מאמר שיטה

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

DOI:

10.3791/59321

⸱

1 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר המרה מהירה ויעילה של תאי גזע pluriפוטנטי לתוך נוירונים מוטוריים עם זהות בעמוד השדרה או הגולגולת, על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק מתוך וקטורים inducible,.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה להשגת נוירונים פונקציונלי והגולגולת מנוע הגולגולתית האדם בתאי גזע pluriפוטנטי (iPSCs). המרה ישירה לתוך תא מנוע מושגת על ידי ביטוי חוץ רחמי של מודולים חלופיים של גורמים שעתוק, כלומר Ngn2, Isl1 ו Lhx3 (אפס) או Ngn2, Isl1 ו Phox2a (ניפ). אפס ו ניפ לציין, בהתאמה, מנוע השדרה ואת הגולגולת זהות תא העצב. הפרוטוקול שלנו מתחיל עם הדור של הקווים iPSC שונה שבו אפס או ניפ משולבים באופן מובן בגנום באמצעות מעבר טרנספסון וקטור. ביטוי של הטרנסגנים נגרמת לאחר מכן על ידי דוקסיציקלין ומוביל, בתוך 5 ימים, כדי ההמרה של iPSCs לתוך MN ושלתי. ההבשלה הבאים, עבור 7 ימים, מוביל אוכלוסיות הומוגנית של MNs השדרה או הגולגולת. השיטה שלנו מחזיקה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים קודמים: הוא מהיר מאוד ופשוט יותר; היא אינה דורשת זיהום נגיפי או בידוד MN נוסף; היא מאפשרת יצירת משנה שונים MN (השדרה הגולגולת) עם תואר מדהים של התבגרות, כפי שניתן להדגים על ידי היכולת אש רכבות של פוטנציאל פעולה. יתר על כן, מספר גדול של נוירונים מוטוריים ניתן להשיג ללא טיהור מאוכלוסיות מעורבות. מנוע השדרה הנגזר של iPSC, הגולגולת והגולגולתית ניתן להשתמש בדוגמנות מבחנה של טרשת Amyotrophic לרוחב ומחלות ניווניות אחרות של תא העצב המנוע. אוכלוסיות מוטוריות הומוגניות עשויות לייצג משאב חשוב עבור סוג תא הקרנות סמים ספציפיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטוריים תא העצב (MN) ניוון משחק תפקיד סיבתי במחלות האדם כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ו ניוון שרירים השדרה (SMA). הקמת מערכות מודל לבניית תאים מחוץ לתחום, המתאימות למורכבות של האדם האנושי, היא צעד חשוב לקראת התפתחות גישות טיפוליות חדשות. המושרה בתאי גזע פלוריפוטנטי (iPSCs), אשר ניחן בתכונות בידול השושלת המדהימה pluripotent כבר נגזר ממספר מטופלים המושפעים על ידי מחלות תא מנוע1,2. קווי iPSC נוספים הנושאים מוטציות פתוגניים הקשורים מחלות MN נוצרו על ידי עריכת גנים, החל לשלוט "בריא" תאים גזע pluripotent3. קווים אלה מייצגים כלים שימושיים למידול מחלות חוץ גופית והקרנת סמים, בתנאי שהשיטות המתאימות לבידול iPSC לתוך MNs זמינים. הרציונל מאחורי הפיתוח של שיטה זו הוא לספק את הקהילה המדעית המעוניינים מחלות MN עם פרוטוקול בידול מהיר ויעיל ומעורר MNs פונקציונלי בוגרת. היתרון הראשון של שיטה זו הוא מסגרת ההוצאה להורג. עוד נקודה רלוונטית של חוזק באה מחיסול כל צעד טיהור. לבסוף, את הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ליצור שתי אוכלוסיות נפרדות של נוירונים מוטוריים.

