מאמר שיטה

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

DOI:

10.3791/59259

⸱

27 במרץ 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coloboma עינית מולדת היא הפרעה גנטית זה בדרך כלל נצפית כמו בקע בהיבט נחות של העין הסגר פיסורה דמית העין לא שלם. לאחרונה, הזיהוי של אנשים עם coloboma בהיבט מעולה של איריס, רשתית, עדשה הובילו הגילוי של מבנה הרומן, מכונה מעולה פיסורה או sulcus עינית סופריור (SOS), כי קיים transiently על מהראש ההיבט של גביע הראייה במהלך התפתחות העין חוליות. למרות המבנה כולו על פני עכברים, חומוס, דג, ניוט, ההבנה הנוכחית שלנו של אות המצוקה היא מוגבלת. כדי להבהיר גורמים שתורמים שלה היווצרות, הסגר, זה הכרחי כדי שניתן יהיה לבחון אותה ולזהות מומים, כגון עיכוב הסגר ה'אס. כאן, אנחנו יצא כדי ליצור סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים יכול לשמש ביעילות להמחיש אות המצוקה על ידי שילוב של טכניקות במיקרוסקופ נרחב זמין עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כגון צביעת immunofluorescent mRNA ביטוי. בעוד זו קבוצה של פרוטוקולים מתמקד היכולת להתבונן SOS הסגר עיכוב, היא יכולת הסתגלות לצרכים של הנסיין, ניתן לשנות בקלות. בסך הכל, אנו מקווים ליצור שיטה נוחה שדרכו ניתן מתקדמים ההבנה שלנו של אות המצוקה כדי להרחיב את הידע הנוכחי של התפתחות העין חוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היווצרות של העין חוליות הוא תהליך מאוד שנשמרת בו מתוזמר בקפידה איתות המסלולים המערכת לקבוע סוגי רקמות, ציין הזהות האזורית1. לפליטת עד תחילת מורפוגנזה עין לגרום פגמים מעמיקה הארכיטקטורה של העין, לעתים קרובות מסנוור2. מחלה אחד כזה נובע הכשל כדי לסגור את פיסורה עינית דמית העין בצד הגחוני של גביע אופטיים3. הפרעה זו, המכונה coloboma עינית, מעריכים כי ב- 1 מתוך 4-5000 לידות חי ו- % 3-11 לגרום לעיוורון בילדים, מפגין נפוץ כמו מבנה דמוי מנעול זה בולטת האישון במרכז עין4, נלסון! 5,6. הפונקציה של פיסורה דמית העין היא כדי לספק נקודת כניסה מוקדמת להערכת גדל לתוך הכוס אופטיים, לאחר מכן צידי פיסורה הפתיל כדי להקיף את כלי7.

בעוד coloboma עינית ידוע מאז ימי קדם, לאחרונה זיהינו תת-קבוצה הרומן של coloboma חולים עם איבוד רקמות המשפיעים על ההיבט סופריור/הגבי של העין. עבודה במעבדה שלנו הובילה לגילוי של מבנה עינית בעין דג זברה הגבי, שאותם אנו מכנים sulcus עינית סופריור (SOS) או פיסורה מעולה8. חשוב לציין כי המבנה יש מאפייני sulcus והן סדק. בדומה sulcus, זה שכבת רקמת מתמיד החובקת מ אפי אל הרשתית טמפורלית. בנוסף, הסגר של המבנה שאינו מתווך על ידי שילוב של השניים מנוגדים קרום המרתף, ונראה לדרוש morphogenetic תהליך שבו המבנה מאוכלס על ידי התאים. עם זאת, בדומה סדק, היא יוצרת מבנה המפריד את האף ובצד הטמפורלי של העין הגבי עם קרום המרתף. עקביות, נתייחס אליו כמו SOS בטקסט זה.

אות המצוקה אבולוציונית כולו לאורך החוליות, להיות גלוי במהלך מורפוגנזה עין דג, צ'יק, ניוט ו העכבר8. בניגוד פיסורה דמית העין, אשר נמצא במקום מ- 20-60 שעות שלאחר ההפריה (hpf) בדג זברה, אות המצוקה הוא מאוד חולף, להיות גלויים בקלות מ- 20-23 hpf, נעדר מאת 26 hpf8. מחקר שנערך לאחרונה במעבדתנו נמצא כי, בדומה פיסורה דמית העין, אות המצוקה ממלאת תפקיד הדרכה כלי הדם בזמן העין מורפוגנזה8. למרות הגורמים השולטים על היווצרות וסגירת אות המצוקה אינם עדיין לגמרי מובנים, הנתונים שלנו הדגש תפקידי עין הגבי הגחוני / תכנים גנים8.

