מאמר שיטה

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

DOI:

10.3791/59285

⸱

12 באפריל 2019

 , 
1Department of Biology, Harper College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקליין פוספטאז (ALP) הוא אנזים נפוצות הביע בתאים prokaryotic והן האיקריוטים. זה ה מזרז הידרוליזה של פוספט monoesters של מולקולות רבות ב- pH בסיסי והוא ממלא תפקיד חיוני בחילוף החומרים פוספט. בבני אדם, ALP האיקריוטים הוא אחד האותות אנזימטי שנמצאות בשימוש תכוף ביותר באבחון מחלות שונות, כגון לחסימת מרה תוך כבדית, רככת. ב- S. aureus, ALP מזוהה באופן בלעדי על קרום התא; זה מתבטא גם כטופס הפרשה גם כן. ובכל זאת, מעט מאוד ידוע על תפקודו של ביופילמים.

מטרתו של כתב יד זה היא לפתח וזמינותו מהיר ואמין למדידת פעילות ALP biofilm S. aureus שאינה דורשת בידוד חלבון. באמצעות פוספט p-nitrophenyl (pNPP) כמו מצע, מדדנו פעילות ALP biofilm S. aureus שהוקמה בשנת 96-ובכן תרביות רקמה צלחות. הפעילות מבוססת על היווצרות של המוצר מסיסים התגובה נמדד על ידי ספיגת 405 ננומטר. מהות השיטה צלחת 96 תרביות רקמה טוב תפוקה גבוהה מספק שיטה לשחזור והרגיש ALP פעילות מבחני. ניתן להאריך אותו הדבר הניסיונית להגדיר גם למדוד סמנים מולקולריים חוץ-תאית אחרים הקשורים ביופילמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקליין פוספטאז (ALP) מתבטא ubiquitously בשני תאי האיקריוטים prokaryotic ו-1. זה יכול לעודד את הידרוליזה של monophosphate של מולקולות שונות כגון נוקלאוטידים, חלבונים, אלקלואידים, אסטרים פוספט ו- anhydrides של חומצה זרחתית. בבני אדם, ALP האיקריוטים קיים ברקמות רבות, כולל הכבד, עצם, המעי ו השליה2. זה משחק תפקידים חשובים זירחון חלבונים, צמיחת תאים, אפופטוזיס, תהליכים בתאי גזע, כמו גם מינרליזציה השלד נורמלי. ALP האיקריוטים הוא גם מחוון מפתח נסיוב לנוכחות של מחלות עצם, כבד, ובאיברים אחרים רקמות/כאשר מוגבה3,4.

Prokaryotic ALP זוהתה במגוון של תאים חיידקיים, כולל e. coli5,6, S. aureus7 וכמה חיידקים שכיחים של כרס מעלי גרה קרקעות8. פעילות ALP חיידקי שימשה ביוסנסור זיהוי חומרי הדברה, מתכות כבדות9 ו זיהום בקטריאלי10. הביטוי המכונן של ALP שימש כדי לזהות Staphylococci11 וכדי להבדיל בסרישיה Enterobacter12. בהמשך הוא הציע כי ייצור ALP המכונן הוא מתואם עם פתוגניות staphylococci13. למרות ALP נחקרה הגדרות שונות3,4, עדיין מעט הוא דיווח על הפעילות שלה פונקציה בתרבויות biofilms.

ממבנה biofilm תועד חיים חיידקי מתפקדת באופן שונה לעומת שלו עמיתו של תא החיידק אל-אווירני עצמאי14. ב- S. aureus, היווצרות biofilm זוהתה במגוון תנאים קליניים וחשבונות עמידות לאנטיביוטיקה, דלקת כרונית15,16. דווח כי הרבה מולקולות להימצא במטריצה biofilm כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, אך המנגנון של ביופילמים אינו מובן במלואו14. כדי להבין את התפקיד של ALP ב ביופילמים, אנו תרבותי S. aureus biofilms ב 96 תרביות רקמה טוב צלחות, מדדו את הפעילות ALP באמצעות פארא-nitrophenylphosphate (pNPP).

כבר בשימוש נרחב כדי למדוד ALP פעילות6,17,18, והיא מצע מוכן לשימוש עבור ALP pNPP המולקולה. זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים המבוסס על ההמרה של פוספט פארא-nitrophenyl (pNPP) כדי פארא-nitrophenol וכתוצאה מכך מוצר צבעוניים-405 ננומטר. לעומת אחרים assay ALP קונבנציונליים, כגון agarose ג'ל אלקטרופורזה19, משקעים agglutinin (WGA) נבט חיטה, WGA-HPLC20, וזמינותו הזה הוא מאוד ספציפי, רגיש, קל, והם הכי חשוב, מאפשר גבוהה תפוקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה בינונית

  1. להכנת 1 ליטר של ציר סויה Tryptic (TSB): לתוך 1 L של מים מזוקקים, להוסיף 15 גרם של הלבלב תקציר של קזאין, 5 גר' papaic תקציר של ארוחה סויה, דור 3 של נתרן כלורי, 2.5 גר' דקסטרוז ו- 2.5 גר' dipotassium פוספט. לעקר לפני השימוש.
  2. עבור Tryptic סויה אגר (TSA), להוסיף 15 גרם של אגר 1 ליטר של TSB, החיטוי. אז תן לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. בשלב הבא, יוצקים ביחס של 20 מ"ל לכל צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
  3. Biofilm תרבות בינוני: להוסיף 10 גרם של גלוקוז 1 ליטר של TSB בלוק. לחטא על-ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 µm.

