מאמר שיטה

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יוצר שיטה של השומנים droplet בידוד והיטהרות מן העכבר כבדים, באמצעות ערכת בידוד ומבוססת רשתית תוך-פלזמית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השומנים טיפות (LDs) הם ביו organelles נמצא בתוך ציטוזול את האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic. LDs מורכבים ליפידים ניטרלי עטוף ידי טפט של פוספוליפידים וחלבונים. שומנים LD הכבד, כגון סרמידים חלבונים הם מעורבים כמה מחלות הגורמות steatosis כבדית. למרות שיטות קודמות הוקמו לבידוד LD, הן דורשות זמן הכנה של ריאגנטים, שלא תוכננו עבור בידודו של תאים subcellular מרובים. אנחנו ביקשו להקים פרוטוקול חדש כדי לאפשר את ניתוקה של LDs רשתית תוך-פלזמית (ER), lysosomes של כבד עכבר אחת.

זה עוד רחוק, ריאגנטים כל שימוש בפרוטוקול המובאים כאן הם זמינים מסחרית ודורשים הכנה ריאגנט מינימלי מבלי להתפשר על טוהר LD. כאן אנו מציגים נתונים השוואת פרוטוקול חדש זה לפרוטוקול הדרגתיות סוכרוז סטנדרטי, הוכחת טוהר דומות, מורפולוגיה, ועם תשואה. בנוסף, נוכל לבודד ER ו- lysosomes שימוש באותה דגימת זרע, מתן נתונים היסטוריים תובנה היווצרות, שטף תאיים של שומנים וחלבונים הקשורים שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs הם ביו organelles נמצא את ציטוזול של התאים האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic1,2,3. ליבת LD מורכב ליפידים נייטרלי כמו האסטרים כולסטרול טריגליצרידים (TG). הם גם מכילים סרמידים, מעורב הסלולר איתות המסלולים4,5ביואקטיביות שומנים. LDs מוקף של טפט פוספוליפיד, מצופה עם חלבונים, כולל את perilipin חלבונים perilipin 2 (PLIN2) ו- 3 (PLIN3)1,5,6. גם בהווה הם אנזימים lipogenic, lipases וקרום חלבונים סחר אשר קושרו מספר מחלות הכבד steatotic, כולל מחלת כבד שומני, מחלת כבד אלכוהולית של הפטיטיס C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs נחשבים טופס של הממברנה החיצונית של המיון ולהכיל TG לאחרונה מסונתז הטרייה ER-derived חומצות שומן בחינם11. עם זאת, נותר לא ידוע אם ליפידים במאגר באד, להישאר מחובר, או הדליות ה ER6,11, שהופך את ניתוקה של תעודות זהות ללא מיון טכנית מאתגר. חומצות שומן בחינם מנחים של תעודות זהות על-ידי הפעולה של פני השטח lipases כדי לספק ייצור אנרגיה או קרום סינתזה. בנוסף, LDs יכול להיות מושפל ויה lipophagy בתור מנגנון רגולטורי וכדי לייצר חומצות שומן בחינם12.

מלבד ER lysosomes, ישנם אחרים organelles — כגון המיטוכונדריה, endosomes, peroxisomes וקרום פלזמה — זה נמצאים בתוך האגודה קרוב של LDs11. פוליגמיה חזק זה מקשה לבצע מיצוי טהור של LD. עם זאת, צפיפות נמוכה מולדת של ליפידים נייטרלי ניתן לקחת לנצל באמצעות צנטריפוגה5.

באופן מסורתי, LDs היו מבודדים באמצעות סוכרוז דחיסות צבע1,5,13. עם זאת, שיטות אלה לא תוכננו כדי לבודד organelles אחרים. בנוסף, הם דורשים את הכנת ריאגנטים גוזלת זמן. פרוטוקול זה מסתגל של בידוד בחדר המיון זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לאפשר בידוד LD. אנו משתמשים המאגר שאיבה שסופק על-ידי ערכת, הוספת שלב בידוד LD. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור מיון ובידוד lysosomal באמצעות הדגימות אותו, ומאפשר תמונה מקיפה יותר של מחזור החיים של תעודות זהות. לאימות שיטה חדשה, אנחנו assay LD התשואה, מורפולוגיה, לגודל ו טוהר. אנו משווים את התוצאות המובאות לאלו שהושגו עם פרוטוקול נפוץ ניצול הדרגתי סוכרוז לבידוד LD.

