אינדוקציה ואפיון של יתר לחץ דם ריאתי בעכברים באמצעות מודל Hypoxia/SU5416

סיכום

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה של יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים בהתבסס על החשיפה להיפותוקסיה והזרקת אנטגוניסט קולטן VEGF. בעלי החיים לפתח PH וחדר ימין (RV) היפרטרופיה 3 שבועות לאחר החניכה של הפרוטוקול. כמו כן מוצג האפיון הפונקציונלי והמורפומטרי של המודל.

תקציר

יתר לחץ דם ריאתי (PH) הוא מצב פתופיזיולוגי, המוגדר על ידי לחץ עורקי ריאתי ממוצע העולה על 25 מ"מ Hg במנוחה, כפי שהוערך על ידי צנתור הלב הימני. קשת רחבה של מחלות יכולה להוביל ל-PH, שונה באטיולוגיה שלהם, היסטופתולוגיה, מצגת קלינית, פרוגנוזה, ותגובה לטיפול. למרות התקדמות משמעותית בשנים האחרונות, PH נשאר מחלה לא מאובטחת. הבנת המנגנונים הבסיסיים יכולה לסלול את הדרך לפיתוח טיפולים חדשים. מודלים של בעלי חיים הם כלי מחקר חשובים להשגת מטרה זו. נכון לכך, קיימים מספר דגמים זמינים לסיכום PH. פרוטוקול זה מתאר דגם PH עכבר שתי פגעות. הגירויים לפיתוח PH הם היפוקסיה והזרקה של SU5416, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) קולטן אנטגוניסט. שלושה שבועות לאחר החניכה של Hypoxia/SU5416, בעלי חיים לפתח שיפוץ כלי דם ריאתיים מחקה את השינויים ההיסטופתולוגיים שנצפו PH האנושי (בעיקר קבוצה 1). שיפוץ כלי דם במחזור הדם הריאתי תוצאה של שיפוץ החדר הימני (RV). ההליכים למדידת לחצים RV (באמצעות שיטת החזה הפתוח), ניתוחים מורפומטריים של RV (על ידי ניתוח ושקילה הן חדרי הלב) ואת ההערכות היסטולוגיות של האיחוי (הן ריאות על ידי הערכת שיפוץ כלי דם ולב על ידי הערכת היפרטרופיה קרדיומיוציט RV ופיברוזיס) מתוארים בפירוט. היתרונות של פרוטוקול זה הם האפשרות של היישום הן בסוג פראי והן בעכברים מהונדסים גנטית, יישום קל יחסית בעלות נמוכה, ואת הפיתוח המהיר של המחלה של עניין (3 שבועות). מגבלות של שיטה זו הן כי עכברים אינם מפתחים פנוטיפ חמור PH הוא הפיך עם החזרה נורמוקסיה. מניעה, כמו גם מחקרי טיפול, ניתן ליישם בקלות במודל זה, ללא צורך במיומנויות מתקדמות (בניגוד למודלים מכרסמים כירורגיים).

מבוא

יתר לחץ דם ריאתי (PH) הוא מצב פתופיזיולוגי, המוגדר על ידי לחץ עורקי ריאתי ממוצע (הרשות הפלסטינית) העולה על 25 מ"מ Hg במנוחה, כפי שהוערך על ידי צנתור^{הלב הימני 1,,2}. יש מגוון רחב של מחלות שיכולות להוביל לPH. בניסיון לארגן את התנאים הקשורים ל-PH, פותחו מספר מערכות סיווג. הסיווג הקליני הנוכחי מסווג את מספר מחלות הקשורות ל-PH ב-5 קבוצות שונות¹. הבחנה זו היא בעלת חשיבות מאחר שלקבוצות שונות של חולים יש מחלות השונות במצגת הקלינית שלהם, פתולוגיה, פרוגנוזה,^{ותגובה לטיפול 2}. טבלה 1 מסכמת את הסיווג הנוכחי, לצד המאפיינים ההיסטופתולוגיים הבסיסיים של כל מחלה.