דג זברה היא אורגניזם מודל מצויין ללמוד אות המצוקה. כמערכת מודל, היא מספקת מספר יתרונות בלימוד התפתחות העין: זה מודל חוליות; כל דור תערוכות פוריות גבוהה (~ 200 עוברי); הגנום שלו יש כבר וסודרו באופן מלא, אשר מקלה על מניפולציה גנטית; כ- 70% של גנים אנושיים יש לפחות אחד orthologue דג זברה, שהופך אותו מודל אידיאלי מבוסס-גנטיקה של מחלות אנושיות9,10. והכי חשוב, התפתחותו לוקח מקום חיצוני עם האמא, הזחלים שלה הם שקופים, מה שמאפשר עבור הפריט החזותי של העין לפתח בקלות יחסית11.

בקבוצה זו של פרוטוקולים, נתאר את הטכניקות שדרכו ניתן לאבחן אות המצוקה של דג זברה הזחלים. מגוון רחב של טכניקות הדמיה השתמשו בדוח זה יאפשר התבוננות ברור ה'אס במהלך התפתחות העין נורמלי, כמו גם את היכולת לזהות פגמים הסגר SOS. הפרוטוקולים בדוגמה שלנו יכלול חקירות של Gdf6, BMP מקומית מהראש ועין וסת הידועות של SOS הסגר. יתרה מזאת, טכניקות אלה יכול להיות משולב עם ניסיוני מניפולציות כדי לזהות גורמים גנטיים או סוכנים תרופתי המשפיעים על היווצרות SOS הנכונה וסגירת. בנוסף, כללנו פרוטוקול שדרכו אפשרית ההדמיה פלורסנט של כל קרום התא, המאפשר הנסיין לבחון שינויים מורפולוגיים לתאים שסביבה אות המצוקה. המטרה שלנו היא להקים קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים יכול לשמש בכל רחבי הקהילה המדעית להציע תובנות חדשות זה מבנה הרומן של העין המתפתח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אלברטה חיה אכפת והוועדה שימוש.

1. פרוטוקול 1: ויזואליזציה של SOS באמצעות stereomicroscopy ודימות ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית

  1. אוסף העובר
    1. בתוך מיכל מים dechlorinated, הכן חוצה של gdf6a+ /- דג זברה בשעות הערב על ידי זיווג דג זכר עם דג הנשי. להיות בטוח להפריד את הזכר הנקבה באמצעות מחיצה כדי להבטיח העוברים נולדו בטווח קטן של הזמן.
    2. למחרת בבוקר, למשוך את המפריד, לאפשר את דג זברה להתרבות במשך יותר מ-30 דקות לאסוף את העוברים בתוך צלחות פטרי עם מדיה E3, תיאר את הספר דג זברה12, ולמקם אותם בתוך חממה 28.5 ° C.
    3. להסיר את כל הביצים מופרית או עוברי המת, אשר תופיע לבנה ואטומה.
  2. הדמיה חיה של דג זברה העוברים והכנה
    1. בגיל 20 hpf, החלף E3 מדיה עם E3 המדיה המכילה 0.004% 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי למנוע ייצור פיגמנט.
      הערה: תוספת של פרופילתיואוראציל ב timepoint מעט מאוחר יותר, כגון hpf 22-24, סביר להתערב עם הניסוי בגלל גילו מוקדם של העוברים בזמנו של הדמיה. עם זאת, מומלץ להתייחס העוברים מוקדם כדי למנוע פיגמנטציה לחלוטין כמו שיש להקה של פיגמנטציה המופיעה בעיניים הגבי, אשר עלולים להפריע ההדמיה ה'אס.
    2. להבטיח כי כל העוברים בשלבים התפתחותיים הנכון בנקודות שונות שהובילו הזמן של התבוננות. מומלץ כי זאת בשלבים-somite איזה מספר הוא נראה בבירור כפי שתואר על ידי קימל ואח13. הסר את אלה הן ילדותי נכה.
    3. מקם את העוברים תחת מיקרוסקופ ויבתר ולאחר dechorionate בסדר העוברים על ידי משיכה עדינה לגזרים את chorion באמצעות מלקחיים. דמיינו את SOS בעיניים הגבי. אות המצוקה עשוי להופיע ההזחה בקצה תחום הגבי של העין, קו צריך להיות גלויים על פני העין הגבי. לסגירה SOS נורמלי, לבחון את העוברים-סביב hpf 20-23. בחינת פנוטיפים הסגר SOS מושהית, לבחון את העוברים בגיל 28 hpf או מאוחר יותר.
    4. למיין את העוברים המציגים SOS עיכוב הסגר מאלה אינם.
    5. לצלם אלה העוברים באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, להכין צלחת פטרי המכיל 1% agarose ב E3. . שמוק בקלילות במרכז agarose כדי ליצור בור רדוד שבו החלמון של העובר יכול לשבת כאשר העובר מניחים על agarose פעולה זו תבטיח כי העובר הוא לא בזווית אלכסונית כאשר להצטלם.
    6. עזים ומתנגד העוברים עם 0.003% tricaine E3 ובמקום רוחבית על agarose.
    7. לשיקוף העוברים באמצעות מיקרוסקופ מורכב או קונאפוקלית, להעביר את העובר לתוך 35 מ מ פטרי המכילות סיילין קטנים שאינם הג'לי 1% התכה נמוכה נקודת agarose ב E3 (w/v). במהירות הצב העובר רוחבית באמצעות חוט דיג בסדר או עפעף ולחכות agarose להתקרר. לאחר agarose המשרד, שופכים מספיק E3 לתוך המנה כדי לכסות את agarose. לקבלת פרטים נוספים, עיין Distel ו- Köster14.
      הערה: אם משתמשים במיקרוסקופ הפוכה, העובר ניתן להציב נגד הזכוכית של צלחת זכוכית-coverslip-התחתון ו עם תמונה של 20 תקן X עדשה אובייקטיבית.
    8. השתמש עדשה המטרה מים 20 x טבילה להמחיש את אות המצוקה עם מיקרוסקופ המתחם. בעקבות ויזואליזציה, בעדינות למשוך את agarose מן העוברים לתקן ב 4% paraformaldehyde (PFA) או מאפשרים המשך התפתחותם.

