes 3 x בתמיסת הדגירה קר כקרח.
7. הסר את תגובת שיקוע והוסף 2 מ של ציפוי בינוני בתוספת 150 µL של DNase אני מניות. לבטל את התאים על ידי pipetting משיחות פחות מ-20, לסנן את התאים באמצעות מסננת תא עם גודל הנקבוביות של 70 מיקרומטר.
8. לשטוף את מסננת תא עם 20 מ של המדיום ציפוי עבור ציפוי. עבור הכנת מלאי תא קפוא, לשטוף את התאים עם 20 מ של המדיום לשטוף (ראה טבלה של חומרים)
9. מודדים את צפיפות התאים קיימא, באמצעות מונה התא ואת שיטת Trypan blue.
10. לדלל את התאים בקליפת המוח כדי צפיפות של 1.4 x 10⁵ קיימא תאים למ"ל עם המדיום ציפוי ולהוסיף 1 מ"ל של התליה תא מדולל מצופים פיי coverslips לוחית תרבות 12-. טוב.
11. לשמור על התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה₂ CO 2-3 ימים ושנה המדיום תרבות המדיום תחזוקה.
12. לאחר שלב 1.4.9, הכן את המניה סלולרי קורטיקלית קפוא על ידי צריך שתוציאו את התאים ב 187 x g למשך 3 דקות, באמצעות רוטור הנדנדה.
13. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף המדיום הקפאה קריוגנית (ראה טבלה של חומרים) שמרו ב 4 ° C, כדי להשיג צפיפות התאים של עונה 1 פרק 10⁷ תאים/מ ל.... Aliquot 1 מ"ל של התליה תא לתוך צינורות ההקפאה.
14. מקם את הצינורות בתא הקפאה מיכל עם קצב הקפאה של-1 ° C/דקה, עד לטמפרטורה של-80 ° C ולאחר להעביר את מיכל ההקפאה מקפיא-80 ° C. התאים ניתן לאחסן במשך 3 חודשים לפחות ב- 80 ° c
15. להחיות תאים הקפוא, prewarm את שטיפת בינוני (כ 13 מ"ל לכל שפופרת קריוגני) ואת תחזוקה בינונית עבור תאים קורטיקליים קפואים (ראה טבלה של חומרים).
16. להפשיר את התאים קפואות במהירות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
17. לדלל את התאים המופשרים בעדינות עם שטיפת prewarmed בינונית. Centrifuge התאים ב x 187 g למשך 3 דקות, באמצעות רוטור הנדנדה.
18. להשעות את צניפה ב 1 מ"ל של שטיפת בינוני ולמדוד את צפיפות התאים קיימא.
19. לדלל את התאים עם המדיום תחזוקה עבור תאים קורטיקליים קפוא להניב צפיפות התאים של 3.0 x 10⁵ קיימא תאים למ"ל זרע 1 מ"ל של התליה תא לוחית 12-ובכן מצופים פיי.

2. הבעת ממוקדות קרום GECIs

תרביות תאים תאים
1. להוסיף 250 ננוגרם של פלסמיד GECI (קרי, מזל-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 או השניה-GCaMP6f עם CMV יזם)^7,8,9 כדי µL 100 של מדיום מופחת סרום (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב. עבור cotransfection של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f, שימוש 250 ננוגרם של כל פלסמיד ב 100 µL של מדיום מופחת סרום כל היטב.
2. להוסיף 0.5 µL של תרביות תאים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) לכל היטב לתערובת בינוני סרום פלסמיד-מופחתת. Cotransfection של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f, הוסיפו 0.5 µL של תרביות תאים מגיב לכל טוב.
3. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20-28 מעלות צלזיוס).
4. להוסיף 100 µL של התערובת כל coverslip באופן drop-wise.
5. דגירה את התאים עבור 48-72 ש ח בחודש חממה₂ CO ב 37 ° C כדי לאפשר הביטוי של GECIs.
תרביות תאים, זיהום בנגיף adeno-הקשורים של נוירונים בהיפוקמפוס או בקליפת המוח
הערה: תרביות תאים במבחנה 3-5 ימים (DIV) תוצאות תעריף תרביות תאים גבוה של נוירונים. תרביות תאים-6-8 DIV היא עדיפה לביטוי האופטימלי של GECIs ב האסטרוציטים. הביטוי של GECIs בנוירונים תרבות חלופה מועדפת לאחר 9 DIV, הזיהום של הווקטורים adeno-הקשורים וירוס (AAV) מספק יעילות טובה יותר של ביטוי. וקטורים AAV עבור הביטוי של Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 השניה-GCaMP6f תחת EF1a היזמים הוכנו כפי שתואר לעיל, באמצעות HEK293 תאים¹² (ראה טבלה של חומרים).
1. עבור תרביות תאים 3 – 8 ימים לאחר ציפוי, תווית שני צינורות, אחד עבור הדנ א פלסמיד והשני עבור ריאגנט תרביות תאים.
2. להוסיף 50 µL של מדיום מופחת סרום (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב כל שפופרת.
3. להוסיף 0.5 µg של פלסמיד DNA לכל coverslip µL 1 של מוסף בליווי ריאגנט תקנים עבור נוירונים (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב הצינור דנ א פלסמיד. עבור cotransfection של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f, 0.5 µg של כל פלסמיד, µL 1 של תוספת מעורבבים ב- 50 µL של מדיום מופחת סרום לכל טוב.
4. להוסיף 1 µL של תרביות תאים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב בצינור ריאגנט תרביות תאים. כמות זהה של תרביות תאים ריאגנט משמש cotransfection.
5. מערבולת שני צינורות עבור s 1 – 2.
6. להוסיף את התערובת ריאגנט של תרביות תאים (מתוך שלב 2.2.4) לתערובת דנ א (מתוך שלב 2.2.3). לערבב על-ידי pipetting בעדינות, דגירה התערובת (100 µL לכל coverslip) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לטעון את התערובת על התאים באופן drop-wise.
8. דגירה התאים חממה₂ CO 2-3 ימים עד החלבונים סמן באים לידי ביטוי.
9. זיהום AAV, להוסיף 3 µL של AAV לכל טוב התרבות נוירון מעורבת-אסטרוציט. מערבבים בעדינות במוזיקת המנה. בשביל הזיהום כפול של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f, 3 µL של כל AAV הוא הציג לכל טוב. במקרה המספרים של תאים לבטא GECIs אינן מספיקות, הסכום AAV אופטימלית עבור זיהום צריכים להיקבע.
10. לשמור על התרבות במשך 1-2 שבועות עד GECIs באים לידי ביטוי.