טבלה 1: מבט כולל על הסיווג הקליני של PH, יחד עם התכונות ההיסטופתולוגיות העיקריות בתוך הקבוצות. התאמה של פרוטוקול Hypoxia/SU5416 עבור מידול PH. טבלה זו שונה^{מ- 19}. PH: יתר לחץ דם ריאתי, PAH: יתר לחץ דם עורקי ריאתי

למרות התקדמות משמעותית בטיפול במחלות PH הקשורות, PH עדיין נשאר ללא תרופה, עם שיעור תמותה של 3 שנים הנע בין 20% ו 80%³. זה מצביע על הצורך ההכרחי להבנת המנגנונים הבסיסיים של PH ולאחר מכן, פיתוח של טיפולים חדשניים כדי למנוע, להאט את ההתקדמות, ולרפא את המחלה. מודלים של בעלי חיים הם בעלי חשיבות מכרעת להיקף זה. כיום קיימים מודלים שונים ללימוד PH. הקורא המעוניין מכונה ביקורות מצוינות בנושא זה^2,3,4. בהתחשב במגוון המחלות המובילות ל-PH, ברור כי התנאים המגוונים של PH אנושי לא ניתן לדגמן באופן מושלם במודל אחד של בעלי חיים. ניתן לסווג את דגמי בעלי החיים הזמינים ב- i) להיט יחיד, ii) שני להיטים, iii) נוקאאוט, ו- iv) דגמי דיכוי יתר³. במודלים חד-להיט, PH מושרה על ידי גירוי פתולוגי יחיד, בעוד מודלים שני להיטים לשלב שני גירויים פתולוגיים במטרה לגרום PH חמור יותר ובכך לחקות מקרוב יותר את המחלה האנושית המורכבת. מלבד ההבדלים האטיולוגיים, הגירויים הממספרים גורמים להבדלי מידול PH התלויים גם במין וברקע הגנטי של בעלי^{החיים 4}.

אחד הדגמים הנפוצים ביותר של מכרסמים PH קלאסי הוא מודל היפוקסיה^{כרונית 2.} היפוקסיה ידועה לגרום PH בבני אדם, כמו גם במספר מינים של בעלי חיים. היפוקסיה יש את היתרון של להיות גירוי פיזיולוגי עבור PH (טבלה 1). עם זאת, בעוד מידת ההיפוקסיה המשמשת לזיכוך PH מכרסמים היא הרבה יותר חמורה מאשר בבני אדם, העלבון היחיד (היפוקסיה) מוביל רק לצורה קלה של איחוי כלי דם. זה לא מחקה את חומרת המחלה האנושית. התוספת של להיט שני, גירוי נוסף לזיכוך PH, הראה תוצאות מבטיחות: הזרקת SU5416 המתחם למכרסמים בשילוב עם הגירוי hypoxic גורם פנוטיפ PH חמור יותר^2,,5,6. SU5416 הוא מעכב של קולטן גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) 2. זה חוסם את קולטני VEGF ומוביל אפופטוזיס תא אנדותל. בתנאים היפוקסיים, זה מגרה את ההתפשטות של תת קבוצה של תאים אנדותל עמידים אפופטוזיס. יתר על כן, SU5416 מוביל להתפשטות חלקה של תאי שריר. השילוב של תופעות אלה גורם לשיפוץ כלי דם פתולוגיים של מחזור הדם הריאתי ומוביל ללחץ מוגבר של הרשות הפלסטינית ולשיפוץ החדר^{הימני 2,,5,,7}. המודל תואר לראשונה בחולדות^{6 ומאוחר} יותר הוחל על עכברים^4,5,7. מודל העכבר מציג שיפוץ כלי דם פחות חמור בהשוואה לחולדות. יתר על כן, כאשר חזר normoxia, PH ממשיך להתקדם בחולדות, בעוד בעכברים זה הפיך חלקית.

הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים עבור מידול PH בעכברים באמצעות השיטה Hypoxia/SU5416 (תכנון, ציר זמן, ביצוע). בנוסף, האפיון של המודל מתואר בפרוטוקול זה: פונקציונלית (על ידי מדידה פולשנית של לחץ החדר הימני (RV) באמצעות טכניקת החזה הפתוח), מורפומטרית (על ידי ניתוח ושקילה הן את החדר הימני והן את החדר השמאלי), כמו גם היסטולוגית (על ידי הערכת שיפוץ כלי דם ריאתיים, היפרטרופיה קרדיו-רירית ימין ופיברוזיס).

כל השלבים והשיטות המתוארים בפרוטוקול זה יכולים להיות מיושמים בקלות על ידי חוקרים בכל רמת ניסיון. בעוד המדידות הפונקציונליות של הקרוואן באמצעות טכניקת החזה הפתוח (המתוארת כאן) אינה שיטת תקן הזהב בתחום, יש לו את היתרון שניתן ללמוד אותו במהירות ולשכפל במדויק אפילו על ידי מתנסה פחות מנוסה.

פרוטוקול

לפני כל ניסויים בבעלי חיים לקבל את אישור הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים. הניסויים הנוכחיים בוצעו לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה איקאן בהר סיני.

1. אינדוקציה PH

1. הכנה
   1. לפני תחילת המחקר, לתכנן בקפידה את העיצוב הניסיוני. ודא כי עכברים חשופים היפוקסיה באותו נקודת זמן כמו הזרקת SU5416 הראשונה. דוגמה לעיצוב הניסיוני לזימת PH באמצעות שיטת Hypoxia/SU5416 מוצגת באיור 1A. עכברי בקרה קיבלו רק את הרכב. עבור מודל זה, SU5416 יוזרק לעכברים פעם בשבוע במשך 3 שבועות רצופים.
   2. השתמש בעכברים בני שמונה עד 12 שבועות C57BL/6 עבור מחקר זה. לשכון את בעלי החיים ב 18-20 מעלות צלזיוס במחזור 12-h אור כהה. ודאו שהמזון והמים נגישים ל-ad libitum.
   3. לשקול את החיות. הקצה אותם באופן אקראי לכל קבוצה: נורמוקסיה והיפות-קסיה/SU5416.
   4. הכן את התא ההיפוקסי כפי שמצג באות 1ב. מיכלי חנקן מאובטחים (N₂₎ליד התא. הגדר את בקר החמצן (O₂₎בנקודה של 10% O₂. תן למערכת להגיע למצב יציב.
   5. להכין SU5416 להזרקה (להשתמש במינון של 20 מ"ג/ ק"ג משקל גוף). SU5416 אינו מתמוסס בפתרונות מים; לכן, להמיס את הסכום המחושב ב 100 μL DMSO⁸. לדוגמה, עבור עכבר 25 גרם, כמות SU5416 להיות מוזרק הוא 0.5 מ"ג מומס 100 μL ממס (DMSO). הריכוז הסופי של SU5416 עבור עכבר זה הוא, לכן, 5 מ"ג/מ"ל.