2. פרוטוקול 2: כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin

  1. כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin: יום 1
    1. Dechorionate עוברי כפי שמתואר בשלב 1.2.3, אם לא עשית. לתקן את העוברים בצינור microcentrifuge-timepoint הרצוי טרי 4% PFA כבר שעתיים על מטרף בטמפרטורת החדר (22-25 ° C). תשטוף 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים.
      הערה: בעקבות gastrulation, העוברים עשויה לפתור יותר לאחר dechorionation.
    2. Permeabilize עוברי ב 10 מ"ג/מ"ל proteinase K בטמפרטורת החדר במשך זמן הדגירה 5 דק תהיה תלויה השלב ההתפתחותי שבו קבועים העוברים (ראה Thisse ו- Thisse15).
    3. תשטוף 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים.
    4. לחסום את העוברים בריכוז של 5% עז סרום ו- 2 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA) ב- 1xPBST עבור 1-2 h במטרף בטמפרטורת החדר.
    5. להכין נוגדן ראשוני פתרון על ידי דילול ארנב נוגדן anti-laminin בפתרון בלוק-לדילול 1:200.
    6. דגירה העוברים ב- anti-laminin נוגדן ראשוני בן לילה על מטרף 4 ° C.
  2. כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin: יום 2
    1. תשטוף 1 x PBST למשך 15 דקות, 5 פעמים.
    2. להכין נוגדן משני פתרון על ידי דילול עז ארנב נגד נוגדן אלקסה עבור חיל הים 488 1 x PBST לדילול 1:1000.
      הערה: זה אפשרי להתאים את שלב זה כדי להתאים את המשאבים הזמינים כדי הנסיין באמצעות נוגדנים משניים שונים של...
    3. דגירה העוברים ב נוגדן משני בן לילה על מטרף 4 ° C. להגן מפני אור במידת האפשר משלב זה ואילך.
    4. תשטוף 1 x PBST למשך 15 דקות, 4 פעמים. ניתן לאחסן את העוברים ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, במידת הצורך.
  3. דיסקציה, הרכבה של העיניים עובריים
    1. אם רצונך בכך, למקם את העוברים בצלוחית קטנה, deyolk את העוברים 1 x PBST. לעשות זאת באמצעות שיבוש החלמון עם מלקחיים בסדר והסרת התאים חלמון דרך גירוד עדין של שק החלמון בעדינות.
    2. להכין את ריכוזי PBS-גליצרול סדרת פתרונות microcentrifuge צינורות הבאים: גליצרול 30%, 50% ו- 70% ב- PBS. העברת העוברים לתוך 30% גליצרול/PBS, מקפיד למקם את העוברים על הפתרון והעברת קטן. של הפתרון הקודם ככל האפשר. המתן העוברים לשקוע לתחתית הצינור.
    3. כאשר עוברי טבענו לתחתית, להעביר אותם ל 50% גליצרול/PBS. חזור על ולהעביר ל-70% גליצרול/PBS.
    4. ברגע העוברים טבענו ב-70% גליצרול/PBS, להעביר אותם אל צלחת פלסטיק קטן עבור ניתוח.
    5. סבר האחורי כדי hindbrain העובר, ולהשתמש הרקמה האחורי עבור genotyping, במידת הצורך.
    6. להזיז את הראש שקופית מזכוכית, העברת כמו גליצרול קטן ככל האפשר. להשתמש מלקחיים או כלים אחרים של דיסקציה בסדר להיאחז הסוף האחורי כדי לשמור את הראש נייח. השתמש בסדר minutien pin או כלים אחרים של דיסקציה בסדר בעדינות להכניס לתוך החדר הקדמי של הקדמי ולדחוף כלפי מטה כדי להפריד את החצאים ימין ועל שמאל של הראש אחד מהשני. חזור על זה תוך כדי תנועה posteriorly דרך המוח האמצעי ולתוך החדר hindbrain, בעיקרו של דבר fileting את הראש למטה האמצע. פעולה זו ממזערת מניפולציה ידנית של העין ואת הרקמה הסובבת, ומותיר את SOS ניזוק.
    7. כסף בכל צד של הקו האמצעי ראש העין.. מיקום ארבע הודעות של גריז ואקום בפינות (הולם מרחק חוץ coverslip בשימוש) ולכסות עם coverslip זכוכית, דוחף ברצף על כל פוסט עד coverslip יוצר קשר עם הדגימות. פיפטה 70% גליצרול בקצה coverslip כך גליצרול נמשך מתחת, מילוי הרווח בין coverslip של השקופית.
    8. תמונה דגימות תוך יום, או לאטום סביב coverslip עם לק ודוגמאות תמונה רק לאחר הלק יבש. לאחסן בחושך ב 4 º C.

