מאמר שיטה

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

DOI:

10.3791/59282

⸱

18 במרץ 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים עבור בידוד תאי גזע זולה שיניים האנושי והתפשטות פרוטוקול על מנת להעריך את הביטוי חלבון פריאון בתהליך בידול עצביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioethical נושאים הקשורים המניפולציה של תאי גזע עובריים יש הפריע ההתקדמות בתחום המחקר הרפואי. מסיבה זו, חשוב מאוד לקבל בתאי גזע בוגרים רקמות שונות כמו שומן, חבל הטבור, מח עצם ודם. בין מקורות אפשריים, עיסת שיניים הוא מעניין במיוחד כי זה קל להשיג בגין שיקולים bioethical. אכן, שיניים זולה תאי גזע אנושי (hDPSCs) הם סוג של תאי גזע בוגרים מסוגלים להבדיל תאים עצביים כמו, ניתן להשיג את השן הטוחנת השלישית של מטופלים בריאים (גילאי 13-19). בפרט, הציפה שיניים היה להסיר עם החופר, וחותכים לפרוסות, שטופלו collagenase הרביעי ותרבותית בבקבוקון. כדי לעודד את הבידול עצביים, hDPSCs היו מגורה עם EGF/bFGF 2 שבועות. בעבר, הראו כי במהלך תהליך התמיינות התוכן של פריון הסלולר חלבון (PrPC) hDPSCs מוגבר. הניתוח cytofluorimetric הראה ביטוי מוקדם PrPC זה גדל לאחר תהליך התמיינות עצביים. אבלציה של PrPC על ידי siRNA PrP מנעו בידול עצביים שנגזרות EGF/bFGF. בנייר זה, אנו ממחישים כי כפי שאנחנו משופרת של בידוד, ההפרדה ושיטות במבחנה הטיפוח של hDPSCs עם מספר הליכים קל, יעיל יותר תא שיבוטים היו הרחבת שהושג, בקנה מידה גדול גזע mesenchymal (MSCs) נצפתה. אנו גם מראים hDPSCs, שהושג עם שיטות מפורטות בפרוטוקול, מה שלומך. מדגם ניסיוני מצוינת ללמוד את תהליך התמיינות עצביים של MSCs ותהליכים תאית ומולקולרית עוקבות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גזע mesenchymal היה מבודד מספר רקמות, כולל מח עצם, דם טבורי, אנושית זולה שיניים, רקמת שומן, דם1,2,3,4,5 , 6. כפי שדווח על ידי מספר סופרים, hDPSCs להראות הדבקות מפלסטיק, מורפולוגיה פיברובלסט דמוי טיפוסי. אלה מייצגים אוכלוסיה הטרוגנית מאוד עם שיבוטים נפרדות וההבדלים המקדימות, המבדילים קיבולת7,8. hDPSCs אקספרס סמנים ספציפי עבור גזע mesenchymal (קרי CD44, CD90, CD73, CD105, כלי קשת-1), הם שליליים עבור כמה סמנים hematopoietic (כגון CD14 ו- CD19), מסוגלים במבחנה בידול multilineage9, 10,11.

מספר סופרים הראו כי תאים אלה הם מסוגלים להבדיל לתוך נוירון כמו תאים באמצעות פרוטוקולים שונים, כולל התוספת של גורם הגדילה העצבי, bFGF, EGF בשילוב עם ספציפי מדיה ותוספי7,12. בנוסף, חלבונים רבים מעורבים בתהליך בידול עצביים ולהראות, בקרב אלו, בכמה עיתונים תפקידים רלוונטיים ושניהם ביטוי משמעותי של חלבון פריאון הסלולר (PrPC), תאי גזע עובריים והוא בוגר13, 14. PrPC מייצג מולקולה pleiotropic המסוגלים לבצע פונקציות שונות בתוך תאים כמו מטבוליזם נחושת, אפופטוזיס, ואת התנגדות חימצוני מתח15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

