יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry
במאמר זה
סיכום
תקציר
עבודה זו מדגימה שיטה חדשה למדידת את היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). קצב חום שיא נצפתה לאחר זריקה אחת של הפתרון המצע לתוך פתרון אנזים הוא מתואם עם פעילות אנזים. זריקות מרובות של המצע לתוך אותו אנזים פתרון לאורך זמן להראות את אובדן פעילות אנזים. וזמינותו הוא אוטונומי, הדורשות כוח אדם מעט מאוד זמן, והוא החלים על מרבית התקשורת ואנזימים.
מבוא
אנזימים הם חלבונים מסוגל ותזרז מגוון רחב של תגובות אורגני. הפונקציה אנזימים רוב ב תמיסה מימית-ליד ה-pH נייטרלי וכך למנוע את השימוש בממיסים קשים. בגלל סלקטיביות גבוהה שלהם, אנזים מזורז ותגובות לייצר פחות (בחלק מהמקרים אין תוצרי לוואי) תוצרי לוואי מאשר זרזים לא בררניים כגון חומצות ובסיסים1. זה רלוונטי בעיקר בייצור מזון שבו כל תגובות כימיות חייב להיעשות כך המוצר הסופי הוא בטוח לצריכה אנושית. כיום, אנזימים משמשים להפקת פרוקטוז גבוהה סירופ תירס2, גבינה3, בירה4, לקטוז חלב5ומוצרי מזון חשוב. בעוד מאמר זה מתמקד אנזים לשימוש בתעשיית המזון, ישנם שימושים רבים ומ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת דוגמאות
-
1,000 מ ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר ב- pH 4.6
- למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל סיים את לימודיו.
- שוקל 8.2 גר' נטול מים סודיום אצטט ולהוסיף אותו הספל.
- מניחים את הספל על צלחת stir, למקם את מוט מערבבים הספל, להפעיל את הצלחת מערבבים ומביאים לרתיחה עד התפרקה לחלוטין.
- כאשר נטול מים סודיום אצטט התפרקה לחלוטין, למדוד את ה-pH של התמיסה עם מד pH מכוילת.
- להוסיף 1 M HCl או NaOH בהתאם להשגת רמת ה-pH 4.6 הרצוי.
- להוסיף מים מזוקקים עד שאמצעי האחסון סך 1,000 מ.
- לאחסן בטמפרטורת החדר עד השימוש.
-
אנזים פתרון
- הכינו 10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות נציג איור 1 , איור 5 הצג נתונים שני אנזימים, לקטאז, אינוורטאז. לקטאז, אינוורטאז לעודד את הידרוליזה של דו-סוכר לתוך שני monosaccharides, endothermically, exothermically, בהתאמה. שתי תגובות אנזימטיות נוהלו בריכוזים אשר מנעה הרוויה של האנזים.
הנתונים לקטאז להדגים כיצד ניתן להשתמש ITC נתונים להערכת יציבות אנזים. ארבעה רציפים 4 µL זריקות של 600 מ מ לקטוז (איור 1), היו טיטרציה לתוך 20 מ"ג/מ"ל לקטאז. מרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היתרון העיקרי של ITC אנזים יציבות וזמינותו המתוארים כאן הוא אוטומציה. לאחר כל מאגרי המתאים ואת פתרונות נעשים, הגדרת זמן עבור כל assay הוא כ 15 דקות עבור האדם עושה את הבדיקה. לעומת זאת, מבחני קונבנציונליים עבור אינוורטאז ופעילות לקטאז דורשים בערך 2 h עם מעורבות מתמדת של האדם עושה את הבדיקה ולקחת הרבה פעילות אנזימטי מבחני הוקטנה באופן משמעותי יותר. בפרסום הקודם, הראו כיצד הנתונים מן השיטה ITC משתווה שיטה spectrophotrometric מסורתיות יותר של פעילות אינוורטאז11.
יתרון נוסף .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| א-לקטוז | פישר סיינטיפיק | לא ידוע (ישן מדי) | 500 גרם |
| נתרן אצטט, נטול מים 99% דקות | אלפא Aesar | A13184-30 | 250 גרם |
| לקטאז | MP Bio | 100780 | |
| תמיסת חומצה הידרוקולרית 5 גרם, 1N | פישר סיינטיפיק | SA48-500 | 500 מ"ל |
| מד ספסל- pH | VWR | 89231-622 | |
| אתנול 70% | פישר סיינטיפיק | BP8231GAL | 1 ליטר |
| מיקרו-90 | פישר סיינטיפיק | NC024628 | 1 ליטר (תמיסת ניקוי) |
מקורות
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