3. פרוטוקול 3: ויזואליזציה של SOS באמצעות eGFP-CAAX mRNA

  1. סינתזה של mRNA eGFP-CAAX
    1. Linearize 1 מ ג של pCS2-eGFP-CAAX פלסמיד16 עם NotI באמצעי אחסון התגובה של 40 מ ל 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. כדי להפסיק את התגובה תקציר הגבלה, להוסיף 10 מ"ל RNase ללא מים, 2.5 מ ל 10% מרחביות, 2.0 mL 10 מ"ג/מ"ל Proteinase K.
    3. דגירה 1 שעה ב 50 º C.
    4. להוסיף את הקוד הבא כדי התגובה (נפח כולל 200 מ ל) והמשך לשלב הבא: 50 מ ל RNase ללא מים, 20 מ"ל 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2 ו- 75.5 mL RNase ללא מים
      הערה: מוסיפים מים נטולי RNase בשתי הזדמנויות שונות כדי למנוע לדילול יתר סודיום אצטט.
  2. טיהור של ה-DNA באמצעות פנול/כלורופורם משקעים החילוץ ואתנול
    1. להוסיף אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl 200 מ ל, מערבולת של נפרדות ס' 20 השלבים מימית ואורגניים באמצעות צנטריפוגה ב g 18,000 x עבור 5 דקות.
    2. העברה מימית השכבה העליונה צינור microcentrifuge, מוודא למנוע ההעברה של השכבה התחתונה אורגני. להוסיף אמצעי שווה של כלורופורם הצינור החדש.
      הערה: תוספת של כלורופורם הוא אופציונלי, אך מומלץ להבטיח הסרה מלאה של פנול מדגם.
    3. מערבולת עבור נפרד ס' 20 השלבים מימית ואורגניים באמצעות צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 5 דקות.
    4. כמו קודם, העברה מימית השכבה העליונה צינור microcentrifuge, מוודא למנוע ההעברה של השכבה התחתונה אורגני.
    5. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2.
    6. לזרז את ה-DNA על-ידי הוספת שלושה כרכים של 100% נטול RNase אתנול וביו -צ'יל ב-20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות צנטריפוגה-g x 18,000 עבור 20 דקות ב 4 º C. גלולה צריך להיות גלוי. Decant את תגובת שיקוע.
    7. לשטוף את גלולה עם 100 מ ל מים קרים 70% אתנול/RNase-חינם. לאחר ערבוב בעדינות כדי להשתחרר בגדר, צנטריפוגה ב g 18,000 x למשך 15 דקות ב 4 º C. גלולה צריך להיות גלוי. Decant את תגובת שיקוע.
    8. מילה נהדרת בגדר במשך 5 דקות, resuspend ה-DNA של 7 מ ל מים.
      הערה: בגדר ייתכן שתצטרך להיות יבשים יותר מ 5 דקות בהתאם זרימת האוויר זמין.
  3. תמלול ולטיהור mRNA eGFP-CAAX
    1. באופן נטול RNase, להכין לתגובה שעתוק במבחנה עם ערכת פולימראז Sp6 RNA זמינים מסחרית, באמצעות כ- 1 מ ג של פלסמיד ליניארית מטוהרים DNA ב 3.2 שלב. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: Sp6 RNA פולימראז חייב לשמש לייצור mRNA רצ'ט.
    2. להוסיף 1 מ"ל של DNase (2 U/mL; RNase חינם) דגירה למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. לטהר את ה-mRNA עם כל ערכת טיהור RNA זמינים מסחרית. Aliquot ה-mRNA להימנע ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. הזרקת והדמיה
    1. להשיג את העוברים כפי שמתואר פרוטוקול 1.1.
    2. באמצעות מנגנון microinjection, להזריק pg 300 של mRNA eGFP-CAAX בשלב 1-cell.
    3. מסך עבור עוברי עם הביטוי החיובי של eGFP בעיניים באמצעות סטריאוסקופ על-ידי קרינה פלואורסצנטית.
    4. תמונה העוברים כמתואר ב- 1.2 פרוטוקול.
    5. לחלופין, dechorionate ולתקן את העוברים-timepoint הרצוי ב- 4% PFA למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים, dechorionate, אם לא קודם לכן. לנתח את העיניים והר אותם בשקופיות כמתואר ב- 2.3 פרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה SOS מופיע בגיל 20 hpf ב רשתית הגבי הרב, שעורר8. 23 hpf אות המצוקה מעברים מן הארכיטקטורה צר הראשונית כניסה רחב ועל ידי 26 hpf. זה כבר לא נראה לעין8. לכן, כדי לבחון את SOS במהלך התפתחות העין נורמלי דג זברה, העוברים יש להקפיד בין hpf 20-23. במהלך תקופה זו, הוא אות המצוקה נצפות מבעד למיקרוסקופ ויבתר, דרך הדמיה DIC כקו דק בעיניים הגבי שמפריד את החצאים האף ואת זמני של הרשתית המתפתח (איור 1). בנוסף, כניסה עדין ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן על המצוקה של העובר המתפתח דג זברה. כדי לקבוע פנוטיפים עיכוב הסגר, פרוטוקולים שלנו התמקדו היכולת להבחין בהפרדה בין שתי האונות דיסקרטית של הצד הגבי-אפיים ואת הגבי-טמפורלית של העין, דומה טכניקות השתמשו כדי להמחיש פיסורה דמית העין הסגר עיכוב פנוטיפים בעיניים הגחון.