שלנו הקודם נייר23, חקרנו את התפקיד של PrPC בתהליך בידול עצביים hDPSCs. למעשה, hDPSCs אקספרס precociously PrPC וזה, אחרי בידול עצביים, היה ניתן לצפות להגדלה נוספת. מחברים אחרים שיערו תפקיד אפשרי של PrPC בתהליכים עצביים התמיינות של תאי גזע. אכן, PrPC מניע את הבידול של תאי גזע עובריים לתוך הנוירונים oligodendrocytes להפוך, האסטרוציטים24. מטרתו של מחקר זה היה כדי להדגיש את המתודולוגיה להשגת בתאי גזע של שיניים זולה, תהליך הבידול שלו ואת התפקיד של PrPC במהלך התמיינות עצביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השן הטוחנת השלישית השתמשו במחקר היו טוחנות מחולים (בן 13-19 שנים) ללא היסטוריה קודמת של סמים או צריכת אלכוהול, עישון כל ועם היגיינת הפה המתאים. ביום של הסבר, מחלקת המדע לרפואת שיניים, Maxillofacial של "ספיאנצה"-אוניברסיטת רומא, הסכמה מדעת הושג המטופלים או ההורים. הסכמה מדעת הושג בהתבסס על שיקולים אתיים ואישור של ועדת האתיקה.

1. השן והפקת זולה שיניים

  1. הכנת בינונית המתאימה עבור שימור או תחבורה.
    1. הכנת ריכוז נמוך בינוני ששינה הנשר של Dulbecco של גלוקוז (DMEM-L) עם L-גלוטמין (494.5 מ"ל).
    2. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) 0.5 מיליליטר שהוא גוסס (0.1%).
  2. לחלץ את השן הטוחנת השלישית של המטופל, לשטוף אותו עם PBS, הכניסו למבחנה 15 מ"ל עם המדיום ובמהירות להעביר אותו למעבדה פחות מ 2 h.
  3. ברדס חומרים מסוכנים, לפתוח את השן בחותך עוברים חיתוך הילתית מקבילים, המשיק דרך הגג לשכת זולה.
  4. בעדינות להסיר הציפה עם מחפר קטנה ומניחים אותו במבחנה.
  5. לשטוף עם PBS שלוש פעמים, צנטריפוגה ב 2,500 x g 10 דקות ב- RT.

2. עיבוד של עיסת שיניים ושחרור תאי גזע

  1. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בפתרון של האנק ולמקם אותו בצלחת פטרי. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  2. הקלד הרביעי collagenase פתרון הכנה.
    1. להכין 0.8 מ של DMEM-ל'
    2. ממיסים 1 מ ג של סוג collagenase הרביעי ב- 0.8 מ של DMEM-L ו מערבולת למשך מספר דקות.
    3. הוספת DMEM-L עד 1 מ"ל יש ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל.
    4. לסנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  3. להסיר את הפתרון של האנק על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, לחלק את הציפה לפרוסות שנהנתם 1 מ"מ כל אחד באזמל חד פעמיות.
  4. מניחים את פרוסות זולה בצלחת פטרי, דגירה עם 1 מ"ל של הסוג הרביעי collagenase למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  5. הכנה תרבות בינוני (500 mL).
    1. 445 מ של DMEM-L עם L-גלוטמין.
    2. להוסיף 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) (10%).
    3. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%).
  6. Centrifuge הדגימה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בטווח הבינוני (שלב 2.5) ותרבות T25 הבקבוק ספציפיות עבור תאי גזע-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.