האפשרות של יצירת תת סוגים שונים של MNs רלוונטי במיוחד עבור דוגמנות של מחלות MN. לא כל תת-הסוגים של MN פגיעים באותה מידה ב-ALS ו-SMA, והתחלתה של סימפטומים ביחידות מוטוריות שונות משפיעים מאוד על הפרוגנוזה. ב ALS, התפרצות השדרה עם סימפטומים החל בגפיים העליונים והתחתונים מוביל למוות בערך 3-5 שנים4. לעומת זאת, התפרצות בולבר, החל מניוון של MNs הגולגולת, יש פרוגנוזה הגרוע ביותר. יתר על כן, אחוז התפרצות בולבר הוא גבוה באופן משמעותי בחולים עם מוטציות ב-RNA-כריכת חלבונים פוס ו TDP-43 מאשר אנשים עם מוטציות SOD15. כמעט מכלול הפרוטוקולים החלופיים MN בידול מסתמך על הפעילות של חומצה retinoic (RA), אשר מעניקה אופי השדרה כדי להבדיל iPSCs6,7,8. זה מגביל את האפשרות של ללמוד גורמים פנימיים, אשר יכול להיות מגונן על מסוימים מסוימים MN9,10.

בקנה אחד עם עבודה קודמת בתאי גזע מעובריים של העכבר11, הצגנו לאחרונה כי בביטוי האנושי iPSCs רחמי של Ngn2, Isl1 ו LHX3 (אפס) מעורר זהות בעמוד השדרה, בעוד Ngn2 ו Isl1 פלוס PHOX2A (ניפ) לציין הגולגולת MNs12. יש לנו ולכן פיתח פרוטוקול יעיל, המוביל לייצור של MNs האדם ניחן בתכונות פונקציונלי ב 12 יום הסבב. מטרת שיטה זו היא להשיג, במסגרת זמן קצר, ללא צורך לטיהור (למשל, על ידי FACS), אוכלוסיות תאים מועשר מאוד עבור MNs עם זהות השדרה או הגולגולת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת הiPSCs האנושית

  1. הכנת צלחות מצופות מטריקס
    1. הפשרת בקבוקון אחד של 5 מ ל (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c בלילה. מניות המטריצה המקוריות מגיעות לריכוזים שונים של מניות, ובהתאם לפקטור הדילול המצוין בגליון הנתונים, ספציפי למגרש הבודדים. חשוב לשמור על המבחנה וצינורות קרח קר כדי למנוע הגילינג מוקדמת של המטריצה. מטריצת מדבקות לתוך השפופרות. של ההקפאה המוקדמת על הקרח הקפאה ללא שימוש בהקפאה ב-20 ° c.
    2. מניחים אחד על הקרח על 2 h כדי להפשיר.
    3. לדלל את העליות של מטריקס עם 20 מ ל של הצטננות/F12 בצינור 50 mL.
    4. מערבבים היטב לוותר 1 מ ל של מטריצה מדולל לתוך 35 מ"מ מנות (כמויות שוות ערך לכל שטח של מנות אחרות).
    5. שמרו את הכלים המכילים מטריצה מדוללת עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ציפוי.
      הערה: ניתן לאחסן כלים האטומים עם parafilm ב-4 ° צ' עד שבועיים.
  2. הכנת פתרון המניה (20 מ ל) ו-1x עבודה באמצעות מגיב הדיסוציאציה של התאים העדינים (ראו טבלת חומרים).
    1. התמוססות אבקה ל 10 מ"ג/mL ב-PBS (Ca2 +/mg2 + חינם).
    2. מסנן לעקר דרך קרום מסנן יקרומטר 0.22.
    3. הכינו 20 מעלות (1 מ"ל לכל אחד) ואחסן ב-20 ° c.
    4. לפני השימוש, לדלל את אחד סדרת מחלקים ב PBS (Ca2 +/Mg2 + חינם) ל 1 מ"ג/mL (1x העבודה המאביטים).
      הערה: ניתן לאחסן 1x שבועות עבודה ב -4 ° צ' עד שבועיים.
  3. . מiPSCs אנושי
    1. לפני ההתחלה: אם הוא מאוחסן ב -4 ° c, לוחות מצופים חמים לפני מטריקס בחממה ב-37 ° c עבור 20-30 דקות. לחמם את החדר בטמפרטורה כמות האדם iPSC בינונית (ראה טבלת חומרים) הדרושים. לחמם מראש את Dמאמ/F12.
    2. . משוף תרבות בינונית
    3. לשטוף iPSCs עם PBS (Ca2 +/Mg2 + חינם).
    4. הוסף פתרון דיסוציאציה עדינה של 1x (0.5 mL למנה 35 מ"מ). דגירה ב 37 ° צ' עד הקצוות של המושבות להתחיל להתנתק מן הצלחת, בדרך כלל 3-5 דקות.
    5. לשים לב לפתרון הדיסוציאציה העדינה, להיזהר שלא לנתק מושבות iPSC.
    6. שטוף את התאים עם Dמאמ/F12 (2 מ ל עבור צלחת 35 מ"מ) ומשלחים להיות זהירים לא לנתק את התאים. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
    7. הוסף בינונית iPSC אנושי (1 mL עבור צלחת 35 מ"מ).
    8. התנתק בעדינות את המושבות באמצעות מרים ניידים והעבר לשפופרת של 15 מ ל.
    9. בעדינות לשבור את הגושים תאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות או ה3-4 פעמים.
    10. מתיף את הסופרנטאנט מהפלטה.
    11. הזרע את התאים בנפח התרבות המתאים של מדיום iPSC אנושי. היחס המפוצל יכול להשתנות משורה לשורה, והוא כ-1:4-1:8. שנה את המדיום מדי יום.