השתמשנו של 10 עד 12-בת, 20 גרם הנשי C57BL/6 העכבר התענה עבור 16 h (הסרת מזון בשעה חמש בערב במשך תקופה של בידוד LD 9.00 A.M.) עם גישה חופשית למים. התשואה טיפוסי של TG 0.6 מ ג/גרם כבד, LD חלבון, זה הכבד 0.25 mg/g. זה מספק מספיק חומר immunoblots ~ 10 מאת דף מרחביות. הפרוטוקול להלן הפרטים ריאגנטים בשימוש, פרוטוקול מתאים כבד יחיד 1 g. פרוטוקול בידוד הדרגתיות סוכרוז מותאמת של סאטו14 ו וו15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו על ספסל מעבדה עם ציוד מגן אישי המתאים עבור אבטחה רמה 1, כולל חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפי מגן. הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת פנסילבניה. נעשה כל מאמץ כדי למזער את אי נוחות בעלי חיים, בעלי החיים היו בכבוד אנושי.

1. LD בידוד באמצעות ערכת בידוד בחדר המיון

  1. הכנה
    הערה: הכמויות המפורטות מתאימים יחיד 1 g העכבר כבד.
    1. הכן 10 מ ל x 1 חילוץ מול מאגר (IE מאגר, הערכה בידוד ER) על ידי דילול 2 מ של מאגר IE x 5 עם 8 מ ל מים הנדסה גנטית. מגניב המאגר על-ידי הצבתו על קרח.
    2. הכן 100 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    3. הכן 10 מ"ל של האתר-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl p. 5% פוליאתילן גליקול (PGPE) על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    4. מגניב לכל הצינורות על ידי הצבת אותם על קרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.
    5. מגניב כל הנדרש צנטריפוגות 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה עבור 15 מ"ל צינורות, צנטריפוגה במהירות גבוהה עבור צינורות 50 מ ל, ultracentrifuge.
    6. לחטא מלקחיים, חיתוך מספריים על-ידי autoclaving.
  2. הכנת הרקמה
    1. המתת חסד את העכבר על-ידי הצבתו בחדר מלא 100% CO2 עבור 10 דקות אישור המתת חסד על-ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם.
    2. שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים חיתוך, לחתוך את שכבות העור והשריר של הבטן על הציר הקדמי/אחוריים כדי לחשוף את הכבד.
    3. חותכים את הרצועות מתחבר הכבד הסרעפת ואת המעי. להשתמש מלקחיים למשוך המעי מן הכבד, לכיוון האחורי, כדי לחשוף את הרצועות.
    4. לחתוך בין הכבד קשת הצלעות הגבי, נע והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה עד הכבד משוחרר.
    5. להעביר את הכבד קר 5 ס צלחת פטרי עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x.
    6. לשטוף את הכבד 2 x על פלטפורמה נדנדה ב- 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי. יוצקים את 1 x PBS לאחר כביסה הסופי.
    7. להשתמש בלהב כירורגי סטרילי גודל 10 (ראה הטבלה של חומרים) כדי קוביות הכבד לחתיכות 3-5 מ מ ב- 5 ס מ פטרי (איור 1 א').
    8. לשטוף את הכבד קצוץ 2 x עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי.
      הערה: בידוד ליזוזום, להעביר 0.5 גר' כבד מהמגן 45 מ ל נקי, בצע את ההוראות שסופקו על ידי החילוץ ליזוזום קיט (ראה את הטבלה של חומרים).
    9. Decant 1 x PBS ולהעביר את חתיכות כבד קצוץ קר 45 מ ל דאונס מהמגן. ודא שכל החלקים נלך לתחתית מהמגן.
    10. הוסף mL 7 קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), homogenize על הקרח על ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. ודא כי איחדו מגיע לתחתית מהמגן במהלך כל קו.
    11. להעביר את homogenate (איור 1B) שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.
    12. לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), להוסיף את זה לשאר homogenate.