3. תאי גזע התרבות והתפשטות

  1. כל יום לבדוק את התרבות ולבחון, לאחר 3 ימים של צמיחה, שיבוטים שונים של תאים חסיד בתוך הבקבוק.
  2. כל 3 ימים לשנות המדיום תרבות.
  3. בין 7 ל 12 יום, ברגע תאים חסיד שיש להגיע למפגש, לנתק אותם לטיפול תאי עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות באמצעות המגרד של התא.
  4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של המדיום תרבות (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
  5. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם, להסיר את תגובת שיקוע ולמקם את התאים בבקבוקון T25 להפיץ.
    הערה: כל 3 ימים התאים להגיע למפגש.
  6. הפצת התאים עד 21-28 ימים (כ 6-8 קטעים) כדי למנוע הנוכחות של אי-גזע כמו תאים בתרבות.
  7. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או גירוד בעדינות. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם.
  8. הוצא את תגובת שיקוע ובדוק את התאים לניתוח cytofluorimetric (שלב 6).

4. Silencing PrPC ארעי על-ידי siRNA

  1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5) במשך 24 שעות ביממה.
  2. יום אחרי, להכין siRNA PrP בינוני (400 µL).
    1. כדי מבחנה סטרילית, להוסיף 384 µL DMEM-ל'
    2. להוסיף 1 µL עבור כל סוג של siRNA PrP DMEM-L יש ריכוז הסופי של 5 nM (siRNA 4 PrP היו בשימוש ונבדקו על-ידי הספק כדי להבטיח של % ≥70 יעילות תמונות ציפורים).
    3. להוסיף 12 µL של transfectionreagent DMEM-ל'
    4. מערבולת התערובת דגירה 10 דקות ב RT כדי לאפשר הקמת מתחמי תרביות תאים.
  3. להוסיף μL 400 siRNA PrP בינוני כל דגימה, תקופת דגירה של 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס.
  4. ללא השמטת siRNA PrP בינונית, להוסיף 1.6 מ ל (יחס של 1 עד 5) של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  5. להשאיר את התאים עבור 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
  7. להוסיף 2 מיליליטר עצביים תרבות בינוני 7 ו/או 14 ימים (שלב 5.1).
  8. לשנות את המדיום תרבות עצביים כל 3 ימים.
    הערה: החלף siRNA PrP פתרון כל הזמן להחליף המדיום תרבות עצביים.
  9. בסוף הזמן, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולבדוק עבור עצביים אנטיגנים משטח על ידי ניתוח המערבי כתם.

5. העצבית תהליך אינדוקציה של hDPSCs

  1. הכנה עצביים תרבות בינוני (500 mL).
    1. להכין 444.7 מ של מדיה הבזליים שניסח תאים עצביים.
    2. למדיום להוסיף 50 מ של סרום ללא תוספת משמש לתמיכה הכדאיות לטווח ארוך של עובריים והוא בוגר גזע תאים עצביים (10%).
    3. להוסיף 200 µL של בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) (הריכוז הסופי 40 ng/mL) ו- 100 µL של גורם גדילה עוריות (EGF) המדיום (ריכוז סופי 20 ng/mL).
    4. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) למדיום.
  2. תרבות hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 105 תא/mL) עד 28 ימים מן ההפרדה זולה ולעורר אותם עם 2 מ"ל של מדיום תרבות עצביים.
  3. כל 3 ימים למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולהחליף 2 מ"ל של המדיום תרבות עצביים.
  4. אחרי 7 ו/או 14 ימים, ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות עם מגרד.
  5. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
  6. מבחן הנוכחות של אנטיגנים משטח עצביים (שלב 6) או לביטוי חלבון פריאון (שלב 7) על ידי ניתוח cytometry זרימה.