3. Ca^{2 +} הדמיה

הדמיה סימולטני של תאים המבטאים מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f
הערה: כדי במקביל להקליט הסימנים Lck-RCaMP2 ו- GCaMP6f השניה, אופטיקה פיצול התמונה נדרשים. האופטיקה מאפשרות ההפרדה של RCaMP2 ו- GCaMP6f והקרנה שלהם על גבי המסגרת הצילום של המצלמה (איור 3 א). הדמיה בו זמנית גם דורש מקורות אור (1) בו זמנית יכול לפלוט אור בכחול (450 – 490 nm) עירור ספקטרה ירוק (500-560 ננומטר), (2) כפול-band מסנן ומראה ודיקרואיק זוהר מגדיר את המיקרוסקופ ו (3) פליטת מסננים עבור RCaMP2 ו GCaMP6f. לקבלת פרטים, עיין בטבלה של חומרים.
1. הפעל את התקני הדמיה ואת מחשבים לפחות 30 דקות לפני ההקלטה. Prewarm המיקרוסקופ חימום לבית 37 מעלות צלזיוס. להגדיר את התקן פיצול התמונה, מסננים, מקור האור. יישר את אופטיקה מפצלת את התמונה כך באותו שדה הראייה מופיע במצלמה. לבחור את העדשה המתאימה אובייקטיבי (ראה טבלה של חומרים).
2. הר coverslip המכילות את התאים transfected עם מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בבית הבליעה הקלטה, להוסיף את המדיום הדמיה המתאימה או מאגר (400 µL על coverslips 18 מ מ) בבית הבליעה, ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ. במקום מכסה על תא הקלטות כדי למנוע האידוי של המדיום.
3. אתר את התאים לבטא Lck-RCaMP2 וגם השניה-GCaMP6f על-ידי הדמיה פלורסנט. מזער את עוצמת האור עירור למניעת photobleaching ו phototoxicity.
4. הסר את המכסה ולהתחיל הקלטה זמן לשגות ב-10 הרץ. במהלך ההקלטה הזאת, מוסיפים אגוניסט תא לעורר תגובות^{2 +} Ca (למשל, היסטמין עבור הלה תאים, ATP עבור COS-7 תאים).
5. לשמור את הנתונים בצילום מואץ של הכונן הקשיח (HDD).
6. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ניתוח התמונה.
הקלטת פעילות ספונטנית של האסטרוציטים לבטא Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f
הערה: ללא פיצול התמונה אופטיקה, ניתן לנטר את האותות^{2 +} Ca ב קרום פלזמה ואת אלו, הסובבים בחדר המיון באותו התא. . כאן, ההקלטה רציפים של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f ב האסטרוציטים זהה המתואר. אובייקטיבית שמן-טבילה עם צוהר מספרית גדולה יותר 1.3 מומלץ מאוד לפעילות^{2 +} Ca ספונטנית.
1. הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה, מקור האור, החימום מיקרוסקופ קאמרית לפחות 30 דקות לפני הקלטה.
2. הר coverslip המכילות את התאים transfected עם מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בבית הבליעה הקלטה ולהוסיף 400 µL של המדיום הדמיה. המקום מכסה על החדר.
3. לבחור את המסנן עבור GCaMP6f, מקור האור (עירור אור, למשל 470– 490 כחול ננומטר; ראה טבלה של חומרים). אתר את האסטרוציטים לבטא השניה-GCaMP6f.
4. בחר ערכת מסנן מקור האור על RCaMP2 (עירור אור, למשל, 510 – 560 nm ירוק; ראה טבלה של חומרים), לאשר אם Lck-RCaMP2 מתבטאת האסטרוציטים אותו. למנוע חשיפה ארוכה מקור האור כדי למנוע photobleaching.
5. הרשומה תמונות בצילום מואץ של Lck-RCaMP2-2 הרץ עבור 2 דק לשמור את הנתונים הדמיה על HDD.
6. שנה את המסנן להגדיר את זה עבור GCaMP6f. הרשומה תמונות בצילום מואץ של השניה-GCaMP6f באותו שדה הראייה, ב 2 הרץ למשך 2 דק לשמור את הנתונים על HDD.
7. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה ניתוח התמונה.
הקלטה ספונטנית פעילות. עצבית ו- Ca המושרה^{2 +} העלאת בנוירונים
הערה: הגדרת מיקרוסקופ עבור הדמיה עצביים הוא זהה לזה המתואר בסעיף 3.2. . הנה, מתואר ההדמיה של Ca^{2 +} העלאת ספונטני עקב Lck-GCaMP6f ו- Ca^{2 +} העלאת המושרה על ידי הפעלת mGluR עקב השניה-GCaMP6f.
1. כדי להקליט ספונטנית פעילות. עצבית, הר coverslip המכילות את התאים לבטא Lck-GCaMP6f בבית הבליעה הקלטה ולהוסיף µL 400 הדימות בינוני. המקום מכסה על החדר.
2. הגדר את המסנן ואת מקור האור (עירור כחול, למשל 470 – 790 ננומטר; ראה טבלה של חומרים) לאלה עבור GCaMP6f. למצוא את הנוירונים לבטא Lck-GCaMP6f, מציג פעילות ספונטנית.
3. לרכוש תמונות ב- 2 הרץ or מהר יותר. לשמור את הנתונים על HDD.
4. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה ניתוח התמונה.
5. כדי להקליט Ca המושרה^{2 +} הגברה, הר על coverslips המכילות את התאים לבטא השניה-GCaMP6f עם 400 µL הדמיה בינוני. המקום מכסה על החדר.
6. באמצעות המסנן עבור GCaMP6f, למצוא את הנוירונים לבטא השניה-GCaMP6f.
7. הסר את המכסה. . תתחיל להקליט זמן לשגות ב 2 הרץ or מהר יותר במהלך ההקלטה, להוסיף את אגוניסטים עבור קולטן Gq-חלבון בשילוב (למשל, mGluR5 אגוניסט [ר'] - 3.5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) כדי לעורר Ca^{2 +} שחרור מחדר המיון.
8. לשמור את תמונות בצילום מואץ על HDD ולנתח את הנתונים.

