Method Article

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

DOI:

10.3791/59271

⸱

April 12th, 2019

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המודל מטריצה חוץ-תאית (טוב) עצם אוסטאוסרקומה (OS) הוא מבוסס היטב שמוצג כאן. זה יכול לשמש בדומה לפיגום מתאימים מחקה הגידול העיקרי לצמיחה במבחנה , מתן מודל אידיאלי ללמוד את הטרוגניות היסטולוגית ו cytogenic של מערכת ההפעלה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוסרקומה (OS) היא הנפוצה ביותר של סרטן העצמות העיקרי אגרסיבי ביותר. הוא מאופיין עם שינויים אנטומיים היסטולוגיים יחד עם האבחון או prognostic בקשיים. מערכת ההפעלה כוללת תאים סרטניים genotypically ו phenotypically הטרוגנית. עצם microenvironment רכיבים הם הוכיחו לחשבון עבור התקדמות הגידול הטרוגניות ומחלות. מטריצה חוץ-תאית עצם (טוב) שומר על מטריצות microstructural ומרכיבים ביוכימיים של יליד מטריצה חוץ-תאית. הגומחה רקמות ספציפיות מספק לפיגום חיובית ולטווח תא OS זריעה והתפשטות. מאמר זה מספק פרוטוקול עבור הכנת מודל טוב והן ביישום נסיוני נוסף. מערכת ההפעלה התאים יכולים לגדול, להבדיל לתוך עקבית עם המורכבות histopathological של דגימות קליניות OS מרובים פנוטיפים. המודל מאפשר גם ויזואליזציה של מורפולוגיות מגוונות והקשר שלהן עם שינויים גנטיים, מנגנוני הרגולציה המשמש כבסיס. כמו הומולוגי ל OS אנושי, מודל טוב-OS זה יכול להתפתח והחיל פתולוגיה, מחקר קליני של מערכת ההפעלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוסרקומה (OS) מתרחשת בדרך כלל באופן פעיל גדל באזורים, metaphysis של עצמות ארוכות, במהלך גיל ההתבגרות. יותר מ- 80% מהאתרים מושפעות OS יש העדפה metaphysis של שוקה הפרוקסימלית ואת הזרוע proximal, כמו גם עצם הירך דיסטלי והן צינתור, המתאים למיקום של לוחית הצמיחה1. מערכת ההפעלה כוללת תת תא מרובים עם מאפיינים mesenchymal והמגוון ניכר ב כיתה ותכונות היסטולוגית. עדויות תומכות גזע mesenchymal (MSCs), מבשרי מחויבת תאי העצם, pericytes של התאים של מקור2,3,4,5. תאים אלה ניתן לצבור שינויים גנטיים או epigenetic, להצמיח OS תחת השפעת מסוימים אותות microenvironmental של העצם. מנגנונים הן פנימי והן חיצוני התוצאה אי יציבות גנומית והטרוגניות של מערכת ההפעלה, עם פנוטיפים מורפולוגי ומחקרים קליניים מרובים6,7. עבור טיפולים בפעוט או הקרנה של תרופות חדשות, מודלים חדשניים צריך להיווצר אל מול הטרוגניות או הפרעות קליניות אחרות.

מערכת ההפעלה היא גידול מוצק אינטרה-osseous ממאירים. המורכבות ואת הפעילות של המקיפים אלמנטים microenvironment להיוועץ ההבדלים פנוטיפי ו פונקציונלי על תאים OS במקומות שונים של הגידול. מטריצה חוץ-תאית עצם (טוב) מספק לפיגום הביוכימי מבניים עבור התצהיר מינרלים ו עצם שיפוץ. החלק האורגני של מטריצה חוץ-תאית (ECM) מורכבת בעיקר סוג אני הקולגן מופרש על ידי תאי השושלת osteoblastic, בעוד חלק mineralized שלה מורכב סידן פוספט בצורה של היידרוקסיאפטיט8. התפקיד דינמי של רשתות ה-ECM לווסת אדהזיה תא, בידול, צולבות לדבר ורקמות לתפקד תחזוקה9.