6. אפיון של hDPSCs מאת Flow Cytometry

  1. בחר mesenchymal סטרומה (MSC)-אנטיגנים משטח ספציפי או עצביים.
  2. תרבות של hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  3. ניתוק hDPSCs ב- 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה או לאחר 14 ימים של תרבות עצביים בינוני (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או בעדינות המגרד.
  4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין ולשטוף centrifugate-259 x g עבור 6 דקות ב RT. עוד 2 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
  5. לתקן את hDPSCs אינו מטופל או מטופלים עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
  6. Permeabilize hDPSCS עם 0.1% (v/v) ללא יונית חומרים פעילי שטח ב- PBS נוספים 10 דקות ב- RT.
  7. לבצע חסימת עם 5% שומן חלב יבשים 1 מ"ל של PBS עבור h 1-RT.
  8. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה התאים עם אנטי-CD105 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-CD44 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-לתזמורת כלי קשת-1 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-CD90 (מטריים / 5 x 105 תאים), אנטי-CD73 (מטריים / 5 10x5 תאים), אנטי β3-טובולין (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-NFH (בטחונות / 5 x 105 תאים) ו- anti-GAP43 (בטחונות / 5 x 105 תאים) mAb עבור 1 h RT.
  9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה עם אנטי-העכבר PE (1:50 / 5 x 105 תאים) או ארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb לשעה נוספים ב- RT.
  10. להשתמש נוגדנים משניים עבור gating התאים immunopositive (אנטי-העכבר PE או ארנב אנטי CY5 mAb) לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה, לרכוש לפחות 20,000 אירועים.

7. הערכת ביטוי PrPC hDPSCs על ידי ניתוח Cytometry זרימה

  1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  2. ניתוק hDPSCs ב 21 ו 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה, אחרי 7 ו/או 14 ימים בינונית תרבות עצביים (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ולהפסיק את הפעולה טריפסין כפי שמתואר בשלב 6.4. לתקן את דגימות עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
  3. Permeabilize עם 0.1% (v/v) ללא יונית surfactantin PBS 10 דקות ב RT. להסיר את תגובת שיקוע, מכתים את התאים עם הארנב אנטי-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb עבור h 1 RT. Incubate עם הארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb עבור h 1 נוספים ב- RT.
  4. לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה ולרכוש אירועים לפחות 20,000.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים בידוד והפרדה של hDPSCs מ שיניים זולה, המתקבל טוחנת שלישית, הם תהליכים מורכבים בהם שינויים קטנים יכולים להוביל תוצאה הרסניות. בנייר זה, אנו משתמשים בפרוטוקול של ארתור et al. 12 עם מספר שיפורים. ערכה הנציג של נהלים מוצג באיור1.

hDPSCs מייצגת אוכלוסיה הטרוגנית של תאים עם שיבוטים נפרדות וההבדלים המקדימות, המבדילים קיבולת7,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זאת, התמקדנו מתודולוגיה בידוד ובידול עצביים של hDPSCs; יתר על כן, הערכנו את התפקיד של PrPC בתהליך זה. ישנן מספר שיטות כדי לבודד, להבדיל hDPSCs תאים דמויי נוירון, שלבים קריטיים בתהליך. hDPSCs מסוגלים להבדיל ב מספר שושלות כגון chondroblasts, adipocytes, תאי העצם נוירונים. בעיתון שלנו, חקרנו את המנגנונים של בידול עצביים ואת נוכחותם של PrPC. כפי שצוין לעיל, תאים אלה מבטאים את טיפוסי mesenchymal סטרומה ספציפיים משטח אנטיגנים כגון CD44 ', ' CD90 ', ' CD105 ', CD73, כלי קשת-110

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי "דל'אנג'לו Varrone" ומרכז אוניברסיטה שעונה "סבינה Universitas" כדי וינצ'נצו מאטיי.