תוצאות

מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f באו לידי ביטוי בתאים הלה, שני אותות נרשמו בו זמנית באמצעות פיצול התמונה אופטיקה, 24 שעות לאחר תרביות תאים (איור 3 א ו- Video 1). התמונות נרכשו ב- 10 Hz. היסטמין (שלו, 1 מיקרומטר), אשר גורם Ca^{2 +} השחרור מחדר המיון, נוספה במהלך ההקלטה. על היישום שלו, עוצמת האות של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f גדל, כפי שמוצג על ידי הצגת מדומה ΔF/F0, אשר מייצג את השינוי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הראשונית (איור 3B). הקורסים זמן של Ca^{2 +} העלאת רמת הרשאות (ΔF/F0) דיווחו על ידי מזל-RCaMP2 השניה-GCaMP6f הושוו באזור באותו עניין (ROI) (איור 3C). הערכים ΔF/F0 היו מנורמל לערכי שיא כדי לאפשר זמן הקורס ההשוואה בין שני GECIs שונים, אשר יש רמות ביטוי שונה, הפצות. שני חיישנים דיווח תנודה דמוי Ca^{2 +} גובה. מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f הראו באותו מסלול הזמן להעלאה^{2 +} Ca בשני תאים בין תא חמש בחן (איור 3C, רועי 1 ו- 3). עם זאת, Ca^{2 +} הגבהים שמוצג על ידי מזל-RCaMP2 נשאר ברמה גבוהה יותר לעומת המוצג על-ידי השניה-GCaMP6f (איור 3 C, רועי 2, 4 ו- 5). התוצאות מצביעות על כך Ca^{2 +} גובה מוארך בקרבת קרום פלזמה, בעוד שהסתיים קודם לכן סביב חדר המיון, אשר הוא המקור של Ca^{2 +} האות הזה המושרה על ידי גירוי שלו.