טכניקות הדמיה אלה יכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של טכניקות מניפולציה גנטית כדי לחקור את ההשפעות של עיכוב או גרימת ביטוי של גנים מסוימים כדי ללמוד את התפקידים שלהם לסגירת אות המצוקה. בח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין אינטרסים סותרים להכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), אלברטה מתפתחת טכנולוגיה עתידיות, ונשים, מכון מחקר בריאות (WCHRI לילדים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-פניל 2-thioureaסיגמא אולדריץ'P7629-10G
צלחת פטרי 100 מ"מפישר סיינטיפיקFB0875713
35 מ"מ צלחתפטרי קורנינגCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A7906-100G
DIC / מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissAxioImager Z1
מיקרוסקופ דיסקציהאולימפוסSZX12
מצלמת מיקרוסקופדיסקציה QimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning גריז ואקום גבוהפישר סיינטיפיק14-635-5D
אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)סיגמא אולדריץ'A5040-25G
עיזים נגד ארנב Alexa Fluor 488Abcamab150077
סרום עיזיםסיגמא אולדריץ'G9023
תוכנת לכידת תמונותZeissZEN
IncubatorVWRדגם 1545
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ (22 מ"מ x 22 מ"מ)פישר סיינטיפיק12-542B
שקופית מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-544-2
סיכת MinutienFine Science Tools26002-10
mMessage mMachine Sp6 ערכת תמלולInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehyde ( PFA)סיגמא אולדריץ'P6148-500G
פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול pH 6.7 +/- 0.2פישר סיינטיפיקBP1752-100
פרוטאינאז Kסיגמא אולדריץ'P4850
ארנב נוגדן נגד למיניןMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µ L)InvitrogenAM2238
Ultrapure נקודת התכה נמוכה אגרוזInvitrogen16520-100
UltraPure נתרן דודציל סולפט (SDS)Invitrogen15525017

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNADICGFP CAXSOS

מאמרים קשורים