2. יצירת שורות אפס ו-ניפ Inducible iPSC

  1. . זיהום תאים
    1. לשטוף את התאים עם PBS (Ca2 +/Mg2 + חינם).
    2. הוסף מגיב לדיסוציאציה של תא (ראה טבלת חומרים) (0.35 mL לצלחת 35 מ"מ) ו-דגירה ב 37 ° צ' עד שתאים בודדים מופרדים (5-10 דקות).
    3. בעדינות להשלים את ההפרדה התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות ו-3-4 פעמים.
    4. לאסוף בצינור 15 מ"ל ולהוסיף PBS (Ca2 +/Mg2 + חינם) עד 10 מ"ל. . תספור את התאים
    5. גלולה 106 תאים ולהשעות מחדש ב 100 μl של מאגר R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא, ראה טבלת חומרים).
    6. הוסף דנ א פלמיד לצורך העברה: 4.5 μg של טרנספסבל וקטור (epB-Bsd-TT-0 או epB-Bsd-TT-ניפ 12) ו 0.5 μg של המשלוח העביר את המשלוחב-13.
    7. Transfect עם מערכת אלקטרופורציה תא (ראה טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן וכמתואר בעבר3 עם הפרמטרים הבאים: 1,200 V מתח, 30 ms רוחב, 1 פעימה. זרע את התאים בינונית iPSC אנושי בתוספת עם 10 μM Y-27632 (סלע מעכבי, ראה טבלת חומרים) ב 6 מ"מ מטריצה מצופה הצלחת.
  2. בחירה עם אנטיביוטיקה.
    1. יומיים לאחר החצייה, להוסיף 5 μg/mL בלאסיפידין למדיום התרבות.
    2. רוב התאים הבלתי-מזוהמים ימותו ב48. שמור את התאים בלאסיטות לפחות 7-10 ימים כדי לבחור את התאים שאינם משולבים הטרנסגנים בגנום.
    3. לשמור על תאים מזוהמים באופן מורכב כאוכלוסיה מעורבת, המורכבת מתאים עם מספר שונה של טרנסגנים ואתרי אינטגרציה שונים, או לבודד שיבוטים יחיד.
    4. להכין צלחת נוספת כדי לבדוק ביטוי אפקטיבי של טרנסגנים, על 1 μg/mL דוקסיציקלין אינדוקציה, על-ידי RT-PCR עם התחל-Ngn2 הספציפי ביותר עבור הראשון (קדימה: TATGCACCTCCCCATAG; הפוך: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), כפי שמתואר בעבר12.
    5. בשלב זה, להקפיא את המניות של הרומן אפס וניפ-iPSC קווים בהקפאה בינונית עבור האדם iPSCs (ראה לוח חומרים).