Ca ספונטנית^{2 +} האותות האסטרוציטים בתוך הנוירון-אסטרוציט מעורב תרבות של עכברוש hippocampi (איור 4A) ו cortexes (איור 4B) הוצגו על ידי מזל-RCaMP2 השניה-GCaMP6f (איור 4, סרטון 2, וידאו 3 , וידאו 4, וידאו 5). תרבויות קורטיקלית היו לתחייה מן המלאי קפואים זה הוכן כפי שמתואר פרוטוקול זה. אותות Lck-RCaMP2 ו- GCaMP6f השניה נרשמו ברצף ב 2 הרץ את התאים אותו. ROIs שלושה היו שנבחרו באזור הראה Ca^{2 +} העלאת על ידי כל GECI, מהלך הזמן של ΔF/F_הבסיס (קרי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית) משתנה מעוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע בתקופת הקלטת כולה (נ_בסיס). כאשר הבסיס הוא יציב Ca^{2 +} הגבהים שכיחים פחות, F_הבסיס הופכת תוכנית בסיסית שימושית לזיהוי Ca^{2 +} העלאת אירועים. Ca ספונטנית^{2 +} הגבהים היו גלויים רק את תהליך astrocytic, לא כלפי גוף התא. התוצאה זו עקבית עם הדוחות הקודמים astrocytic ספונטנית Ca^{2 +} אותות על ידי אחרים GECIs במבחנה מטמיעים¹³ , ויוו¹⁴. האסטרוציטים בהיפוקמפוס והן קורטיקלית, Ca^{2 +} הגבהים שמוצג על ידי מזל-RCaMP2 (למעלה) היו תכופים יותר מאלו המוצגות על-ידי השניה-GCaMP6f. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם ההדגמה. הקודם שלנו כי Ca^{2 +} הגבהים ב האסטרוציטים עקב Lck-GCaMP6f אותרו בתדירות גבוהה יותר מאשר אלה בשל השניה-GCaMP6f⁷ , מציע כי מושג זה הוא גם ישים- רמת תא בודד.

ספונטני Ca^{2 +} הגבהים ידי Lck-GCaMP6f בלא בוגר החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס (10 DIV) נראו ב 2 הרץ (איור 5 א ווידאו 6). הקורסים זמן של ΔF/F0 ב חמש ROIs שונים מראים כי Ca^{2 +} הגבהים אלה נכלאים באופן מקומי לתחומים subcellular. איור 5B (וידאו 7) מראה Ca^{2 +} התגובות עכבר בוגר נוירונים בהיפוקמפוס (30 DIV) נגוע השניה-GCaMP6f-ביטוי AAV וקטורים. נוירונים היו מגורה עם 100 מיקרומטר DHPG, אשר הוא אגוניסט עבור metabotropic רצפטורים גלוטמט, גרימת Ca^{2 +} שחרור. DHPG-induced Ca^{2 +} לשחררו בשל השניה-GCaMP6f זוהה.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה המציגה ממוקדות ממברנה GECIs. תרשים סכמטי של קרום פלזמה, ממוקדות GECIs (מזל-GCaMP6f ו- Lck-RCaMP2), חדר המיון החיצוני ממברנה במיקוד GCaMP6f (השניה-GCaMP6f).