      אזהרה: SU5416 הוא חומר מסוכן. קרא בעיון את גליון נתוני הבטיחות המלווה במוצר והקפידו לנקוט באמצעי הזהירות המומלצים בעת טיפול בחומר זה. לבש כפפות מגן והשתמש (כמו כל זריקה) להשתמש בהגנה על העיניים. המבנה הכימי של SU5416 מוצג באות 1C.
      הערה: חשב עודף מתאים של הפתרון כדי לפצות על אמצעי האחסון שאבד במהלך ההזרקה (למשל במזרק, בקבוקון וכו '). בהתאם המזרק בשימוש, נפח מת הוא כ 200 μL. עבור קבוצה של 10 עכברים, לחשב עודף של 2 מינוני עכבר.
   6. הכן את המזרקים להזרקה. השתמש במזרקי 1 מ"ל עם מחטים "25 G x 5/8.
2. הזרקת תת עורית SU5416
   1. לרסן את החיה. מניח את העכבר על מכסה הכלוב כדי לסייע באיפוק. אחז בעור וטפס אוהל מקביל לעמוד השדרה. הקפד לתפוס את החלק האחורי של הראש בחוזקה, כדי למנוע את הפציעה הנשיכה הפוטנציאלית על ידי העכבר.
      הערה: הנוכחות של שני חוקרים הופכת את ההליך למהיר ומדויק יותר, כפי שאחד יכול להחזיק את החיה בעוד השני מבצע את הזריקה.
   2. הכנס את המחט באופן תת עורי מעל האגף בקפל הרופף של העור. הקפד להכניס את המחט במקביל לעור. הימנע מכך שדרך דופן הבטן.
   3. להזריק את התוכן של המזרק (100 μL של SU5416 מומס או רכב).
      הערה: כדי למנוע דליפה לאחר הלידה המלאה, החזק את המזרק במשך כ-10 שניות וסובב מעט את המחט מתחת לעור.
   4. משוך את המחט והחזר את החיה לכלוב שלה. לאחר הזרקת SU5416, למקם את הכלובים בתא היפוקסיה מאוורר.
3. חשיפה להיפות
   1. נטר את האוורור לאורך זמן. הקפד לשמור על 10% של אספקת החמצן. שמרו על בעלי חיים נורמוקסיה בתא הניתן לאיטום למחצה ב-21% O₂.
   2. ודא כי התאים מצוידים בחיישן חמצן כדי למדוד את רמת החמצן. הימנע מפתיחה נרחבת של התאים. לניקוי והוספת מזון ומים לפתוח את התאים לא יותר מ 20 דקות כל 3 ימים.
   3. בדוק בעלי חיים מדי יום. שקול אותות מתח כגון piloerection או ירידה משמעותית במשקל.
      הערה: בעלי חיים תחת Hypoxia/SU5416 צפויים לרדת במשקל⁵. זוהי אינדיקציה להתפתחות המחלה.
   4. חזור על הזרקת SU5416 מדי שבוע במשך 3 שבועות רצופים (ראה איור 1A לסקירה של העיצוב הניסיוני).
      הערה: שינוי אתר ההזרקה יכול לעזור להפחית את הגירויים בעור.