Demineralized hydrogels טוב, ECM שימשו בהצלחה בתרבות תא ולשפר תא התפשטות10,11. ECM דמוי עצם מסונתז יכול לווסת את גודל מאגר, גורל החלטות והתקדמות שושלת היוחסין של MSCs12,13,14. יתר על כן, תוצאות ראיות חשיבותו הקלינית לספק פעילות osteogenic על ידי עירור תהליכים תאיים במהלך עצם היווצרות והתחדשות15,16,17.

במאמר זה, הקבוצה שלנו יוצר מודל שונה עם חלופה חיובית לתרבות לטווח ארוך תלת מימדי. תאים OS מוזרק טוב הרקמה-derived מציגים פנוטיפ heterogeneously mesenchymal בקלות לעומת תרבויות מימדי פלסטיק. טוב נגזר מן הרקמה הומולוגי בייעודי לאתר הצג יתרונה דרמטי כמו להיות נישה מקורית עבור מערכת ההפעלה תאים במבחנה , יש פוטנציאל אדיר במחקר תיאורטית וקלינית OS. הפלטפורמה טוב מאופיין פשוטה אך יעילה למחקר במבחנה , יורחב ב דוגמנות סרטן מרובים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בבעלי חיים ושימוש מתנהלים על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (NIH הפרסום NO.80-23, תוקן בשנת 1996) לאחר אישור מהאוניברסיטה חיה אתיקה הוועדה של סאן יאט-סן.

1. עצם ההכנה

  1. להשיג 4 כדי 6 בת עכברים BALB/c (ללא דרישה ספציפית סקס). המתת חסד של עכבר גילוח ורחיצה כירורגית מאת נקע בצוואר הרחם, לחתוך את שוקית טריים, שוקה, עצם הירך של hindlimb בעזרת מספריים כירורגיים סטרילי. לקלף את רקמת האפיתל, ואז להסיר כמה של הרקמות הרכות ככל האפשר באמצעות פינצטה ומספריים.
  2. יש לשטוף את עצמות הרגל בתמיסת פוספט buffered סטרילי 10 מ מ (PBS) פעמיים כדי להסיר דם בקערה 6 ס מ. לטבול את העצמות 75% אתנול למשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים. העצמות נקי ניתן לאחסן שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם סטרילי PBS ב-80 מעלות צלזיוס במשך חודשים עד הנדרש.
    הערה: PBS המשמשים את כל השלבים הבאים יש 10 מ מ פו43−.

2. עצם העלמות המינרלים ו- decellularization

  1. להפשיר שהעצמות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לקפוא שוב ב- 80 ° C עבור ה 1 נושא העצמות יותר מ 2-3 מחזורים ההקפאה-הפשרה לפירוק פירוק ואת הרקמה תא.
  2. דגירה עצמות שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם 0.5 HCl N ללילה בטמפרטורת החדר על נדנדה מטרף פלטפורמה או מסלולית ברעידות עדין נדנדה/כדי להבטיח כיסוי מלא, אפילו של עצמות.
    הערה: ודא העצמות שקועים לחלוטין בזמן תנועה של החומצה אל תתפשר בתהליך. הנפח של HCl פתרון צריך להיות פי 10 יותר כמו זה של העצמות.
  3. לאחר decalcification, decant הפתרון HCl לחלוטין, שוטפים תחת מים עבור 1 h זורמים. לאחר מכן, לשטוף את העצמות פעמיים למשך 15 דקות לכל לשטוף עם מים מזוקקים על נדנדה פלטפורמה או מסלולית מטרף.
    הערה: הקפד להסיר לחלוטין את הפתרון או את המים בין שוטף, ואחרי כביסה הסופי עם מים מזוקקים.
  4. תמצית ליפידים בעצמות demineralized בתערובת 1:1 של מתנול, כלורופורם בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, עטוף בנייר כסף לשעה בטמפרטורת החדר10.
  5. לאחר מכן, להעביר העצמות לתוך צינור נוסף של מתנול עטוף בנייר כסף עבור 30 דקות להסיר לחלוטין את מתנול ולשטוף עם מים פעמיים למשך 15 דקות ברעידות בעדינות מזוקקים. Decant הסופי שטיפת מים והמשך בשלבים הבאים בתנאי סטרילי.
    הערה: במהלך השלב החילוץ, אור יש להמנע כדי למנוע ריקבון כלורופורם. התערובת ניתן לאחסן במיכל עמידים אור או שפופרת צנטרפוגה עטוף בנייר כסף. לבצע כל טיפול ולשטוף את השלבים תחת סיבוב צנוע או נדנדה בתנועה.
  6. לשטוף את העצמות בצלחת 6 ס מ עם PBS סטרילי למשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר את העצמות לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש. להוסיף 40 מ"ל סטרילי 0.05% טריפסין-EDTA (TE) לתוך הצינור, דגירה עבור 23 ש ח בחודש חממה2 CO בגיל 37 ° C18עצמות.
  7. לבטל את הפתרון טה ולשטוף פעמיים עם PBS סטרילית בתוספת 90 אמפיצילין μg/mL ו- 90 kanamycin μg/mL. לאחר decanting הסופי לשטוף PBS לחלוטין, לחדש עם PBS סטרילית 40 מ. לשטוף ביסודיות עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין או טלטול עבור להשרות לאנטיביוטיקה.
    הערה: כל מגניב סטרילי בשימוש זה, השלבים הבאים מכיל אמפיצילין μg/mL 90 90 kanamycin μg/mL. לילה לשטוף תחת סיבוב או נדנדה בתנועה מבוצעות עבור תקופות ארוכות טבילה יסודית עם אנטיביוטיקה כדי להשיג עיקור יעיל של הנקבובית רווחים.
  8. הסר את PBS, להעביר את העצמות לתוך שפופרת צנטרפוגה מ"ל מלא עם PBS סטרילי. מוכנה demineralized, decellularized העצמות נקראים עצם מטריצה חוץ-תאית (טוב), ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 חודשים עד הנדרש.

