הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור האפיון אימונוהיסטוכימיה ולוקליזציה של מזון orexin, וקולטנים orexin, ו קולטנים אנדוקאנביאיד בבטן ובמוחות של השמנה רגילה דיאטה המושרה (DIO) בוגרים דג זברה מודלים באמצעות שיטות אימונוimmunoperixidase וכפולות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה מאוד רגיש וספציפי מעורב בזיהוי של אנטיגנים היעד בסעיפים רקמה עם נוגדנים עם תוויות. זהו תהליך רב-שלבים שבו האופטימיזציה של כל שלב חיונית להשגת האות הספציפי האופטימלי. באמצעות IHC, ניתן לזהות את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ספציפיים ולחשוף מידע על שימור אבולוציוני. יתר על כן, IHC מאפשר הבנה של ביטוי והפצה של שינויי הסמנים בתנאים פתולוגיים, כגון השמנה. IHC, בעיקר את הטכניקה החיסונית, ניתן להשתמש בדגים מבוגרים כדי לזהות את הארגון והפצה של מולקולות שימור של phylogenetically, אבל פרוטוקול IHC סטנדרטי אינו מהווה הליך מגנטי. Orexin ו אנדוקאנאיאיד הם שתי מערכות שמרו במיוחד מעורבים בשליטה של צריכת מזון פתולוגיה השמנה. שדווחו כאן הם פרוטוקולים המשמשים להשגת מידע על orexin פפטיד (OXA), קולטן orexin (OX-2R), ו קולטן קנביאיד (CB1R) לוקליזציה והפצה בבטן ובמוח של נורמלי המושרה דיאטה שמנים (DIO) מבוגרים דגים מודלים. כמו כן תיאר הן שיטות לפרוקסידאז וכפולה החיסונית, כמו גם הכנת ריאגנטים, קיבעון, פרפין-הטבעה, והקפאה של רקמת דג זברה והכנה עבור הפעילות האנדוגניים בשלב והרקע כתמים מנגד. מערכת הפרמטרים המלאה מתקבלת מניסויים קודמים של IHC, שדרכם הראינו כיצד מערכת חיסונית יכולה לסייע בהבנת ה-OXs, OX-2R והפצת CB1R, לוקליזציה ושימור ביטוי בדגי מבוגר רקמות. התמונות המתקבלות עם עוצמת אות ספציפית מאוד הובילה לאישור כי דג זברה מתאימים מודלים בעלי חיים עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיה של הפצה, לוקליזציה, ושימור אבולוציוני של סמנים ספציפיים ב מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הפרוטוקולים המוצגים כאן מומלצים לניסויי IHC בדגי מבוגרים.
מבוא
אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה קלאסית הוקמה היטב בשימוש כדי לזהות רכיבים סלולריים או רקמות (אנטיגנים) על ידי הנוגדן אנטיגן אינטראקציה1,2. ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הלוקליזציה וההפצה של biomolecules היעד בתוך הרקמה. IHC משתמשת בתגובות אימונולוגיים וכימיים כדי לזהות אנטיגנים בסעיפים רקמות3. הסמנים העיקריים המשמשים להדמיה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן כוללים צבעי פלורסנט (immunofluorescence) ו-המצע האנזים התגובות צבע (פרוקסידאז), שניהם מצוענים ל נוגדנים4. באמצעות תצפית מיקרוסקופית ניתן לקבוע את הלוקליזציה של רקמת התווית, אשר בקירוב מתאים ללוקליזציה של אנטיגן היעד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. פרוטוקול פרוקסידאז
הערה: הדגים מתקבלים על ידי פרופ ' אומיד ספארי (המחלקה לדיג, הפקולטה למשאבי טבע וסביבה, אוניברסיטת פרדוסי משהד, משהד, איראן)10.
- ניתוח רקמות
- הקריבו את דגי הדגים באמצעות שמיים במים קפואים (5 חלקים קרח/1 חלקי מים, 4 ° c); להשאיר אותם עד הפסקת כל התנועה כדי להבטיח מוות על ידי היפוקסיה.