2. אפיון פונקציונלי על ידי מדידות לחץ RV פולשניות

1. הכנה
   הערה: בחר משטר הרדמה. ניתן להשתמש בהרדמה להזרקה או לשאיפה. מאז מנת יתר קלה של הרדמה להזרקה (במיוחד קטמין / קסילאזין או פנטוברביטל) יכול להשפיע באופן משמעותי על תפקוד הלב, השימוש בהרדמה נדיפה מומלץ. יש חשיבות רבה להשתמש באותו הרדמה עבור כל העכברים בתוך מחקר.
   1. השתמשו במאדה כדי להבטיח מינון הרדמה מדויק לכל בעל חיים. המינון עבור isoflurane הוא הבא: אינדוקציה 3-4%, תחזוקה 1% מעורבב עם 100% חמצן.
      הערה: ללבוש ציוד מגן אישי ולהימנע מלנשום את האדים.
   2. הכן משטח חימום ו/או מנורות חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף. הכן בדיקה בטמפרטורת פי הטבעת לניטור טמפרטורת הגוף.
   3. להבטיח אוורור תקין. הכן את מכונת ההנשמה מראש. הכן את מחבר צינור ה- Y ובדוק את פונקציית מכונת ההנשמה במצב ידני. ודא שהלחץ התוך-אמפרסטרי הוא <1 ס"מ H₂O כדי להימנע מבאוטראומה. קבע את קצב הנשימה על 110 נשימות/ דקות.
   4. הכן צינור אנדוטרכיאל על ידי חיתוך צנתר תוך-וסקולרי של 20 גרם.
   5. הכינו את המכשירים הדרושים: מרטפים קטנים, מספריים, מפשקי וו אלסטיים, צריבה כלי וספוגיות כותנה. על ספוגית כותנה להתאים מחט קטנה 25 G x 5/8", שישמש כדי להפוך את הנקב קטן בחדר הימני.
   6. הכן את צנתר הלחץ, יחידת בקרת עוצמת הלחץ וייזום תוכנת רכישת הנתונים. מקם את הצנתר PV בצינור 15 מ"ל מלא PBS ב 37 ° C במשך 15 דקות לכייל על פי פרוטוקול היצרן.
   7. לתנומה ובעקוב של האיברים, להכין PBS ופתרון של 50% PBS / 50% OCT. להכין 2 x 10 מ"ל מזרקים (עם מחט 25 G): אחד ישמש לתחלוק הלב ואת הריאה עם PBS ב situ והשני להזרקת OCT / PBS (50/50) פתרון לדגימה ריאות שישמש לבדיקה היסטולוגית.
2. אינטובציה
   1. לשקול את העכבר ולהקליט את מצב הבריאות לפני הרדמה.
   2. לגרום להרדמה עם 3-4% isoflurane. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטה בהונות: לצבוט את הדרך של אחד הגפיים בחוזקה. אם החיה נסוגה מהאיבר, זה סימן להרדמה לא מספקת.
   3. לאחר הרדמה אינדוקציה, לגלח את הצוואר ואת אזורי החזה.
   4. מניחים את העכבר על משטח החימום. מקם בדיקה בטמפרטורת פי הטבעת לניטור טמפרטורת הגוף.
      הערה: תחזוקה של טמפרטורת הגוף היא בעלת חשיבות עבור המדידות הפונקציונליות. טמפרטורת הגוף צריכה להיות בערך 36.5-37 °C.
   5. באמצעות ממחצים מעוקלים לחבר חוט תפר לחתכות החתכות העליונות של העכבר, למתוח ולתקן את משטח החימום עם סרט כירורגי. לאבטח את הגפיים של העכבר באמצעות קלטות כירורגיות.
   6. לציטוט בעל החיים לעשות חתך קטן של כ 1 ס"מ בעור צוואר הרחם מדיאלי באמצעות מספריים קטנים.
      הערה: צנרור אוראלי היא שיטה חלופית הדורשת ניסיון רב יותר.
   7. עם אפליקטור עם קצה כותנה בנפרד בבוטות את בלוטות הרוק parotid ותת-המנשר ברמה האמצעית. זה יחשוף את השרירים מעל קנה הנשימה.
   8. בזהירות לחתוך את השרירים האלה חושף את קנה הנשימה.
   9. עם מספריים קטנות לעשות חתך קטן בין סחוסי קנה הנשימה ולהכניס את צינור הסיום מוכן. תוציא את מדריך המתכת של הצנתר התוך-וסקולרי.
