מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

סיכום

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

תקציר

עבודה זו מדגימה שיטה חדשה למדידת את היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). קצב חום שיא נצפתה לאחר זריקה אחת של הפתרון המצע לתוך פתרון אנזים הוא מתואם עם פעילות אנזים. זריקות מרובות של המצע לתוך אותו אנזים פתרון לאורך זמן להראות את אובדן פעילות אנזים. וזמינותו הוא אוטונומי, הדורשות כוח אדם מעט מאוד זמן, והוא החלים על מרבית התקשורת ואנזימים.

מבוא

אנזימים הם חלבונים מסוגל ותזרז מגוון רחב של תגובות אורגני. הפונקציה אנזימים רוב ב תמיסה מימית-ליד ה-pH נייטרלי וכך למנוע את השימוש בממיסים קשים. בגלל סלקטיביות גבוהה שלהם, אנזים מזורז ותגובות לייצר פחות (בחלק מהמקרים אין תוצרי לוואי) תוצרי לוואי מאשר זרזים לא בררניים כגון חומצות ובסיסים¹. זה רלוונטי בעיקר בייצור מזון שבו כל תגובות כימיות חייב להיעשות כך המוצר הסופי הוא בטוח לצריכה אנושית. כיום, אנזימים משמשים להפקת פרוקטוז גבוהה סירופ תירס², גבינה³, בירה⁴, לקטוז חלב⁵ומוצרי מזון חשוב. בעוד מאמר זה מתמקד אנזים לשימוש בתעשיית המזון, ישנם שימושים רבים ומגוונים עבור אנזימים כולל סינתזה התרופות, כימיה ירוקה.

השירות של אנזימים הוא מוגבל על ידי היציבות של פעילות אנזים, אשר תלויה שמירה על מבנה תלת-ממדי של האנזים. מבנה האנזים יכול התייצב על-ידי שינויים כגון PEGylation⁶, קיבעון על תמיכה מלאה⁷, שינויים גנטיים⁸ו פורמולציות. כיום, אנזים יציבות נמדד בדרך כלל על ידי calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), פעילות אנזים הקצה של מבחני⁹. DSC מודד את הטמפרטורה שבה מתגלה אנזים; גבוה יותר הטמפרטורה, המבנה יציבים יותר. עם זאת, אובדן של פעילות מתרחשת לעיתים קרובות בטמפרטורה נמוכה יותר מהנדרש כדי לגולל את אנזים או תחומים בתוך ה אנזים¹⁰. לכן, DSC אינה מספיקה לקבוע אם השינוי האנזים מגדילה את היציבות של פעילות אנזים. הקצה של אנזים מבחני הן בדרך כלל זמן אינטנסיבי, דורשים דוגמאות מרובות, לעתים קרובות כרוך תגובה ערכי צבע מוחלטים בשילוב אינה ישימה פתרונות מאוד צבעוניים או אטום או המתלים.