figure-results-2
איור 2: תרשים זרימה עבור תאים בהיפוקמפוס ואת קורטיקלית הכנה, תרביות תאים פלסמיד AAV זיהום. הדימויים מיקרוסקופיים נציג, טרי מצופה DIV-6 קורטיקלית תאים (משמאל), קם לתחייה תאים מן המלאי קפואים (מימין). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: דוגמה של ההדמיה סימולטני של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בתאים הלה. (א) ייצוג סכמטי של האות ההפרדה עם פיצול התמונה אופטיקה. שדה הראייה באותו מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f במקביל מוקרן על המצלמה. הקלטה נציג שרכשה ב-10 הרץ מצלמת CMOS מסופק 1 וידאו, תמונה אחת מתוך הקלטה זו מוצג בחלונית A (מימין). (B) תמונות צבע מדומה של ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (למעלה), השניה-GCaMP6f (למטה). היסטמין (שלו, 1 מיקרומטר) נוספה ב 0-ס' (C) נציג מסלול הזמן ΔF/F0 המנורמל של Lck-GCaMP2 (מגנטה), השניה-GCaMP6f (ירוק). הנתונים היו מנורמל לערך ΔF/F0 המרבי עבור כל מגרש. שהפסים לציין את התזמון של היישום שלו. הנתונים נותחו עם תוכנה בהזמנה אישית TI עבודה, שעליו מונחים¹⁵. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: ספונטני Ca^{2 +} העלאת ברמת האסטרוציטים פיקוח לביטוי Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f. (א) נציג בהיפוקמפוס, האסטרוציטים בקליפת המוח (B) transfected עם מזל-RCaMP2 (למעלה), השניה-GCaMP6f (למטה). תאים קורטיקליים היו לתחייה מתרבויות מניות קפוא. Lck-RCaMP2 ותמונות השניה-GCaMP6f נרכשו ברצף באותו תא, ב 2 הרץ, עם מצלמה EM-CCD. החלקות בתכנית השמאלי הקורסים זמן של ΔF/Fbase נמדד ROIs מצוינת בתמונה מיקרוסקופית. הנתונים נותחו עם TI עבודה, שעליו מונחים. סרטים בפועל הינם מסופקים בכל סרטון 2, 3 וידאו, וידאו 4ו- 5 וידאו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית). הסחף בסיסית מציע את השינויים ב- Ca^{2 +} ברמה הגלובלית בתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5: דוגמאות של Ca^{2 +} הדמיה בנוירונים עם מזל-GCaMP6f, השניה-GCaMP6f. (א) נציג עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס לבטא Lck-GCaMP6f ב- 10 DIV (משמאל) וחלקות מציג הפעם קורסים של ΔF/F0 נמדד על ROIs (מעגלים צהובים) כבר ציינו כי בתמונה (מימין). המספרים מסלול הזמן תואמים למספרים רועי בתמונה. שימו לב כי התבנית הטמפורלי של Ca^{2 +} העלאת שונה בין האזורים השונים של ריבית. הסחף בסיסית מרמזת על עליית Ca^{2 +} ברמה הגלובלית בנוירונים הזה. (B) דוגמה של עכבר בוגר נוירונים בהיפוקמפוס (DIV 30) נגוע השניה-GCaMP6f ביטוי AAV וקטורים (משמאל). הזמן קורס עלילת של ΔF/F0 נמדד מציגה את Ca^{2 +} בתגובה 100 מיקרומטר (RS) - 3.5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) להחיל על התזמון המוצגות על-ידי השורה האפורה. עיגולים צהובים מראים את המיקום של ROIs איפה מסלול הזמן הושג. התמונות היו רכשה 2 הרץ עם מצלמה מקורר-CCD (לוח א') או מצלמת EM-CCD (לוח ב') וניתח עם TI עבודה, שעליו מונחים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
וידאו 1: דוגמה של הדמיה סימולטני של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בתאים הלה. הקלטה נציג רכשה ב-10 הרץ, המוצג באיור3. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-7
וידאו 2: ספונטני Ca^{2 +} ארעי שנצפתה ב- Lck-RCaMP2 אסטרוציט hippocampal. נציג הקלטה רכשה 2 הרץ (איור 4A), נרשמו באותו שדה הראייה כמו וידאו 3. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-8
וידאו 3: ספונטני Ca^{2 +} ארעי שנמדדו השניה-GCaMP6f ב אסטרוציט hippocampal. הקלטה נציג רכשה 2 הרץ (איור 4A), בתוך שדה הראייה אותו כ- 2 הסרטונים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-9
וידאו 4: Ca ספונטנית^{2 +} ארעי שנצפתה ב- Lck-RCaMP2 אסטרוציט בקליפת המוח נציג הקלטה רכשה 2 הרץ (איור 4B), נרשמו באותו שדה הראייה כמו וידאו 5. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-10
וידאו 5: ספונטני Ca^{2 +} ארעי שנמדדו השניה-GCaMP6f ב אסטרוציט קורטיקלית. הקלטה נציג רכשה 2 הרץ (איור 4B), בתוך שדה הראייה אותו כ- 4 וידאו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-11
וידאו 6: דוגמה Ca^{2 +} הדמיה של נוירון בהיפוקמפוס עכברוש (DIV 10) מאת מזל-GCaMP6f. דוגמה של Ca עצביים^{2 +} מאותת להקליט 2 הרץ (איור 5A). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

figure-results-12
וידאו 7: Ca^{2 +} שחרור העכבר בהיפוקמפוס נוירון (DIV 30) המבטאת השניה-GCaMP6f. דוגמה של Ca^{2 +} אותות עצביים טלקוה העכבר נוירון בהיפוקמפוס נגוע השניה-GCaMP6f ביטוי AAV וקטורים (איור 5B). הנוירון זורז עם 100 dihydroxyphenylglycine מיקרומטר (DHPG) חלה בגיל 30 s כדי לעורר Ca^{2 +} השחרור מחדר המיון. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

דיון

מגוון ביולוגי פלטי מבוצעים על ידי Ca^{2 +} אותות. Ca^{2 +} הוא שליח איתות תאיים רב-תכליתי. פענוח Ca^{2 +} אותות כדי לעורר את תפוקות ספציפיים כבר שאלה ביולוגית בסיסית, Ca^{2 +} הדימות לתאר את המגוון של Ca^{2 +} אותות נדרשים. פרוטוקול מפורט כיום מאפשרת הגילוי של Ca^{2 +}אותות ברורים קרום פלזמה ואר (איור 3 ו- 4 באיור), רשות מקומית^{2 +} microdomains בתוך תא (איור 4 , איור 5). זה תורם המתארת את המגוון של Ca^{2 +} אותות תאיים. הפתרון הזמני של Ca^{2 +} מאותת היה שיפור גם על ידי מיקוד GECIs קרום פלזמה, ER, כי זה יכול למנוע את השפעת דיפוזיה תלת מימדי של Ca^{2 +} , GECIs את עצמם, ויש לו את היכולת לזהות רגע של Ca^{2 +} זרם או Ca^{2 +} שחרור, אשר מתרחשת על הקרום.

הפרוטוקול יש מספר מגבלות. למשתמשים יש לזכור כי האותות שזוהו הן הסיכום של "רגע של Ca^{2 +} זרם או שחרור" ומתפזרת "Ca^{2 +} החוצה מן המקור^{2 +} Ca מקורי", במיוחד עבור Ca גדולים^{2 +} אותות. לדוגמה, למרות שלו גירוי בתאי הלה מעורר Ca^{2 +} שחרור מחדר המיון, רשות האישורים הנובעת שלו^{2 +} אותות מזוהים לא רק על ידי מיון, ממוקדות השניה-GCaMP6f, אלא גם על ידי פלזמה-ממברנה-ממוקד Lck-RCaMP2 (איור 3). מגבלה נוספת היא כי ייתכן קמע תבנית התנועה של Ca^{2 +} אותות לא ייתכן ה דטרמיננטה היחידה של הפלט של Ca^{2 +} אותות. חלוקת אפקטור במורד הזרם חלבונים (כגון Ca^{2 +}-kinases תלויים ו phosphatases) יכול להיות גם קביעת פקטור². לפענח לגמרי את Ca^{2 +} אותות תאיים, ניתוח התנהגות אנזים במורד הזרם, אשר אינו מכוסה ב פרוטוקול זה, הוא הכרחי.