   10. חבר את הצנתר למכונת ההנשמה. ודא את מיקום צינור ה-tracheal על-ידי ניפוח ידני של הריאות בעדינות. אבטחו את המיקום עם סרט הדבקה.
   11. לשמור על הרדמה איזו-פלומתית של 1% לאורך כל ההליך.
   12. לפקח באופן קבוע על עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטה בהון. כוונן את ההרדמה בהתאם.
       הערה: קצב הלב המומלץ במהלך הניסויים, תחת 1% הרדמה isoflurane, הוא כ 400 פעימות / דקה. תחזוקה של טמפרטורת הגוף והרדמה חיונית לשליטה בקצב הלב. עודף של isoflurane יכול להפחית את קצב הלב. עם זאת, התאוששות ניתן להשיג על ידי הפחתת שיעור isoflurane.
3. מדידות לחץ RV (גישה לחזה פתוח)
   1. עם מספריים קטנות לבצע חתך בעור של כ 1 ס"מ על פני תהליך xiphoid ואת החלק הבטן העליונה. הפרד את העור המכסה את החזה ואת דופן הבטן של רביע הבטן העליונה: התחל בקו האמצעי, דיסטל ל-xiphoid ולעבור בזהירות לרוחב משני הצדדים. השתמש בתרמוקוטריה כדי לשלוט בדימום.
      הערה: המטרה היא לקבל גישה לחלל בית החזה דרך דופן הבטן.
   2. פתח את חלל הבטן וחתוך את הסרעפת בזהירות, ותדאג לא לפגוע בלב הפועם או בריאות.
      הערה: המטרה היא לחשוף את החלק ים ואת החדר הימני של הלב. חשיפה טובה ותודעה של הלב הם בעלי חשיבות מכרעת למיקום הנכון של הצנתר. יש חשיבות רבה כדי למנוע דימום לאורך כל ההליך. אפילו שינויים קטנים בנפח התוך-וסחתי יכולים לשנות את העומס של הלב הימני ולהשפיע על הפרמטרים הרשומים.
   3. הסר בעדינות את החיידק באמצעות אפליקטור בעל קצה כותנה.
   4. רגע לפני שמכניסים את צנתר הלחץ ללב, הביאו את הצנתר ליד העכבר.
   5. שימוש באפליקטור הכותנה המוכן עם המחט עושה פצע דקירה בחלק הדיסטלי האפאלי של החדר הימני. בזהירות להסיר את המחט ולהכניס את צנתר הלחץ לתוך החור הזה.
      הערה: כך אמור לעבוד מבלי להפעיל כוח. במקרה זה לא אפשרי, נסה לעשות חור חדש ליד הראשון על מנת למנוע פגיעה ממושכת של הלב. המחט לא צריכה להיות מוכנסת עמוק יותר מאשר כ 3 מ"מ.
   6. הכנס את צנתר הלחץ במקביל לכיוון החדר הימני, כאשר הקצה פונה לעורק הריאה.
   7. צפה במעקב גל הלחץ כדי להבטיח את המיקום הנכון של הצנתר. מעקבים מייצגים מדגימים באיור 2.
   8. תן לאות הלחץ להתייצב. השהה את הנשימה והשג לפחות 3 מידות. בין המדידות הבודדות מאפשרים לחיה להיות מאווררת.
   9. ברגע שכל המדידות נרשמות להסיר את הצנתר ולמקם אותו בחזרה בצינור PBS מלא באמבט המים.
      הערה: לאחר השלמת הניסוי, נקה את הצנתר בהתאם להוראות היצרן.
4. המתת חסד וריאות
   1. עם סיום הניסוי המתת סד העכבר על ידי למוות.
   2. פתח את התיבה באופן נרחב. באמצעות מספריים, לחתוך את כל עצם החזה ושים לב לא לפגוע בלב או בריאות.
   3. שימוש במספריים קשתית עושה חתך קטן בחדר השמאלי כדי לאפשר לדם לעזוב את התא.
   4. מניחים את מחט 25 G של מזרק המכיל 10 מ"ל של PBS בחדר הימני ולהזריק את תמיסת PBS עד הריאות מנוקות מדם.
   5. לאחר השלמת שלב זה, לאשר המתת חסד על ידי קציר רקמות חיוני (לב וריאות): לחתוך את קאווה וחיבורים בבי העורק ולהסיר את הלב והריאות en block.