איור 5 (A, B) התפרסם בכתב מאת רשות של המפרסם טיילור & פרנסיס בע מ מ: תפקיד של פריון חלבון-EGFR מתחם multimolecular במהלך התמיינות עצביים של שיניים זולה-derived תאי גזע אנושי. Martellucci, ס., Manganelli ו', ג סנטקרוצ'ה, יצור פ, ל' פיקולי, Sorice מ, מאטיי ו' פריון. 2018 Mar 4. טיילור & פרנסיס בע מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת אמפוטריצין BSigma-AldrichA2942היא משמשת להשלמת מדיה של תרבית תאים, זוהי אנטיביוטיקה אנטי פטרייתית פוליאן מבית Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466אחד משישה איזופורמים של B-טובולין, הוא מתבטא מאוד במהלך התפתחות העובר ולאחר הלידה, ונשאר גבוה במערכת העצבים ההיקפית
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), גליקופרוטאין עיקרי של אנדותל כלי הדם האנושי, הוא חלבון ממברנה אינטגרלי מסוג I עם אזור חוץ-תאי גדול, אזור טרנסממברני הידרופובי וזנב ציטופלזמי קצר
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulנוגדנים לסמני תאים חיוביים המכוונים נגד תאי גזע מזנכימליים
Anti-CD73 טכנולוגיית איתות סלולרי 13160CD73 הוא גליקופרוטאין מעוגן פוספטידילינוזיטול של 70 kDa, הקשור לממברנה, המזרז את ההידרוליזה של מונופוספטים נוקלאוזידים חוץ-תאיים לנוקלאוזידים ביו-אקטיביים
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulנוגדנים לסמני תאים חיוביים המכוונים נגד תאי גזע מזנכימליים
Anti-GAP43 טכנולוגיית איתות סלולרי #8945הוא חלבון ספציפי למערכת העצבים, הקשור לגדילה בחרוטי גדילה ובאזורים בעלי פלסטיות גבוהה
PE  נגד עכברים;Abcamab7003הוא נוגדן המשמש בזרימה ציטומטרית או ניתוח FACS
Anti-NFH טכנולוגיית איתות סלולרי #2836הוא נוגדן המזהה רמות אנדוגניות של סך כל חלבון Neurofilament-H
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604ארנב חד שבטי [EP 1802Y] לחלבון פריון PrP
אנטי ארנב CY5 Abcamab6564הוא נוגדן המשמש בזרימה ציטומטרית או ניתוח FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulנוגדנים לסמני תאים חיוביים המכוונים נגד תאי גזע מזנכימליים
B27 Supp XF CTSGibco על ידי טכנולוגיות חייםA14867-01B-27  ניתן להשתמש בו לתמיכה באינדוקציה של תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs), הרחבה של hNSCs, בידול של hNSCs, ותחזוקה של נוירונים מובחנים בוגרים בתרבית
ציטומטר זרימה BD Accuri C6 BD BiosciencesAC6531180187ציטומטר זרימה מצויד בלייזר כחול (488 ננומטר) ולייזר אדום (640 ננומטר)
BD Accuri C6 Software BD Biosciencesשולטת במערכת ציטומטר הזרימה BD Accuri C6 על מנת לרכוש נתונים, להפיק סטטיסטיקות ולנתח תוצאות
bFGFPeproThec, DBA100-18Bגורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים 
צנטריפוגה CL30RTermo fisher Scientific11210908זהו מכשיר המשמש להפרדת נוזלים, גז או נוזל, המבוסס על צפיפות
CO2 אינקובטור 3541Termo fisher Scientific317527-185הוא מבטיח תנאי גידול אופטימליים וניתנים לשחזור עבור תרביות תאים
קולגנאז, סוג IV קולגנאז17104019Technologies הוא פרוטאז המבקע את הקשר בין חומצת אמינו ניטרלית (X) לגליצין ברצף Pro-X-Glyc-Pro, הנמצא בתדירות גבוהה באזמל
חד פעמי קולגן Swann-Morton501הוא משמש לחיתוך רקמות