  3. בידוד LD
    1. להסיר גרעינים על ידי צריך שתוציאו את homogenate ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 ° C (איור 1C).
    2. להעביר את תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית) שפופרת צנטרפוגה חדש, קר 50 מ. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון של הצינור 15 מ"ל הוא resuspended לפני העברת את מערכת העצבים ההיקפית.
    3. לקחת את µL 100 aliquot של מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.
    4. כדי להסיר את המיטוכונדריה, centrifuge המדגם מערכת העצבים ההיקפית, לא aliquot, קירור ומפרידה במהירות גבוהה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
      1. אופציונלי: LD גולמי (המשטרתי) מבודד (עם ציטוזול וזיהום קרום התא), לאסוף את השכבה העליונה השומנים בעזרת פיפטה מזכוכית ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.7 מ. המשך סעיף 1.4.
    5. להעביר את תגובת שיקוע postmitochondrial (PMS) צינור ultracentrifuge. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון הוא resuspended לפני העברת את תסמונת קדם וסתית.
    6. לקחת את µL 100 aliquot המחזור לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.
    7. למלא עם צינור ultracentrifuge עד הקצה, לזכותו קר 1 x מאגר IE כדי למנוע את הצינור קורסת במהלך ultracentrifugation.
    8. לאזן את הדגימות, centrifuge אותם ב ultracentrifuge ב 100,000 x g עבור 60 דקות ב 4 ° C (איור 1D).
    9. כדי להסיר את שכבת LD, להטות את הצינור בזווית של 45 מעלות ולהשתמש פיפטה מזכוכית של האחות. העברה בגדר צינור microcentrifuge mL 1.7 קר.
      הערה: בגדר מכיל ER מבודד. השתמש את השבר הזה במורד הזרם לבידוד ER.
    10. לאסוף 100 µL של פוסט-ER תגובת שיקוע (פי) מתחת לשכבת ליפיד לניתוח טוהר.
  4. LD כביסה
    1. להוסיף 1 x PBS השבר LD שליקט צינור microcentrifuge 1.7, את הנפח הכולל של 1.3 מ.
    2. מערבולת המדגם.
    3. צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה כל שאריות תאים. חממו את הצינור בעדינות בידיים כדי לעזור resuspend את השכבה LD. להעביר את תגובת שיקוע, כולל שהשכבה השומנים, צינור microcentrifuge 1.7 מ.
    4. חזור על צעדים 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, עד בגדר אינה גלויה.
    5. להוסיף 1 x PBS LD ללא גלולה supernatant לאמצעי הסופי של 1.5 מ. לשטוף את השבר השומנים על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 º C.
    6. הסר 1 מ"ל של PBS x 1 (מתחת לשכבת השומנים) עם פיפטה מזכוכית מבלי להפריע השכבה השומנים.
    7. חזור על שלבים 1.4.5 ו 1.4.6 4 x x-5, עד מגניב 1 x באופן חזותי שקוף עם אין עכירות.
    8. להסיר את כל PBS 1 x מתחת לשכבת השומנים, באמצעות פיפטה של זכוכית (איור 1E).
    9. השתמש את התוצאה, שבריר LD טהור, לניתוח במורד הזרם.
  5. LD כימות חלבונים על ידי assay חומצה bicinchoninic
    הערה: אין להשתמש assay חומצה bicinchoninic (BCA) אם מורפולוגיה LD הוא לפנות לבדיקה.
    1. Resuspend את תעודת הזהות של 500 μL של 5% PGPE.
    2. מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מערבולת, דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות להתקרר.
    3. חזור על שלב 1.5.2 x 2 נוספים.
    4. Sonicate הדגימות במשך חמש דקות עם בן 30 + s/ביטול מחזור, בעוצמה בינונית.
    5. לנרמל את הדוגמאות על ידי מדידת ריכוז חלבון כל טוהר ניתוח דוגמאות, השבר LD מאת BCA וזמינותו.