3. תא מנוע בידול

  1. הנתק את התאים באמצעות מגיב לדיסוציאציה של תא כמתואר (שלבים 2.1.1.-2.1.3.). לאסוף תאים בלתי מתאים בצינור 15 מ"ל ו לדלל עם 5 כרכים של Dמאמ/F12. גלולה את התאים ולהשעות מחדש בינונית iPSC אנושי בתוספת עם 10 מעכב הסלע μM. ספור את התאים והזרעים על מנות מצופות מטריקס בצפיפות של 62,500 תאים/cm2.
  2. יום לאחר מכן, להחליף את המדיום עם DMEM/F12, שיושלם עם 1x יציבה L-גלוטמין אנלוגי, 1x לא חיוני חומצה אמינית (NEAA) התרבות תא תוסף ו 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין, ומכיל 1 μg/mL דוקסיציקלין. זה נחשב כיום 0 של בידול. ביום 1, רענן את המדיום ו דוקסיציקלין.
  3. ביום 2, לשנות את המדיום כדי Neurobasal סיס/B27 בינונית (נוירובינונית מדיום שיושלם עם 1x B27, 1x יציבה L-גלוטמין אנלוגי, 1x NEAA ו-0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ו-1 μg/mL דוקסיציקלין (ראה טבלת חומרים ). רענן את המדיום ו דוקסיציקלין כל יום עד יום 5.
  4. יום 5: תאים דיסוציאציה עם מגיב לדיסוציאציה של תא (ראו טבלת חומרים).
    1. לשטוף את התאים עם PBS (Ca2 +/Mg2 + חינם).
    2. הוסף את מגיב הדיסוציאציה של תא (0.35 mL עבור צלחת 35 מ"מ) ו-דגירה ב 37 ° צ' עד מפריד התא כולו מפרידה ממנה. שים לב שתאים בודדים לא יופרדו במהלך הדגירה.
    3. הוסף 1 מ ל של DMEM/F12 ולאסוף את התאים בצינור 15 מ ל.
    4. בעדינות להשלים את ההפרדה התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות ו-10-15 פעמים.
    5. להוסיף 4 מ ל של Dמאמ/F12 ולספור את התאים.
    6. בשלב זה, הקפאת מנוע תא העצב ושלתי בתא הקפאת בינונית (ראה טבלת חומרים), על פי הוראות היצרן.
    7. גלולה את התאים ולהשעות מחדש בינונית עצבית (Neurobasal סיס/B27 בינוני בתוספת 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF ו 200 ng/mL-חומצה אסקורבית, ראה לוח חומריםs) שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב.
    8. הזרע את התאים על האורשים/למינציה-או לחילופין על תמיכה מצופי מטריקס בצפיפות של 100,000 תאים/cm2. השתמש ב-μ-שקופית פלסטיק תומך עם שמיכות פולימר (ראה טבלת חומרים) לניתוח חיסוני.
  5. ביום 6, לשנות את המדיום עם המדיום העצבי הטרי נטול מעכבי סלע. בימים הקרובים, תרענן. חצי מהמדיום כל 3 ימים יש לשנות את מבנה התרבות בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק מפני השטח.

4. ניתוח חיסוני

  1. . קיבוע תאים לשטוף את התאים עם PBS (עם Ca2 +/Mg2 +) ו דגירה עבור 15 דקות ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS (עם ca2 +/Mg2 +) בטמפרטורת החדר.
    זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל וחשוד לגרום לסרטן. הימנע ממגע עם העור והעיניים וטפל מתחת למכסה כימי.
  2. החדירות עם PBS (עם Ca2 +/Mg2 +) המכיל 0.1% טריטון X-100 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בפתרון חסימת נוגדנים (ABS: 3% BSA ב-PBS עם Ca2 +/Mg2 +).
  4. דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם נוגדנים העיקרי ABS: anti-TUJ1 (1:1000; ארנב) ו anti-Oct4 (1:200; עכבר) או נגד צ'אט (אנטי כולין Acetyltransferase; 1:150; עז). ראה טבלת חומרים.
  5. מודטה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר עם החמור המתאים נוגדן משני בתוך ABS: נגד עכבר אלקסה Fluor 647 (1:250), אנטי ארנבת אלקסה Fluor 594 (1:250) ונגד עז אלקסה Fluor 488 (1:250). ראה טבלת חומרים.
  6. דגירה ב 0.4 μg/mL DAPI עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר לתייג גרעינים.
  7. הר את התאים עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים) לדימות במיקרוסקופ פלואורסצנטית.