3. אפיון מורפומטרי

1. מיד לאחר הסרת הלב והריאות (שלב 2.4.5), בודדו את הלב והסירו את שני האטריה. עם מספריים טנוטומיה מעוקל לנתח בזהירות את החדר הימני (RV) מהבר השמאלי (LV), עוזב את המחיצה (S) עם החדר השמאלי. שקלו RV ו-LV+S וחשבו את מדד פולטון= RV/LV+ S (איור 3)^5,,9.
2. קח חלק מהחלקום הימני והצב אותו בתבנית הטבעה ממולאת מראש של OCT. השתמש בחלק השני של החדר הנכון לניתוח RNA ו/או חלבון. הצמד להקפיא בקרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
3. השתמשו במספריים של הקשתית כדי לבודד את הריאות מהלב ומשאר הרקמה.
   הערה: להכנת הריאות, ההתחלות כמתואר לעיל (שלבים 2.4.3-2.4.5) היא בעלת חשיבות רבה.
4. הצמד להקפיא חלק מהריאות ולאחסן אותו עבור RNA, חלבון מיצוי או אחרים.
5. השתמש בחלק השני של הריאות לניתוח היסטולוגי. לשם כך, הכנס את המזרק המכיל 50% PBS ו- 50% OCT בברונכוס של האונה המשומשת^10,11. המתנסה יכול לראות בקלות כי הריאה מתנפחת כאשר התוכן של המזרק הוא perfused ברקמה.
6. מניחים את חתיכות הריאה הללו בהטמיע תבניות ממולאות מראש ב-OCT ומקפיאות אותן בקרח יבש. אחסן את הדגימות ב-80°C לאחר שהן קפואות.
7. הכן 8 μm קטעים של RV וריאות באמצעות מכונת cryostat. האוויר מייבש את החלקים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
8. לתקן את השקופיות בטמפרטורת החדר באמצעות 10% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות.
   הערה: PFA הוא מסרטן אנושי ידוע. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- גליון הנתונים של בטיחות חומרים (MSDS) לקבלת מידע נוסף.
9. הערכת איחוי כלי דם על ידי הכתמת המטוקסילין/אאוסין
   הערה: לבצע התכתמת המטוקסילין/אאוסין על מנת להעריך את השינויים המבניים של הלב ושיפוץ כלי הדםבריאה (איור 3).
   1. כתם עם תמיסת המטוקסילין למשך 8 דקות.
   2. לשטוף עם מי ברז זורמים במשך 5 דקות ואחריו לשטוף במהירות במים מזוקקים.
   3. יש לשטוף ב-95% את ETOH למשך דקה אחת וכתם נגדי בתמיסת Eosin למשך דקה אחת.
   4. התייבשות (80% אתנול 10-30 שניות, 100 אתנול למשך דקה אחת ו-100% טולול למשך 3 דקות).
   5. הר ולכסות עם כיסוי. ייבש את השקופיות למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
10. הערכת פיברוזיס בחדר הימני על ידי פירוסיריוס אדום כתם
    הערה: בכתמים אדומים Picrosirius, Picrosirius אדום, שהוא חומצה, נקשר קולגן^12. לכן, כתם זה יכול לשמש לבדיקה היסטולוגית של תוכן הקולגן.
    1. דגירה השקופיות בתמיסה של ביין שחומם מראש ב 58 ° C עבור 1 שעה.
    2. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים כדי להסיר צבע צהוב ממקטעים למשך 10-15 דקות.
    3. כתם 0.1% ירוק מהיר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשטוף ב 1% חומצה אצטית במשך 1 דקות.
    5. לשטוף את מי הברז במשך 5 דקות.
    6. כתם ב 0.1% סיריוס אדום במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו התייבשות בטולול.
       התראה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
11. הערכת היפרטרופיה קרדיומיוציט RV על ידי כתם WGA
    הערה: היפרטרופיה של החדר הימני (RV) ברמה התאית ניתן להעריך על ידי ביצוע נבט חיטה Agglutinin (WGA) כתמי(איור 4).
    1. תקן את השקופיות בפתרון אצטון קר במשך 15 דקות ואחריו 3 שלבי כביסה ב PBS (5 דקות כל אחד).
    2. לחסום עם 10% סרום עיזים בתמיסת Dako במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. דגירה השקופיות עם WGA: להוסיף WGA 1:200 דגירה עבור 1 1/2 שעה ב 37 ° C בחושך.
    4. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS.
    5. דגירה השקופיות עם צבע חומצה גרעין.
    6. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS.
    7. להרכבה, הסר את עודף הנוזלים והחיל מדיית הרכבה וסיכות. מייבשים את השקופיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס.
       הערה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
12. לבצע אימונוכימיה של הריאה כדי להעריך עוד יותר ובמיוחד את איחוי כלי הדם. לדוגמה, כתם חלק של תאי שריר יכול לשמש כדי להעריך את השרירים של כלי הדם, בעוד פון Willebrand פקטור הכתמה יכולה לשמש כדי לדמיין שינויים אנדותל. שיטות אלה מתוארות במקום אחר⁵.