2. LD בידוד באמצעות סוכרוז דחיסות צבע

  1. הכנה
    1. להפוך 200 מ ל TE מאגר (10 מ מ טריס-HCl [pH 7.4], 1 מ"מ EDTA [pH 8.0]). מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    2. להפוך 100 מ של 60% (w/v) סוכרוז פתרון במאגר טה על ידי המסת 60 גר' סוכרוז במאגר טה, להביא את עוצמת הקול הסופי 100 מ. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    3. להפוך 6 מ של 40% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת מ 4 ל 60% סוכרוז 2 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    4. להפוך 6 מ של 25% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת 2.5 מ של 60% סוכרוז 3.5 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    5. להפוך 4 מיליליטר 10% (w/v) סוכרוז הפתרון על-ידי הוספת מ 0.7 ל 60% סוכרוז mL 3.3 מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    6. להפוך 10 מ"ל של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז על-ידי הוספת טבליה אחת של מעכבי פרוטאז והן פוספטאז 10 מ"ל טה המאגר.
    7. להכין מאגר homogenate רקמות על-ידי הוספת 4 מיליליטר פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של 60% סוכרוז פתרון מניות. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    8. להכין מאגר כיסוי על-ידי הוספת 2 מ של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    9. הכן 100 מ של 1 x PBS על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    10. הכינו 10 מ"ל של 5% PGPE על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    11. מגניב הצינורות צנטריפוגה הבאות על-ידי הצבתם על הקרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.
    12. מגניב של צנטריפוגות נדרשים 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה (עבור צינורות 15 מ"ל), צנטריפוגה במהירות גבוהה (עבור צינורות 50 מ ל), של ultracentrifuge.
  2. הכנת הרקמה
    1. השתמש 1.2.1–1.2.9 צעדים כדי להתכונן הרקמה המגון.
    2. להוסיף 7 מ של מאגר homogenate רקמות קר, homogenize זה על קרח. על-ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. במהלך הסטרוקס חמישה, ודא שאיחדו מגיע לתחתית מהמגן.
    3. להעביר את homogenate שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.
    4. לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של רקמות קר homogenate מאגר, להעביר אותו הצינור צנטריפוגה השתמשו בעבר 15 מ"ל.
    5. להביא את עוצמת הקול של homogenate עד 10 מ"ל עם רקמת homogenate מאגר.
    6. Centrifuge המדגם ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 º C.
    7. העברה 8 מ של תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
    8. העברת µL 100 של תגובת שיקוע הנותרים כדוגמה מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר.
  3. סוכרוז הדרגתי
    1. להטות את הצינור צנטריפוגה 50 מ ל המכיל mL 8 של מערכת העצבים ההיקפית בזווית של 45°. להוסיף בזהירות 6 מ של 40% סוכרוז פתרון, המבטיח שני השלבים להישאר נפרדים.
    2. באופן דומה, לאט להוסיף 6 מ של 25% סוכרוז פתרון; לאחר מכן, הוסף 4 מיליליטר 10% סוכרוז הפתרון; לבסוף, להוסיף 8 מ של שכבת-העל של המאגר.
    3. Centrifuge המדגם ומפרידה במהירות גבוהה ב x 30,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. להעביר את השכבה העליונה המכיל את LDs לרכבת התחתית microcentrifuge 1.7 מ.