אחד ההיבטים הקריטיים ביותר עבור Ca מוצלחת^{2 +} הדמיה הוא הרכישה וההתקנה תמונת הדמיה תנאים, כמו גם לגבי לימודי הדמיה לחיות אחרות. בעבר הראינו כי Ca^{2 +} תגובות בתא הן תלויות במידה רבה על משך ועוצמת של עירור ועל תנאי רכישת התמונה, כולל חשיפה הזמן ורכישת תדירות¹⁶. עירור תאורה כוח הוא הגורם הקריטי ביותר, זה יכול לגרום רעילות אור ו- photobleaching של GECIs. צריך להיות מוטבת התנאים הקלטה של זמן החשיפה, הקלטה תדר, עוצמת האור עירור ומשך של הקלטה לפי מטרת הניסוי. מומלץ להפחית את זמן החשיפה ואת עוצמת האור עירור ככל האפשר להימנע photobleaching, phototoxicity אל התא. תדירות הקלטה ושל משך ההקלטה צריך להספיק לסקר את Ca^{2 +} העלאת הריבית אבל יש להשאירו נמוך ככל האפשר להימנע גם photobleaching ו- phototoxicity. אנו ממליצים קביעת תדירות הקלטה ומשך קודם ומיטוב עוצמת האור וזמן החשיפה כך photobleaching של GECIs ממוזער. גורם חשוב נוסף הוא רמת הביטוי GECIs. GECIs יש Ca^{2 +}-אגירה אפקט כפי שהם Ca^{2 +}-מחייב חלבונים. לכן, ביטוי של GECIs יוצרת חציצה של Ca^{2 +}, אשר הכרחי מבחינה פיזיולוגית עבור התאים. כמות GECI הביטוי צריך להיות ממוזער כדי להימנע הדמיה התאים לבטא כמויות גבוהות של GECIs.

לסיכום, ניתוח Ca^{2 +} אותות ברזולוציה subcellular הוא אחד הצעדים החשובים ביותר עבור פענוח סי אי^{2 +} אותות תאיים הקובעות את התופעה הביולוגית של פלט. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה עבור ניתוח Ca^{2 +} אותות כדי לתאר את הגיוון בין האותות האלה. עד מהרה, בטכניקה זו הוא מוגבל עבור ניסויים במבחנה. עם זאת, מזל-GCaMP6f נמצא כבר בשימוש עבור Ca^{2 +} הדמיה ויוו עכברים¹⁷, השניה-GCaMP6f אושרה לפקח Ca^{2 +} אותות ויוו בנוירונים מנוע וי ב- C. elegans7. לכן, מיקוד GECIs בתוך התא subcellular יש פוטנציאל להיות מורחבת ויוו הדמיה בעתיד, ובכך ולאפשר Ca^{2 +} לנתיחה ויוו.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: יפן ומדעי הטכנולוגיה סוכנות (JST) / Precursory מחקר עבור עובריים מדע, טכנולוגיה (אוטם) (JPMJPR15F8, יפן); החברה יפן לקידום המדע (JSPS) / מעניק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), טקדה קרן. המחברים תודה Haruhiko Bito (אוניברסיטת טוקיו) על מתן RCaMP2 ו ארתור J.Y. הואנג, תומאס מקיו (RIKEN CBS) למתן AAV וקטורים ולקבלת הוראות לגבי AAV הכנה. המחברים רוצה גם להודות עורכים-יומן של דמיינו הניסויים על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה.