2. S. aureus ביופילמים בצלחת תרביות רקמה טוב 96

הערה: Biofilm S. aureus הוא תרבותי כפי שתואר לעיל6,21.

  1. לחסן המושבה בודדים אחד של S. aureus מ TSA 10 מ"ל של TSB ולגדול בן לילה ב 37 º C.
  2. לדלל את התרבות לילה לתוך 10 מ"ל של TSB/גלוקוז (10 גרם/ליטר) ביחס של 1: 100 (v/v). מערבולת בעדינות כדי לערבב על ריכוז עקבית.
  3. להעביר 200 מ של תרבות מדולל לתוך סך של 18 וולס (יותר לקבוצות ניסיוני, כאלה שאינם biofilm פקד להציע יחסים ALP פעילות6) מ 96 אחד טוב בצלחת. להשתמש שלישיות עבור כל נקודה בזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות. ראה שלב 3.2.
  4. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה biofilm היווצרות6,21.
  5. Decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
  6. לשטוף כל טוב עם 1 x פתרון פוספט buffered (PBS, pH 7.4), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 15,000 x g ו decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.

3. מדידה של ALP פעילות ב- S. aureus Biofilm

הערה: פעילות ALP נמדדה כפי שמתואר6,18.

  1. להוסיף 75 מ של מצע ALP במאגר המורכב pNPP זמינים מסחרית כדי מכל קידוח מהשלב 2.6 ולהתחיל את הזמן הקלטה. לתעד כל נקודת זמן דולר.
  2. לאחר דגירה לזמן מגוונת: 0 min (בקרה), 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות, ו- 75 דקות בהתאמה, להוסיף µL 75 של NaOH M 5 כדי לעצור את התגובה.
  3. Centrifuge את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 15,000 x g.
  4. העברת µL 100 של תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה טוב 96 למדידה ערכי צבע מוחלטים.
  5. למדוד את ספיגת מכל טוב-405 ננומטר באמצעות 96 ובכן צלחת הקורא. לנצל את הזמן 0 דקות הצבע בארות כדי לשלוט על רעש רקע של 405 ננומטר.
  6. חזור על הניסוי כולו בשלושה לוחות טוב 96 בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג תוצאה נציג של ALP פעילות מתרבויות biofilm של S. aureus 96 צלחות טוב תרביות רקמה. 75 μL של פתרון זמין מסחרית pNPP נוספה כל טוב, מודגרות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה לזמנים שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות, בהתאמה) μL 75 של 5 M NaOH נוספה כדי לעצור את התגובה. המוצר ואז נמדד קורא צלחת טוב 96-405 ננומטר. כל נקודת זמן חזר על עצמו בשלישיות של לוח אחד טוב 96 ולאחר הניסוי כולו חזר על עצמו ב- 3 לוחות טוב 96 בודדים.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב- assay שלנו, השתמשנו pNPP כמו המצע אלפ. זהו הפתרון עובד המיועד אליסה, דילול לא נדרש. לאחר הידרוליזה על ידי ALP, מוצר צהוב מפתחת, ניתן למדוד-405 ננומטר. בסוף התגובה אנזימטיות, אנו בקצרה centrifuged את הצלחת היטב 96, להעביר את תגובת שיקוע צלחת טריים טוב 96 כדי למדוד את ספיגת באמצעות קורא צלחת. מצאנו כי צנטריפוגה נוסף השלב זה קריטי, כיוון שהיא מגבירה את מרקם של ספיגת-405 ננומטר, כנראה על ידי ביטול כל התאים מושעה אפשרי שייגרם במהלך התגובה אנזימטי.

עבור ביופילמים, אנו משתמשים μL 200 לדילול בטחונו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ויליאם רייני הארפר המכללה, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו במתקן לערוך ניסויים אלה. אנו מודים גם היסוד מקגרו היל על תמיכתם הנדיבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgarVWR9002-18-0
צנטריפוגה אפנדורףתומאס סיינטיפיק5810
גלוזVWR50-99-7
כדורי NaOHVWRSS0550-500GR
פרה-ניטרופנילפוספט (pNPP) SigmaP7998-100MLריכוזים אופייניים של מצעים נוזליים pNPP, המשמשים לעתים קרובות במבחני חיסון מקושרים לאנזים (ELISA), נעים בין 10 ל-50 מ"מ. בדומה לרוב המצעים הנוזליים המוכנים לשימוש של pNPP כמו זה המשמש כאן, ריכוז ה-pNPP המדויק אינו נחשף בשל אופיו הקנייני.
10x PBS, pH7.4.
173 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
8 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4		SigmaP3288-1VL
קורא צלחותBiotekEL808
S. aureusATCCATCC25923
אגר סויה טריפטי             15 גרם/ליטר TSBVWR9002-18-0
מרק סויה טריפטי :          גרם/ליטר
עיכול לבלב של קזאין............ 15.0
עיכול פפאי של קמח סויה......... 5.00<> נתרן כלורי.............................. 3.00< > דקסטרוז........................................   2.50<> דיפוטסיום פוספט.................. 2.50		VWR90006-098
96 צלחות תרבית רקמותבאר BD6902D09תחתית בצורת U

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  2. Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).
  3. Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).
  4. Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
  5. Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
  6. Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
  7. Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
  8. Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
  9. Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
  10. Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
  11. Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
  12. Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
  13. Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
  14. Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  15. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).
  16. Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
  17. Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
  18. Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
  19. Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
  20. Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
  21. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
  22. Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pNPP96405

מאמרים קשורים