5. אפיון פונקציונלי באמצעות טלאי-הקלטות קלאמפ

  1. הכינו את הפתרון החיצוני (נס) כדלקמן: 140 מ"מ, 2.8 מ"מ KCl, 2 מ"מ בגודל 2mm, 2 מ"מMgCl2, 10 מ"מ hepes, ו 10 מ"מ גלוקוז. הגדר את האוסמגליות בין 290-300 mΩ. כוונן את ה-pH ל 7.3 באמצעות 1N NaOH ואחסן את הפתרון ב-4 ° c.
  2. הכינו את הפתרון הפנימי: 140 mM K-גלוקונאט, 2 מ"מ הייגל, 5 מ מ באפטה, 2 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ hepes, 2 מ ג MG-ATP, 0.3 mm NA-gtp. להתאים את ה-pH ל 7.3 עם קו 1M ו לבדוק את האוסמלקיים מוגדר בסביבות 290 mΩ. הקפאת הפתרון ב-20 ° c בעלי מענה קטן.
  3. לפני הפעלת הניסויים, לחמם מראש את הפתרון NES באמבט מים על 28-30 ° c.
  4. משוך מיקרורטט בורוסיליקט (מזהה 0.86 מ"מ; OD 1.5 mm) נושאת התנגדות טיפ: 5-6 MΩ ולמלא עם פתרון תאיים לפני ההרכבה לתוך המחזיק פיפטה.
    הערה: זכור את חוטי כסף כלוריד של אלקטרודות ההקלטה התייחסות אלקטרודה אקונומיקה לפחות 30 דקות כדי ליצור שכבה אחידה של AgCl על משטח התיל.
  5. העבירו את צלחת פטרי בתא ההקלטה והרשו לחדר עם פתרון NES בשעה 1-2 mL/min. תנו לזרימה לעבור דרך מחמם מוטבע שנקבע בטמפרטורה של 30 ° c כדי לשמור על הפתרון חם.
  6. חדר הקלטה אלקטרולוגי. מתחת למיקרוסקופ זקוף הקלט זרמי ממברנה באמצעות מגבר מהדק התיקון והשגת נתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
  7. פתח את תוכנת בקרת המגבר, והגדר את רווח האות בערך 1 ואת מסנן בסל ב-10 kHz. ודא שמסנן בסל נמוך פי 2.5 מתדירות הדגימה.
  8. הגדר את הפרוטוקולים הניסיוניים עבור מלחציים מתח וניסויים מלחציים נוכחיים בתוכנת ההקלטה.
  9. בהגדרת הפרוטוקול, שנתות מצב גירוי האפיזודי ולהגדיר את תדירות הדגימה ב 25 kHz. לאחר מכן, לעבור אל הכרטיסיה צורת גל ולהקליד את המתח או הצעד הנוכחי משרעת ואורך כמו הפעל.
  10. עבור זרמי הנתרן מגודרת, להשתמש 15 שלבי מתח (50 ms משך כל אחד) מ-100 mV כדי + 40 mV (10 mV הגדל). הפעל את הפרוטוקול לאחר הטלת תא שתוקנה הפוטנציאל המחזיק של-60 mV דרך המגבר. באופן דומה, זרמים מגודרת מתח האשלגן מעורר באמצעות צעדי מתח (250 ms משך כל אחד) מ-30 mV כדי + 50 mV (10 mV תוספת) מחזיק את התא המוקלט ל-40 mV.
  11. עבור חקירת תכונות הירי של הגולגולת iPSC-נגזר MNs השדרה, תאים מלחציים, במצב הנוכחי-קלאמפ, על פוטנציאל הממברנה של-70 mV ולהשתמש 4 פולסים הנוכחי (1 משך כל אחד) של משרעת הגוברת (מ + 20 pA כדי + 80 pA; 20 pA תוספת).
  12. לרכוש עבור כל זרם מופעל מתח, פעילות ירי מעורר ושלושה מאפיינים פסיביים כמו קיבול תא שלם (Cm), עמידות קרום התא (Rm) והפוטנציאל ממברנה מנחה (RMP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיאור סכמטי של שיטת הבידול מוצג באיור 1. האדם iPSCs (WT I קו3) היו מזוהמים עם Epb-BSD-TT-אפס או Epb-BSD-TT-ניפ, הפקת, על בחירת בלטות, יציבה ושורות תא inducible12, להלן המכונה ipsc-אפס ו ipsc-ניפ, בהתאמה. תאים ההבחנה התאפיין בביטוי של סמן הפלאואון OCT4 ו-TUJ1 סמן הפאן-עצבי. ניתוח חיסוני הראה ביטוי אחיד של OCT4 בכל התאים ביום 0, בהעדר TUJ1 חיוביות (איור 2א). ביום 3, הבחנו ירידה חזקה במספר התאים OCT4-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר להמיר ביעילות את iPSCs אנושי לתוך מנוע השדרה ואת הגולגולת נוירונים בזכות הביטוי החוץ רחמי של השושלת הספציפיים שעתוק גורמים. הטרנסגנים האלה הם inducible על ידי דוקסיציקלין ו משולבים באופן מובן בגנום הודות לטרנספבאק המבוסס על מוקטור. באוכלוסיה מעורבת, עותק אחד או כמה של וקטור השני יהיה משולב באופן אקראי לתוך הגנום של תאים בודדים, הגדלת הסיכון של שינויים ביושר הגנום. יתר על כן, מבחר פרוגרסיבי של השיבוטים iPSC עשוי להתרחש לאורך זמן, עם השלכות אפשריות על בידול ועל ניתוח השוואתי של מחלות ושורות תא שליטה. בסך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות למתקן ההדמיה במרכז לחיים ננו מדע, המכון הפוליטכני איטלקית די Tecnologia, לתמיכה וייעוץ טכני. אנו אסירי תודה לחברי המרכז לחיים ננו מדע לדיון מועיל. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי מענק AriSLA (מענק הטייס 2016 "StressFUS") כדי AR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1Gכימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML מגיב דיסוציאציה של תאים
אנטי-צ'אטEMD Millipore AB144Pאנטי כולין אצטילטרנספראז. נוגדן ראשוני המשמש במבחני צביעה חיסונית. RRID: AB_2079751; מספר פריט: 2971003
נגד עזים Alexa Fluor 488 תרמו פישר סיינטיפיק A11055נוגדן משני המשמש לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. RRID: AB_2534102; מספר פריט: 1915848
נגד עכבר Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571נוגדן משני המשמש לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. RRID: AB_162542; מספר פריט: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202נוגדן ראשוני המשמש בבדיקות צביעה חיסונית. RRID: AB_398736; מספר פריט: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997נוגדן ראשוני המשמש בבדיקות צביעה חיסונית. מספר פריט: E0117
אנטי ארנב Alexa Fluor 594 מדעים אימונולוגייםIS-20152-1נוגדן משני המשמש לבדיקות אימונופלואורסצנטיות
אנטי-TUJ1 סיגמא-אולדריץ' T2200נוגדן ראשוני המשמש בבדיקות צביעה חיסונית. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566תוסף ללא סרום לתחזוקת תאי עצב
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02מדיום הקפאת תאים, המשמש כאן לאבות הנוירונים המוטוריים
BDNFPreproTech450-02גורם נוירוטרופי שמקורו במוח
BlasticidinSigma-Aldrich203350אנטיביוטיקה נוקלאוזידית המעכבת סינתזת חלבון בפרוקריוטים ובאיקריוטים
BSASigma-AldrichA2153בקר סרום אלבומין חומר חוסם למניעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים בבדיקות צביעה חיסונית
CaCl2Sigma-AldrichC3881כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
תוכנת Clampex 10מכשירים מולקולרייםClampex 10מערכת הקלטת זרמי ממברנה
Corning Matrigel hESC מוסמכת354277קורנינגהכנת קרום הבסיס משוחזרת מסרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל (EHS). משמש להדבקה של iPSC לתומכי פלסטיק וזכוכית
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1Eמדיום הקפאה ל-iPSCs אנושיים
D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G5146כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
אבקת DAPIRoche102362760014′,6-diamidino-2-phenylindole. כתם פלואורסצנטי שנקשר לאדנין– אזורים עשירים בתימין ב-DNA המשמשים לצביעה של גרעינים בבדיקות אימונופלואורסצנטיות
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005מעכב גמא סקרטאז
DispaseGibco17105-041מגיב לדיסוציאציה עדינה של iPSCs אנושיים
DMEM/F12סיגמא-אולדריץ'D6421-500MLמדיום בסיסי לתרבית תאים
דוקסיציקליןסיגמא-אולדריץ'D9891-1G& נ.ב.פ;משמש להשראת ביטוי של טרנסגנים מווקטורים של epB-Bsd-TT-NIL ו-epB-Bsd-TT-NIP
DS2U WiCellUWWC1-DS2Uקו iPSC אנושי מסחרי
E.Z.N.A ערכת RNA כוללת Omega bio-tekR6834-02למיצוי כולל של RNA מתאים אוקריוטיים מתורבתים