3. תא זריעה ותרבות

  1. להוציא את טוב מן המקרר 4 ° C, לטבול אותו ב- 75% אתנול עבור s 30 ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים. להעביר את טוב לצלחת תרבות נקי. ובכן 6 תאים. להוסיף 2 מ"ל בינוני תרבות שלמה (של Dulbecco שונה בינוני/F12 של הנשר (DF12) המכילה 5% סרום שור עוברית, אמפיצילין μg/mL 90, 90 kanamycin μg/mL). דגירה של טוב לילה ב חממה2 CO ב 37 º C.
  2. להשיג את שורות תאים אנושיים OS (MNNG/בחורות ו- MG-63). להשעות כ 1.0 x 10 תאים5 מערכת ההפעלה עם PBS 100 μL המכיל פנול אדום כמו מחוון.
    הערה: כדאי לעקוב ולבחון שכבתיים תאים בתוך המודל טוב תלת מימדי, MNNG/בחורות ו- MG-63 נגועים וקטור lentiviral לבטא mCherry פלורסנט, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
  3. לאחר טוב מלא טבולים המדיום, להזריק תאי מערכת ההפעלה לתוך טוב מן epiphysis הפרוקסימלית או דיסטלי כאשר המחט מגיע את חלל מדולרי של טוב. דגירה דגם OS-טוב למשך תקופה מינימלית של 2 h ב- 5% humidified האווירה2 CO ב 37 ° C כדי להבטיח התאים מוזרק בחוזקה לדבוק טוב.
    הערה: לחמם בכל אמצעי התקשורת המשמשים תרבית תאים. החממה משמש תרבית תאים יש humidified של 5% CO2 האווירה ב 37 º C.
  4. להוסיף 1 מ"ל בינוני תרבות שלמה המשקולת על מעיל לחלוטין את פני השטח של התרבות טוב לילה ב חממה2 CO ב 37 º C.
  5. בעדינות העברת הדגם OS-טוב לתוך באר חדשה של 6-ובכן צלחת עם פינצטה סטרילי, בינוני תרבות טריים refeed 1 מ"ל. תרבות המודל למשך 14 ימים חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס, לרענן את המדיום תרבות לפי מצב התפשטות תאים OS.
  6. תמשיך לפקח על מצב צבע ותא בינוני תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך במהלך תהליך התרבות. כאשר מערכת ההפעלה שהתאים יתרחבו לצלחת, בעדינות להעביר את המודל OS-טוב לשני חדש עם פינצטה סטרילי.
    הערה: המדיום תרבות הוא אדום בוהק ב- pH 7.4, אשר יהיה ערך ה-pH האופטימלי עבור תרבית תאים יונקים ביותר. אם המדיום יהפוך צהוב כתום או אפילו, לרענן באופן מיידי של המדיום כדי לשמור על סביבה בריאה עבור מערכת ההפעלה תאים.
  7. להעביר את המודל OS-טוב לתוך באר חדשה עם מלקחיים ולשטוף בעדינות עם PBS להסיר את המדיום תרבות. לאחר מכן, להעביר לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, לתקן עם 10% buffered פורמלין לזיהוי היסטולוגית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר העלמות המינרלים, decellularization, טוב נראה שקוף עם חוסן ויותר אחיזה לעומת עצם העכבר מקורית. משקע שריר קטן ואת הרווח של חלל מדולרי ניתן בבירור לראות (איור 1א', ב'). כדי לקבוע את decellularization יעיל של טוב, טוב נעוץ פרפין לאחר קיבוע, ואז חתוכים למקטעים μm 3-5 עבור hematoxylin-אאוזין (H & E) מכתים. הסרת יסודית של גרעין התא מוצג על ידי שדה בהיר הדמיה. טבעי נקבובי המבנה של קולגן רשת הסידור מתוחזקות היטב, טוב decellularized (איור 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן כללי, OS ניתן לסווג כמו osteoblastic, chondroblastic, fibroblastic תת בהתאם רכיב היסטולוגית הדומיננטי שלו. הפרוגנוזה שלה תלויה לא רק פרמטרים היסטולוגית אלא גם באתר שלה אנטומיים. זה עלול להתרחש בתוך העצמות (בתיבה אורתופדיים או תא intracortical), על המשטחים של עצמות, ובעוד אתרים extraosseous19. הופעתה והטרוגניות של מערכת ההפעלה יכולה להיות הובהר כמו ההטיה של אירועים oncogenic דחיפה microenvironmental נאותה, ואחריו הגוברת פיתוח והעברה ל איברים רחוקים20,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים ערך התמיכה של צ'ן Liuying זאו ארוך וסיוע הניהולית שלה לסיוע טכני מעולה שלו במהלך בניית עצם מטריצה חוץ-תאית פיגומים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31871413).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור צנטריפוגה 15 מ"לגריינר188271