חומרים

₂

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	#0342
0.5% DNase I תמיסת מלאי	Sigma-Aldrich	#11284932001	הכן 0.5% DNase I (w/v) בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס בתוספת 120 מ"מ MgSO₄. הכן 160 ומיקרו; L aliquots ומאחסנים ב -30 & מעלות צלזיוס.
0.5% תמיסת טריפסין-EDTA	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 מ"מ L-גלוטמין (ופעמים; 100 מלאי)	תרמו פישר סיינטיפיק	#25030081	הכנת מכסות קטנות של 250-750 ומיקרו; L ואחסן ב-30 מעלות צלזיוס.
100 מ"מ נתרן פירובט (ופעמים; 100 מלאי)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 מ"ל) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, ניתן לשמור על התמיסה ב-4 מעלות; C למשך חודשיים.
12-Well צלחות תרבית מרובות בארות עם מכסה אידוי נמוך	Falcon	#353043	מכסה אידוי נמוך הוא קריטי לטיפוח תרבית מעורבת של נוירונים-גליה. עבור תאי קו תאים, ניתן להשתמש בכלי תרבית אלטרנטיביים.
כיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ	קארל הכט "מסייע"#	41001118	עובי 1, כיסוי עגול בקוטר 18 מ"מ; ניתן להשתמש בכיסויים חלופיים.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7.2-7.6
2.5% תמיסת מלאי טריפסין (ופעמים; 20 מלאי)	סיגמא-אולדריץ'	#T4674	הכן 150 ומיקרו; L aliquot ומאחסנים ב -30 & מעלות צלזיוס.
תמיסת 50% פולי (אתילנימין) (PEI)	סיגמא-אולדריץ'	#P3143	הכן 2% (V/V) תמיסת מלאי PEI (וזמנים; 50) עם מים מזוקקים מעוקרים על ידי סינון. חנות פתרון מלאי ב-30 מעלות; C לאחר הכנת מכסות קטנות של 250-750 µ L. הכן תמיסת PEI 0.04% עם מים מזוקקים ביום ציפוי הכיסוי.
70% אתנול			נשמר בבקבוק ריסוס לשימוש לחיטוי פני השטח.
ניתן להכין וירוס הקשור לאדנו (AAV) עבור ביטוי Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ו-OER-RCaMP2 בהנחיית מקדם			AAV באמצעות מערכת AAV Helper Free System (Agilent Technologies) ותאי HEK293, או שיטות חלופיות. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 ו- pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f זמינים לפי בקשה.
תוסף B-27 (ופעמים; 50 מלאי)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	ניתן להחליף את זה בתוסף B-27 פלוס (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) או MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	יפן SLC, בע"מ
מצלמה להקלטת			המצלמות הבאות היו זמינות לשימוש: מצלמת CCD מקוררת (למשל, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD (למשל, Hamamatsu Photonics, ImagEM; אנדור, iXon) או מצלמת CMOS (למשל, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
מיכל הקפאת תאים	Sarstedt K.K.	#95.64.253	ניתן להשתמש במיכל הקפאת תאים חלופי.
מסננת תאים	Falcon	#352350
חממת			שמור על 37 מעלות; C, 5% CO₂.
צינור קריוגני	Corning	#430661	ניתן להשתמש בצינורות קריוגניים חלופיים.
מדיום שימור הקפאה	Zenoaq		"CELLBANKER1"
מדיום תרבית (לתאי HeLa)			מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום, ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי: פניצילין 100 U/mL וסטרפטומיצין 100 ומיקרו; g/mL)
מדיום דיסקציה			מיליליטר אחד של 1 M HEPES (ריכוז סופי 20 מ"מ) עד 49 מ"ל DMEM
DMEM	Nacalai	#08456-65	ניתן להשתמש ב-DMEM חלופי.
DMEM	Nacalai	#08456-65
מגיב טרנספקציה של DNA	גלוקוז Sigma-Aldrich	#6366244001	"X-tremegene HP transfection reagent" ניתן להשתמש בריאגנטים חלופיים לטרנספקציה.
צנצנת זכוכית עם מכסה			, צנצנת 500 מ"ל (לעכבר) או צנצנת 1,500 מ"ל (לעכברוש) להרדמת בעל החיים
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS ללא סידן ומגנזיום
סרום בקר מומת בחום	Thermo Fisher Scientific	#10100147
תאי	HeLa RIKEN BioResource Center	#RCB0007
היסטמין	סיגמא-אולדריץ'	#H7125
תוכנת			ניתוח תמונותכגון Metamorph (התקנים מולקולריים), ImageJ (NIH) ו-TI Workbench14 (בהתאמה אישית)
אופטיקה לפיצול תמונה	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
אופטיקה לפיצול תמונה מראה דיכרואית	Semrock	#FF560-FDi01-25 ופעמים; 36	להפרדת חלבון פלואורסצנטי ירוק / חלבון פלואורסצנטי אדום אות (GFP/RFP)
מסנני פליטת אופטיקה לפיצול תמונה	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	לפליטת אות GFP/RFP, בהתאמה
מדיום הדמיה ומאגר			השתמש במדיום או מאגר אופטימלי לניסוי. כאשר משתמשים במדיום, רצוי מדיום ללא אדום פנול כדי להפחית את הקרינה ברקע. הוסף 20 מ"מ HEPES כדי לשמור על pH מחוץ לחממת CO₂.
דגירה של מי מלח			הוסף 1 מ"ל של 1 M HEPES (20 מ"מ) למיקרוסקופ
		פלואורסצנטי	כגון IX73 (אולימפוס) או Eclipse TI (Nikon Instech)
איזופלורן	פייזר		משמש להרדמה
מדיום תחזוקה (ל-4 ופעמים; 12 מנות באר)			48.5 מ"ל מדיום נוירו-בזאלי-A בתוספת 1 מ"ל B-27, 500 ומיקרו; L של ציר L-גלוטמין ו-25 ומיקרו; L תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין.
אמצעי תחזוקה לתאי קליפת המוח הקפואים (ל-1 ופעמים; 12 כלי באר)			12.2 מ"ל נוירובזאלי פלוס בינוני בתוספת 250 ומיקרו; L B-27, 125 ומיקרו; L של ציר L-גלוטמין ו-6.2 ומיקרו; L תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין.
MEM (מדיום חיוני מינימלי)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
סט מסנני מיקרוסקופ להדמיית GCaMP6f	מסנן מתאים ל-GFP (עירור, 480 ו-plusmn; 10 ננומטר; פליטה, 530 ו-plusmn; 20 ננומטר)