עבודה זו מדגימה שיטה למדידה ישירה היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). המרכז לטניס בישראל מודד את הקצב של חום שוחררו או נספג במהלך תגובה. מאז כמעט כל התגובות לייצר או קולטים חום, ITC יכול לשמש עבור רוב התגובות מזורז-אנזים, לרבות תגובות לא תגובה בשילוב או להופיע בתקשורת אטומים כגון חלב. ITC שימש במשך עשורים רבים כדי למדוד פרמטרים כימיים קינטי עבור סוגים רבים של תגובות, אבל פרוטוקול המובאת כאן מתמקד בשימוש ITC כדי למדוד את קצב חום שיא של תגובות מזורז-אנזים ומדגים כי פעילות אנזים הוא באופן ליניארי בקורלציה עם שיעור שיא החום. ITC מדידות של שיא החום המחירים בעיקר אוטונומי, דורשים מעט מאוד זמן צוות ההתקנה ולנתח.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. 1,000 מ ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר ב- pH 4.6
   1. למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל סיים את לימודיו.
   2. שוקל 8.2 גר' נטול מים סודיום אצטט ולהוסיף אותו הספל.
   3. מניחים את הספל על צלחת stir, למקם את מוט מערבבים הספל, להפעיל את הצלחת מערבבים ומביאים לרתיחה עד התפרקה לחלוטין.
   4. כאשר נטול מים סודיום אצטט התפרקה לחלוטין, למדוד את ה-pH של התמיסה עם מד pH מכוילת.
   5. להוסיף 1 M HCl או NaOH בהתאם להשגת רמת ה-pH 4.6 הרצוי.
   6. להוסיף מים מזוקקים עד שאמצעי האחסון סך 1,000 מ.
   7. לאחסן בטמפרטורת החדר עד השימוש.
2. אנזים פתרון
   1. הכינו 10 מ"ל של הגליל פתרון בטווח 10-30 מ"ג/מ"ל על ידי הראשון מ 8 מדידה ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 ב 15 מ"ל סיים את האנזים.
   2. הוסף את בופר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם אנזים ומנערים נמרצות עד האנזים יש התפרקה.
   3. מוסיפים עוד בופר עד שאמצעי האחסון הכולל 10 מ"ל.
   4. לאחסן את הפתרון אנזים ב 4 ° C עד השימוש.
3. פתרון המצע
   1. כדי להכין פתרון המצע בטווח 300-600 מ מ, לחשב את כמות המצע הדרושים גרמים. כדי לעשות את הריכוז הרצויה.
   2. שוקל את המצע ומניחים לתוך גביע זכוכית 100 מ
   3. למדוד 20 מיליליטר בופר באמצעות צילינדר 25 מ ל סיים את לימודיו ולאחר מכן להוסיף זה כוס זכוכית.
   4. מניחים את הספל על צלחת מערבבים ומניחים מוט מגנטי מערבבים לתוך הספל. להדליק את החימום ולהתאים את המהירות מלהיב בהתאם.
   5. אפשר לערבב להמשיך עד המצע יש התפרקה.
   6. שופכים את הפתרון המצע לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 עד שאמצעי האחסון הכוללת 45 מ. מערבבים ע י ניעור.
   7. לאחסן את הפתרון המצע בטמפרטורת החדר עד השימוש.

2. ביצוע הניסוי

1. הכנת הכלי ITC
   1. ודא כי התא הפניה נטען עם 350 µL של מים מזוקקים. לפני טעינת האנזים לתוך התא לדוגמה, ודא כי התא מדגם נוקה.
   2. ניקוי פרוטוקול-מילוי המזרק טעינה עם 500 µL של 2% לניקוי (טבלה של חומרים), בזהירות את המחט לתוך התא מדגם, למלא את התא, הסר את הנוזל בעזרת המזרק באותו. השלך את הנוזל לתוך גביע. חזור על שלב זה פעמיים עם 2% לניקוי (טבלה של חומרים), שלוש פעמים עם אתנול 70% ולאחר מכן לשטוף 10 פעמים עם מים מזוקקים.
   3. למלא את המזרק טעינה עם 450 µL של אנזים פתרון, בזהירות את המחט כל הדרך עד לתחתית התא מדגם והקש על הבוכנה עד לקו µL 100 באיטיות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
   4. לשטוף את המזרק טיטור 50 µL עם מים מזוקקים שלוש פעמים על-ידי הצבת את מחט לתוך מים לאט תופס את המים לתוך המזרק, ואז מחלק את המים לתוך מיכל פסולת.
   5. להסיר שאריות מים על ידי שטיפה עם המצע פתרון שלוש פעמים.
   6. למלא את המזרק טיטור המצע פתרון על ידי ציור הפתרון עד המזרק מלא ללא כל בועות אוויר.
   7. עם המזרק עדיין בפתרון המצע, להסיר את הבוכנה ולאפשר כ 2 µL של אוויר כדי להזין העליון של המזרק והכנס הבוכנה.
   8. הסר את ידית buret המרכז לטניס בישראל, למקם את המזרק בתוך הידית buret ולהתעסק עד חזק.
   9. לנגב את קצה בחישה עם טישו נטולת מוך, ואז בזהירות למקם את ידית buret לתוך המכשיר ITC ונעל אותה במקום.