תוצאות

בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את יצירת מודל Hypoxia/SU5416 לזימת PH בעכברים. יתר על כן, אנו מפרטים את כל השלבים הדרושים לביצוע הערכת כלי דם ולב ריאתיים בסוף תקופת התצפית.

מבט כולל על העיצוב הניסיוני של דגם זה מוצג באות 1A^13,14. עכברים נתונים היפוקסיה נורמובארית (10% O_{2) ומוזרק}תת עורית פעם בשבוע עם SU5416 במשך שלושה שבועות רצופים. הגירויים המשמשים לגירוי PH בפרוטוקול זה מוצגים ...

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד מודל PH בעכברים על ידי שילוב שני גירויים פתולוגיים: היפוקסיה כרונית והזרקת SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. בניסיון לתאם מודל עכבר זה עם מצב PH אנושי, אחד חייב באופן בלתי נמנע להסתכל על סיווג PH הנוכחי, המוצג בטבלה 1. PH כמעט בכל הצורות מאופיין על ידי התכווצות כלי דם ריאתיים והתפשטות חריגה של אנדותל ותאי שריר חלקים. זה מוביל ללחץ מוגבר בעורקי הריאות וכתוצאה מכך עומס נוסף מוגבר של החדר הימני.

כל ניסיון לאפיין מודל של בעלי חיים של PH צריך ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה אצטית קרחונית	רוט	3738.1
אצטון, דרגה היסטולוגית	מחסן המעבדה	VT110D
ADVantage מערכת לחץ-נפח	טרנסונית	ADV500
הפתרון של בואין	סיגמא	HT10132
מערכת קוטרי	כלי מדע עדינים	18000-00
צינורות חיבור ו שסתומים
אפליקטורים עם קצה כותנה	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 מ"מ	Roth	1871
איסוף וניתוח נתונים	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	Sigma Aldrich	276855
קרח יבש
Dumont # 5 מלקחיים	Fine Science	Tools 11251-10
Dumont # 7 מלקחיים	עדינים כלי מדע עדינים	11274-20
תבניות הטמעה	Sigma Aldrich	E-6032
תמיסת אאוזין	מימית סיגמא	HT110216
אתנול, חברת	האספקה הביולוגית של קרוליינה	861285
מהיר ירוק FCF	Sigma	F7252-5G
מספריים עדינים	כלי מדע עדינים	14090-09
סרום עיזים	invitrogen	16210-064
כרית חימום	גיימאר	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
תא היפוקסי	Biospherix	A30274P
תא אינדוקציה	DRE Veterinary	12570
קטטר אינטובציה (i.v. קטטר SurFlash (20 גרם x 1 אינץ')	Terumo	SR * FF2025
מספריים איריס	כלי מדע עדינים	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
וופרייזר איזופלורן	DRE וטרינרי	12432
עכברים (C57BL/6)	נהר
25 גרם x 5/8 אינץ'	BD	305122
OCT	רקמות טק	4583
PBS (מי מלח חוצץ פוספט)	קורנינג	21-031-CV
חומצה פירית- תמיסה רוויה 1.3	Sigma	P6744-1GA
צנתר נפח לחץ	טרנסוני	FTH-1212B-4018
מפסק	קנט סיינטיפיק	SURGI-5001
בקר חמצן סטטי ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
תפר כירורגי, משי קלוע שחור, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
	3M	1527-1
מזרק 10 מ"ל	BD	303134
מזרקים עם מחט 1 מ"ל	BD	309626
Sytox ירוק נוקלאין כתם חומצה	תרמו מדעי	S7020
מספריים טנוטומיה	Pricon	60-521
טולול	רוט	9558.3
מכונת הנשמה	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	תרמו סיינטיפיק	W11261
קסילן	רוט