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose עם L-גלוטמין עם נתרן פירובט
EGF PeproThec, DBAAF-100-15גורם גדילה אפידרמיס 
סרום בקר עובריGibco מבית Life Technologies10270-106FBS הוא תוסף מדיה פופולרי מכיוון שהוא מספק מגוון רחב של פונקציות בתרבית תאים. FBS מספק חומרים מזינים, גורמי גדילה והצמדה ומגן על התאים מפני נזק חמצוני ואפופטוזיס על ידי מנגנונים שקשה לשחזר במערכות מדיה נטולת סרום (SFM)
Filtropur BT50 0.2,500 מ"ל מסנן עליון לבקבוקSarstedt831,823,101זהו מכשיר המשמש לסינון תמיסות
Flexitube GeneSolution עבור PRNPQiagenGS56214 siRNAs עבור גן Entrez 5621. רצף יעד N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
הפתרון של האנק 1xGibco על ידי טכנולוגיות חיים240200083הפונקציה החיונית של Hanks′ תמיסת מלח מאוזנת היא לשמור על pH כמו גם על איזון אוסמוטי. הוא גם מספק מים ויונים אנאורגניים חיוניים לתאים
HiPerFect Transfection Reagent Qiagen301705HiPerFect Transfection Reagent הוא תערובת ייחודית של ליפידים קטיוניים וניטרליים המאפשרת ספיגה יעילה של siRNA ושחרור יעיל של siRNA בתוך התאים, וכתוצאה מכך הפלת גנים גבוהה גם בעת שימוש בריכוזי siRNA נמוכים
Neurobasal A Gibco by Life Technologies10888022Neurobasal-A Medium הוא מדיום בסיסי המיועד לתחזוקה והבשלה ארוכת טווח של נוירונים טהורים במוח לאחר לידה ובוגרים.
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde שימש לקיבוע תאים וקטעי רקמות במהלך הליכי צביעה
פניצילין/סטרפטומיצין EurocloneECB3001D הוא משמש להשלמת מדיה של תרבית תאים כדי לשלוט בזיהום חיידקי
מי מלח חוצץ פוספט  (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS היא תמיסת מלח מאוזנת המשמשת לטיפול וטיפוח של תאי יונקים. PBS משמש להשקיה, שטיפה ודילול של תאי יונקים. חציצה של פוספט שומרת על ה-pH בטווח הפיזיולוגי
TC-Platte 6 היטב, תא +, FSarstedt833,920,300זהו משטח גידול לתאים דבקים
תרבית רקמות T-25, תא +, כובע מאווררSarstedt833,910,302בקבוק תרבית רקמות T-25, פוליסטירן, משטח גידול תא + לתאים דבקים רגישים, למשל תאים ראשוניים, צוואר משומר, כובע אוורור, צהוב, סטרילי, נטול פירוגן, לא ציטוטוקסי, 10 יח'/שקית
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1חומר פעילי שטח לא יוני בשימוש נרחב לשחזור רכיבי ממברנה בתנאים קלים שאינם דנטורציה
טריפסין-EDTA EurocloneECB3052D טריפסין יבקע פפטידים בצד הטרמינלי C של שאריות חומצות אמינו ליזין וארגינין. טריפסין משמש להסרת תאים דבקים ממשטח תרבית
צינורSarstedt62,554,502צינור 15 מ"ל, 120 מ"מ x17 מ"מ, PP
VBH 36 C2 סטריל קומפקטיST-003009000מציע הגנה מוחלטת לסביבה ולעובד
ZEISS Axio Vert.A1 – הפוך  מיקרוסקופZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 מספק מחיר כניסה ייחודי ויכול לספק את כל הטכניקות הניגודיות, כולל שדה בהיר, ניגודיות פאזה, PlasDIC, VAREL, ניגודיות אפנון הופמן משופרת (iHMC), DIC ופלואורסצנטיות. שלב תאורת LED להדמיה עדינה עבור תאים עם תווית פלורסנט. Axio Vert.A1 מעוצב ארגונומית לעבודה שגרתית וקומפקטי מספיק כדי לשבת בתוך קולטי אדים של תרבית רקמות.
Life בקבוק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IVWestern BlotTrypsin EDTAEGF bFGFPrP siRNA

מאמרים קשורים