3. הגדרת ITCrun

1. במחשב, לפתוח ITCrun ולחץ על ' הגדר'.
2. לחץ על ערבוב קצב והגדר 350 סל"ד. בדוק את גודל מזרק (µL) ולהבטיח שזה ב- 50 µL.
3. הגדר את הטמפרטורה ולחץ על ' עדכון'. מומלץ כי שלב זה ניתן לבצע לפחות שעה לפני הכנת את המרכז לטניס בישראל. דבר זה מאפשר מספיק זמן עבור כלי לחמם או לקרר כנדרש.
4. עבור הגדרת הניסוי, בחר טיטור מצטבר.
5. לחץ על הוסף כדי להתקין את הזריקות. להתאים את מרווח הזמן של הזרקת כדי 5,400 s, נפח הזרקה (µL) ועד 4 מספר זריקות ל- 4. לחץ על אישור כדי לאשר את הגדרות.
6. תיבת Equilibration, בחר equilibrate אוטומטי גדול צפוי מחממת. (אם מחממת הצפוי הם קטנים, אחד באפשרותך לבחור קטן תחת מחממת הצפוי; עם זאת, זה יגביר את הזמן equilibration).
7. להגדיר את התוכנית הבסיסית הראשונית ל-300 s.
8. להתחיל לרוץ, לחץ על להתחיל סמל ליד קצב ערבוב ולאחר מכן לחץ על התחל אשר נמצא ליד סמל מפתח הברגים.
9. שמור את הקובץ ולאפשר את המכשיר להפעיל.

4. ניתוח נתונים

1. פתח את הקובץ ב- NanoAnalyze. לחץ על נתונים ובחר עמודות נתונים.
2. בחר את כל הנתונים, העתק ולאחר מכן הדבק את הנתונים ל- Microsoft Excel.
3. להתאים אפס בסיסית על-ידי הוספת הערך הנדרש 300 s כדי שזה אפס. להחיל את התיקון על העמודה כולה מערכי שיעור חום.
4. למצוא את הערך המינימלי או המקסימלי של שער חום עבור כל זריקה באמצעות המשוואה: =MIN(cell:cell) או MAX(cell:cell). כל נקודת נתונים מייצג הפעילות האנזימטית מתרחשת שיא של האנזים אצל כל זריקה.
5. מגרש גרפים של ערכי מינימום או מקסימום נגד הזמן שבו הערך אירעה בעת טיטור.

תוצאות

התוצאות נציג איור 1 , איור 5 הצג נתונים שני אנזימים, לקטאז, אינוורטאז. לקטאז, אינוורטאז לעודד את הידרוליזה של דו-סוכר לתוך שני monosaccharides, endothermically, exothermically, בהתאמה. שתי תגובות אנזימטיות נוהלו בריכוזים אשר מנעה הרוויה של האנזים.

הנתונים לקטאז להדגים כיצד ניתן להשתמש ITC נתונים להערכת יציבות אנזים. ארבעה רציפים 4 µL זריקות של 600 מ מ לקטוז (איור 1), היו טיטרציה לתוך 20 מ"ג/מ"ל לקטאז. מרו...

דיון

היתרון העיקרי של ITC אנזים יציבות וזמינותו המתוארים כאן הוא אוטומציה. לאחר כל מאגרי המתאים ואת פתרונות נעשים, הגדרת זמן עבור כל assay הוא כ 15 דקות עבור האדם עושה את הבדיקה. לעומת זאת, מבחני קונבנציונליים עבור אינוורטאז ופעילות לקטאז דורשים בערך 2 h עם מעורבות מתמדת של האדם עושה את הבדיקה ולקחת הרבה פעילות אנזימטי מבחני הוקטנה באופן משמעותי יותר. בפרסום הקודם, הראו כיצד הנתונים מן השיטה ITC משתווה שיטה spectrophotrometric מסורתיות יותר של פעילות אינוורטאז¹¹.

יתרון נוסף ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
א-לקטוז	פישר סיינטיפיק	לא ידוע (ישן מדי)	500 גרם
נתרן אצטט, נטול מים 99% דקות	אלפא Aesar	A13184-30	250 גרם
לקטאז	MP Bio	100780
תמיסת חומצה הידרוקולרית 5 גרם, 1N	פישר סיינטיפיק	SA48-500	500 מ"ל
מד ספסל- pH	VWR	89231-622
אתנול 70%	פישר סיינטיפיק	BP8231GAL	1 ליטר
מיקרו-90	פישר סיינטיפיק	NC024628	1 ליטר (תמיסת ניקוי)