    5. לרחצה LD, בצע את השלבים בסעיף 1.4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לבצע את הבידוד LD עם הקיט מיון על עכברים כ-30 ואנו והשוו את התוצאות עם אלה בעקבות פרוטוקול בידוד סוכרוז על 40 עכברים. הממצאים שדווחה אופייניות עבור פרוטוקולים. עכברים היו התענה בין לילה עם גישה חופשית למים, להגברת LD. LD בידוד באמצעות הדרגה סוכרוז היה לפעול במקביל עם ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. דוגמאות של מערכת העצבים ההיקפית, PMS, לכל, CLDs ו- LDs שנאספו ברחבי ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. עקב מגבלת זרימת העבודה של פרוטוקול בידוד סוכרוז, נאספו רק מערכת העצבים ההיקפית, LD המבודד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביולוגיה LD הכבד יותר ויותר להיות מזוהה הרגולטור קריטי של hepatocellular הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה. כמו organelles בתום-לב, LDs הם דינמיים, אינטראקציה עם מבנים אחרים התאית, להכיל בתוך אותם רכיבים ביו-אקטיביים מעורב הומאוסטזיס השומנים והן גלוקוז. מעבר הצבע סוכרוז באופן שגרתי משמש לבידוד LD ומאפשרת החוקרים ללמוד את מבנה LD, אבל זה דורש מהם לבצע מאגרים רבים. הראו כי השימוש של ערכת זמינים מסחרית של בידוד בחדר המיון הוא כלי נוסף שיכול לשמש לא רק LD בידוד אבל טנדם בידוד של ER ו ליזוזום, המאפשר תצוגה מקיפה יותר של דינמיקה סלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר קאר מקבל תמיכה במחקר תרופות ליירט.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים במכון לחקר סרטן משפחת אברמסון. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הבאים: R01 NIH/NIAAA AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, רוברט ווד ג'ונסון קרן, הרולד עמוס רפואי פיתוח פרס הפקולטה, 7158, IDOM הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו טייס פרס P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (ג'יי). עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי NIH P30-DK050306 ולהעניק במתקניה הליבה (פתולוגיה מולקולרית, הדמיה הליבה בביולוגיה מולקולרית/ג'ין הביטוי ליבה, תא תרבות הליבה) וטייס התוכנית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BioExpress מערבולת מיקסרGeneMateS-3200-1מערבולת מיקסר
צנטריפוגה 54242 REppendorf54242 Rקירור דלפק מיקרוצנטריפוגה
רוטור: FA-45-24-11
צנטריפוגה Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6 +צנטריפוגה במהירות גבוהה בקירור
רוטור: F21S-8x50y
צנטריפוגה Sorvall Legend RT +Thermo ScientificLegend RT+Coold High Capacity צנטריפוגה
רוטור: דלי 75006445: 75006441
cOmplete מעכב פרוטאז קוקטיילסיגמא אולדריץ'04 693 116 001טבליות מעכב פרוטאז
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200מערכת סוניקציה
מטחנת רקמות Dounce (45 מ"ל)Wheaton357546השתמש בעלי
רופפיםמיצוי מי מלח עם פוספט (1x)קורנינג21-031-CM
ערכת בידוד רשתית אנדופלזמיתDulbecco Sigma AldrichER0100לערכת ER מיצוי:
מכיל:
מאגר מיצוי איזוטוני 5X 100 מ"ל
מאגר מיצוי היפוטוני 10 מ"ל
סידן כלורי, תמיסה של 2.5 מ' 5 מ"ל
OptiPrep שיפוע צפיפות בינוני 100 מ"ל
מחט קהה עם אף 1 ea.
מקור אור חיצוני לעירור פלואורסצנטיLeicaLeica EL6000
חומצה הידרוכלוריתSigma AldrichH1758חומצה הידרוכלורית
ImageJתוכנת ניתוח תמונה
הפוכה מווסתת ניגודיות מיקרוסקופLeicaLeica DM IRB
ערכת העשרת ליזוזום לרקמות ותאים מתורבתיםתרמו פישר מדעי89839לבידוד ליזוזום
מיקרוסקופ מצלמהQimaging QICAM מהיר 1394
אופטימה XL-100K אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטרXL-100Kאולטרה-צנטריפוגה
רוטור: SW41Ti
פסטר פיפטספישר סיינטיפיק22-042817
צלחת פטרי 5 ס"מפישר סיינטיפיקFB0875713A
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001טבליות מעכב פוספטאז
להב כירורגי סטרילי #10PioneerS2646
סוכרוזפישר סיינטיפיקS5-500טריגליצרידים גבישי / מוסמך ACS
ערכת ליקוויקולורStanbio 2200-225ערכת טריגליצרידים קולורימטריים
Tris BaseFisher ScientificBP152-1עבור מאגר TE
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, פוליאתילן גליקול p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-אתר פניל, מגיב ליזה חלבון
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038עבור מאגר TE
של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Endoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

מאמרים קשורים