ערכות מסנני מיקרוסקופ להדמיה כפולה של RCaMP2 ו-GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25 ופעמים; 36, #FF01-512/630-25	מסנן עירור כפול, מראה דיכרואית כפולה ומסנן פליטה להדמיית GFP/RFP.
		חימום מיקרוסקופ	מערכת חימום לשמירה על תאים ב-37 מעלות; C במהלך ההדמיה. כדי למנוע סחיפה הנגרמת על ידי התפשטות תרמית, מומלץ להשתמש במערכות חימום המכסות את כל המיקרוסקופ עצמו (למשל, Tokai Hit, Thermobox).
מקור אור מיקרוסקופ לעירור			מנורת כספית (100 וואט), מנורת קסנון (75 וואט), מערכת תאורת דיודה פולטת אור (LED) (למשל, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., מקור LED ב-4 אורכי גל; Lumencor, מנוע אור SPECTRA X). במקרה של גוש כספית ומנורת קסנון, השתמש במסנן ND כדי להפחית את עוצמת העירור.
		מיקרוסקופ אובייקטיבית	תכנית-אפוכרומט מטרת טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה מ-1.3 מומלצת מאוד לתיעוד פעילות Ca²⁺ ספונטנית בנוירונים ואסטרוציטים.
ניתן להשתמש ב-Neurobasal פלוס בינוני	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) במקום במדיום Neurobasal-A.
PBS(-): תמיסת מלח עם חוצץ פוספט ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺	Fujifilm Wako Pure Chemical Collaboration	#164-23551	היעדר Ca²⁺ ו-Mg²⁺ הוא קריטי כדי לא לעכב את פעילות הטריפסין. ניתן להשתמש בחלופה ל-PBS(-).
		לרכישת מחשבים ותמונות	כגון Metamorph (התקנים מולקולריים); מיקרו-מנג'ר; TI Workbench¹⁴.
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין	Thermo Fisher Scientific	#15140122	פניצילין 10,000 יח'/מ"ל וסטרפטומיצין 10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל
פלסמיד לביטוי Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ו-OER-RCaMP2 תחת מקדם ציטומגלווירוס ^7-9			זמין על פי בקשה
מדיום ציפוי (ל-4 ופעמים; 12 מנות באר)			48 מ"ל MEM בתוספת 1 מ"ל B-27, 500 ומיקרו; L מלאי L-גלוטמין (ריכוז סופי: 2 מ"מ), 500 ומיקרו; L של מלאי נתרן פירובט (1 מ"מ) ו-25 ומיקרו; L תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין 5 יח'/מ"ל, סטרפטומיצין 5 ומיקרו; גרם/מ"ל). ריכוז זה של פניצילין-סטרפטומיצין, שהוא 1/20 של הריכוז המומלץ על ידי היצרן, הוא קריטי להישרדות עצבית.
תא הקלטה	Elveflow	Ludin Chamber	תא הקלטה זה מיועד לכיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ.
מדיה מופחתת בסרום	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
סטריאומיקרוסקופ			המשמש לניתוח היפוקמפוס. אולימפוס SZ60 או סטריאומיקרוסקופים מקבילים זמינים.
		כירורגיים	מספריים סטנדרטיים לחיתוך בטן של עכבר או חולדה, פינצטה לחיתוך הרחם, מספריים עדינים לחיתוך הרחם וראש העובר, מלקחיים טבעתיים לצביטת העוברים, מלקחיים מעוקלים של סמקן 13 ס"מ (Fine Science Tools #11009-13) לחילוץ מוח, 3 מלקחיים עם קצות עדינים (דומונט אינוקס #5)
מגיב טרנספקציה לנוירון	תרמו פישר מגיב מדעי	#L3000008	"ליפופקטמין 3000". הוא מורכב מ"התוסף (P3000)" שיש לערבב עם DNA פלסמיד בשלב 2.2.3, ו"מגיב טרנספקציה (ליפופקטמין 3000)" המשמש בשלב 2.2.4.
טריפאן כחול (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
מדיום שטיפה לתאי קליפת המוח הקפואים			25 מ"ל DMEM, בתוספת 250 ומיקרו; L סרום בקר עוברי מומת בחום + 12.5 ומיקרו; L פניצילין סטרפטומיצין.
חולדות Wistar	יפן SLC, Inc		חולדות בהריון (E18)

ניתן לאחסן את EF1a תמונה מיקרוסקופית CO נמוך הפוך HBSS 49 מ"ל סט מסנני מיקרוסקופ להדמיית RCaMP2 מסנן מתאים ל-RFP (עירור, 535 ו-plusmn; 50 ננומטר; פליטה, מעבר ארוך 590 ננומטר)מערכת עדשת תוכנות מכשירים

מקורות

Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

OER GCaMP6f Lck RCaMP2 Time lapse