- הסר במהירות את המעיים והמוח בשיטת החיתוך הבאה:
- מייבשים את הדג על מגבת נייר ומניחים אותו מsagittally על מחצלת מחולקת, חוסמת את החלק הגחוני של ארובת העין וחלק בשרני של הזנב.
- למעי: חותכים את העור ומסירים בזהירות את העור ושריר הבסיס מהצד של הדג עד שהאברים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נתוני הנציג עבור הפרוקסידאז הצביעת מוצגים באיור 1 ובאיור 2. אימונוהיסטוככימיים ניתוח של התפלגות שור-A ו-OX-2R בבטן של דגי מבוגרים הראו אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו-OX-2R ואת העליות שלהם ביטוי בתאי המעיים של ה-DIO. כתמים חומים עזים עבור שור-A נצפתה בתאים של המעי האמצעי והקדמי (איור 1A, A1). הביטוי החיסוני של שור-A נתן אותות ברורים בהשוואת המעיים השונים, היורדת מהקדמית לכיוון המעי האמצעי (איור 1b
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הכנה לדוגמא
הכנת הדוגמה היא השלב הקריטי הראשון ב-IHC. פרוטוקול אמין מאפשר תחזוקה של מורפולוגיה של תאים, ארכיטקטורת רקמות ואנטיגניות. שלב זה מחייב איסוף רקמות נכון, קיבוע והסדר22,23. המטרה של קיבעון היא לשמר את הרקמה ולהפחית את הפעולה של אנזימים רקמות או מיקרואורגניזמים. בפרט, שלב הקיבוע משמר רכיבים סלולאריים ומbiomolecules, מונע העברת המרכיבים הסלולריים (כגון אנטיגנים ואנזימים), מייצב חומרים סלולאריים מפני השפעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
תודות
מחקר זה היה נתמך על ידי Fondi Ricerca די Ateneo (FRA) 2015-2016, אוניברסיטת סאנניו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי CB1 | Abcam | ab23703 | |
| אנטי OX-2R | סנטה קרוז | sc-8074 | |
| אנטי-OXA | סנטה קרוז | sc8070 | |
| Aquatex | Merck | 1,085,620,050 | |
| ארנב ביוטיניל אנטי עז | וקטור מעבדה | BA-5000 | |
| חומצת לימון | סיגמא אולדריץ' | 251275 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | Nikon Eclipse Ti2 | |
| Cryostat | Leica Biosystem | CM3050S | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| מצלמה דיגיטלית | Leica Biosystem | DFC320 | |
| מצלמה דיגיטלית למיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | DS-Qi2 | |
| חמור אנטי עז Alexa fluor 488-מצומד משני נוגדנים | תרמו פישר | A11055 | |
| חמור אנטי עז אלקסה פלואור 594 נוגדנים משניים מצומדים | תרמו פישר | A11058 | |
| חמור אנטי ארנב אלקסה פלואור 488 נוגדנים משניים מצומדים | תרמו פישר | A21206 | |
| חמור אנטי ארנב אלקסה פלואור 594 נוגדנים משניים מצומדים | תרמו פישר | A21207 | |
| אתנול מוחלט | VWR | 20,821,330 | |
| תרכובת חתך קפוא | Leica Biosystem | FSC 22 מדיה | |
| H2O2 | סיגמא אולדריץ' | 31642 | |
| HCl | VWR | 20,252,290 | |
| ImmPACT DAB | וקטור מעבדה | SK4105 | |
| מיקרוסקופ | Leica Biosystem | DMI6000 | |
| Microtome | Leica Biosystem | RM2125RT | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4H2O | Sigma Aldrich | S9638 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| סרום חמור רגיל | Sigma Aldrich | D9663 | |
| סרום ארנב רגיל | Vector lab | S-5000 | |
| שעוות פרפין | Carlo Erba | 46793801 | |
| Paraphormaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| נתרן ציטראט דיהידראט | Sigma Aldrich | W302600 | |
| Triton X-100 | Fluka אנליטי | 93420 | |
| Trizma | Sigma Aldrich | T1503 | |
| VectaStain עלית ABC ערכת | וקטור מעבדה | PK6100 | |
| קסילן טהור | קרלו ארבה | 392603 |
מקורות
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
- Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology an....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