GDNFPreproTech450-10Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945קו iPSC אנושי מסחרי
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038חלופה ל-L-גלוטמין עם יציבות מוגברת. משפר את בריאות התאים.
כימיקלים HepesSigma-AldrichH4034לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
iScript Reverse Transcription Supermix עבור RT-qPCR ערכת Bio-Rad1708841לניתוח ביטוי גנים באמצעות qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix ביו-רד172-5121 תערובת מאסטר תגובה מוכנה לשימוש המותאמת ל-PCR כמותי מבוסס צבע (qPCR) בכל מכשיר PCR בזמן אמת
K-GluconateSigma-AldrichG4500כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
KClSigma-AldrichP9333כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
חומצה L-אסקורביתLKT LaboratoriesA7210משמש בתרבית תאים כנוגד חמצון
למיניןסיגמא-אולדריץ'11243217001מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר אולימפוס  iX83 FluoView1200מיקרוסקופ קונפוקלי לרכישת תמונות צביעה חיסונית
Mg-ATPSigma-AldrichA9187כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
MgCl2Sigma-AldrichM8266כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
מדיום הרכבה Ibidi50001פתרון הרכבה המשמש לבדיקות מיקרוסקופיה קונפוקלית ואימונופלואורסצנציה
מגבר Multiclamp Patch-clampהתקנים מולקולריים700Bמערכת הקלטת זרמי ממברנה
Na-GTPSigma-AldrichG8877כימיקלים לפתרונות אלקטרופיזיולוגיים
NaClSigma-Aldrich71376כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
NEAAThermo Fisher Scientific11140035חומצות אמינו לא חיוניות. משמש כתוסף למדיום תרבית תאים, להגברת צמיחת התאים וחיותם.
ניאון 100 μ L KitThermo Fisher ScientificMPK10096ערכת אלקטרופורציה של תאים
מערכת טרנספקציה ניאוןThermo Fisher ScientificMPK5000מערכת אלקטרופורציה של תאים
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific 21103049מדיום בסיסי המיועד לתחזוקה ארוכת טווח והתבגרות של אוכלוסיות תאים עצביים ללא צורך בשכבת הזנה אסטרוציטים
NutriStem-XF/FF תעשיות ביולוגיות05-100-1Aמדיום תרבית iPSC אנושי
Paraformaldehydeמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית157-8משמש לקיבוע תאים בבדיקות צביעה חיסונית
PBSSigma-AldrichD8662-500MLמלח מאגר פוספט של Dulbecco, עם סידן, עם מגנזיום
PBS Ca2+/Mg2+ ללאסיגמא-אולדריץ'D8537-500MLמלח חוצץ פוספט של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום
פניצילין/סטרפטומיצין תמיסת סיגמא-אולדריץ'P4333-100MLפניצילין/סטרפטומיצין המשמשת למניעת זיהום תרבית תאים מחיידקים.
פולי-אורניתיןסיגמא-אולדריץ'P4957מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
SU5402סיגמא-אולדריץ'SML0443-5MGמעכב סלקטיבי של קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 2 (VEGFR-2)
טריטון X-100 סיגמא-אולדריץ'T87874-(1,1,3,3-טטרמתילבוטיל)פניל-פוליאתילן גליקול,  טי-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול, פוליאתילן גליקול  אתר טרט-אוקטילפניל. משמש לחדירות תאים במבחני צביעה חיסונית
מיקרוסקופ זקוף מיקרוסקופאולימפוסBX51VIלהקלטה אלקטרופיזיולוגית המצויד במצלמת CoolSnap Myo 
Y-27632  (מעכב ROCK)אנזו מדעי החייםALX-270-333-M005 מעכב סלקטיבי חדיר לתאים של סליל מפותל הקשור ל-Rho המכיל חלבון קינאז (ROCK). מגביר את הישרדות ה-iPSC
μ-שקופית 8 ובכן Ibidi80826תמיכה ב-high– סוף ניתוח מיקרוסקופי של תאים קבועים
ערכת בזמן אמת;

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

מאמרים קשורים