צינור צנטריפוגה 50 מ"לגריינר227270
צלחת תרבית תאים 6 ס"מגריינר628160
צלחת 6 בארותגריינר657160
אמפיציליןסיגמא-אולדריץ'A9393
C57-BL/6J עכברהמעבדה האוניברסיטאית סאן יאט-סן חממת מרכז בעלי חיים
CO2 SHELLABSCO5A
נתרן פוספט דו-בסיסימפעל ריאגנט כימי גואנגג'ואוBE14-GR-500G
DMEM/F12סיגמא-אולדריץ'D0547
סרום בקר עובריHycloneSH30084.03
המוציטומטרBLAU717805
KanamycinSigma-AldrichPHR1487
MG-63האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאיקו תאי אוסטאוסרקומה אנושית
תמיסה של פנול אדום משמשת כאינדיקטור pH: צבעו מציג מעבר הדרגתי מצהוב לאדום בטווח ה-pH 6.6 עד 8.0.
אשלגן כלוריסנגון ביוטקA100395
אשלגן פוספט מונוביסיקסנגון ביוטקA501211
נתרן כלוריסנגון ביוטקA501218
MNNG/HOS האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאי קו תאי אוסטאוסרקומה אנושית פנול אדום סיגמא-אולדריץ' P4633

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
  2. Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
  3. Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
  4. Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
  5. Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
  6. Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082(2015).
  7. Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
  8. Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
  9. Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
  10. Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
  11. Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
  12. Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
  13. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
  14. Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
  15. Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
  16. Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
  17. Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
  18. Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
  19. Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
  20. Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
  21. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  22. Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
  23. Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
  24. Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
  25. Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
  26. Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
  27. Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
  28. Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210(2016).
  29. Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
  30. Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
  31. Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
  32. Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
  33. Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
  34. Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
  35. Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Extracellular MatrixOsteosarcoma ModelDecellularization ProtocolFreeze Thaw CyclesHCl DecalcificationLipid ExtractionTE Solution TreatmentSterilization WashOS Cell SeedingImmunohistochemical Analysis

Related Articles