מאמר שיטה

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59333

⸱

22 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Neurotherapeutic Development Unit (NTDU), National Institutes of Health (NIH)

במאמר זה

סיכום

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

תקציר

רעילות ציטוזה הוא פרמטר קריטי שצריך לכמת כאשר לימוד תרופות שעשויות להיות בעלי הטבות טיפוליות. בגלל זה, הרבה סמים הקרנת התרופה לנצל את הרעילות בתור אחד המאפיינים הקריטיים להיות פרופיל עבור תרכובות בודדות. תאים בתרבות הם מודל שימושי כדי להעריך את הרעילות לפני שתמשיך לעקוב אחר תרכובות עופרת מבטיח יקר יותר, עבודה אינטנסיבית בעלי חיים מודלים. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ב tdTomato ביטוי בתאי גזע האדם העצבי (המועצה לבטחון לאומי) קו. האסטרטגיה משתמשת בשני משלים משלימים להערכת מספר התא. שיטת עבודה אחת פועלת באמצעות הפחתה של 3-(4, 5-diמתילתיול-2-yl)-2, 5-diפנילטיזויום ברומיד (MTT) כדי formazan כמו פרוקסי עבור מספר התא והשני במישרין סופרת את tdTomato המבטאת NSCs. שתי הדרישות יכולות להתבצע בו זמנית בניסוי אחד ואינן העבודה האינטנסיבית, המהירה והזולה. האסטרטגיה המתוארת בהפגנה זו נבדקה 57 תרכובות במסך ראשי מנוסה לרעילות בפורמט 96-באר הצלחת. שלוש מהתצפיות הוגדרו עוד יותר בתגובה למינון של שש נקודות, תוך שימוש באותה מערכת הערכה כמסך הראשי. בנוסף למתן אימות מעולה עבור רעילות, השוואה של תוצאות שתי בחני עשוי להיות יעיל בזיהוי תרכובות המשפיעות על היבטים אחרים של צמיחת תאים.

מבוא

אחד המאפיינים החשובים ביותר שצריך להיקבע עבור תרכובת כימית כי יש פוטנציאל טיפולי הוא רעילות שלה לתאי בעלי חיים. מאפיין זה יקבע אם הסם הוא מועמד טוב למחקר מקיף יותר. ברוב המקרים, תרכובות עם רעילות מינימלית מבוקשים אך ישנם מצבים בהם מתחם בעל יכולת להרוג סוגי תאים ספציפיים הוא עניין, למשל, תרופות אנטי-מוריגניות. למרות בעלי חיים שלמים הם מערכות מודל הטובה ביותר כדי לקבוע רעילות מערכתית, העלות והעבודה מעורבים הוא מונע כאשר כמה תרכובות צריך להיבדק. כגון תרבות תא של היונקים משמש בדרך כלל כחלופה היעילה ביותר1,2. מסכי הסמים קטנים עד בינוניים הם מודאליות חשוב שדרכו רעילות ניתן להעריך בתרבות התא. מסכי אלה ניתן להשתמש כדי לחקור ספריות מסומן מיקוד מסלולים בודדים איתות. הפורמט הכללי של מסך כזה הוא בתחילה לבדוק את כל התרכובות בספרייה במינון אחד (בדרך כלל 10 μM) במסך רעילות העיקרי גישוש, ולאחר מכן לבצע מינון מעמיק התגובה במינון המסך כדי לאפיין במלואו את רעילות פרופיל של כניסות מהמסך הראשי. השיטות ליישום אסטרטגיה זו יתואר כאן ויספקו דרך מהירה, יעילה וזולה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות.

פותחו מספר שיטות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות קטנות וננו בתאי מיונקים3,4. יש לציין כי חומרים מסוימים יכולים לקיים אינטראקציה עם הספקות המספקים תוצאות מטעות, ואינטראקציות כאלה יש לבדוק כאשר מדובר במאפיינים של מסכי רעילות4. רעילות ציטודיטוקסין כוללת טריפן כחול5, לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התשובה6, alamar שיטת כחול7, מתיל אסתר (AM)8, ואת שיטת ATP9. כל אלה בחני למדוד היבטים שונים של מטבוליזם התא אשר יכול לשמש proxy עבור מספר התא. בעוד שכולם מציעים יתרונות, aszo, מלח מבוסס על מלחים כגון 3-(4, 5-diמתילthizol-2-yl)-2, 5-דיפנפניזויום ברומיד (MTT), 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfopheny)-2H-טטרזויום-5-carboxyande מלח פנימי (XTT)-1, ו-4-(3-[4- שפתי-על-2-[4-ניטרוגליצרין)-2H-5-טטרזוליו-1, 3-בנזין דיסולולאט (WST-1)10, 11 לספק דיוק טוב וקלות השימוש בעלות נמוכה. MTT, אשר ישמשו בהפגנה זו, הוא הופחת לתוך בלתי מסיסים על ידי מיטוכונדריאלי ושיעור ההמרה הזאת באופן מאוד מתאים למספר התא. מקרה זה נוצל באופן שגרתי הן בקנה מידה קטן והן לסינון ספריות עם עד 2,000 תרכובות12. ספירה ישירה של תאים על-ידי סמן המסומן בתווית מציעה שיטה נוספת להערכת המספר הסלולרי, ובשונה מהזמינותו של MTT היא יכולה לספק מידע נוסף על הדינמיקה של צמיחת הסלולר. מספר אלגוריתמים זמינים לציבור זמינים לביצוע ניתוחים אוטומטיים של ספירת תאים וקיימים גם אלגוריתמים קנייניים המהווים חלק מחבילות תוכנה לקוראי תמונות13,14. בתיאור שיטה זה, קו גזע הגוף האנושי (למועצה לבטחון לאומי) שנערך באופן גנטי כדי להשוות את תוצאות הכדאיות התאית בין שיטת mtt וספירת תאים אוטומטיים הערכה במסך הערכת רעילות של 57 תרכובות מבחן. למרות שהמטרה העיקרית של האסטרטגיה הזאת הייתה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות, יש לה יתרון נוסף של הפוטנציאל לזיהוי מעכבות צמיחה ושיפור תרכובות הצמיחה וכך מספקת שיטה יעילה לזיהוי סמים שיכולים לווסת את הצמיחה התאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות המועצה לבטחון לאומי

הערה: מניפולציה של קו המועצה לבטחון לאומי מתוארת להלן, אך ניתן להשתמש בכל קו תא לפרוטוקול זה. כל העבודות בתרבית תאים מתבצעות בארון בטיחות ביולוגי.

  1. מעיל a 96-צלחת עם מטריצות קרום מרתף/מטריתאי (ECM).
    1. הפשרה של ECM (טבלת חומרים), שתקל על ההחזקה של המועצה לבטחון לאומי, על הקרח. לדלל ECM לריכוז המתאים (בדרך כלל 1:100) ב 10 mL בינונית בסיס (הטבלה של חומרים) ולהוסיף 50 μl לכל טוב לכל אחד 60 הבארות הפנימיות של צלחת 96-באר (איור 1). השתמש רק הפנים 60 בארות כדי למנוע חפצים שעלולים לנבוע אפקט הקצה16.
    2. תנו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר או בחממה לתרבות התא (37 ° c, 5% CO2) לפחות 30 דקות.
  2. . תאי גזע עצביים
    הערה: תאים לשימוש בשיטה זו יש לגדל לפחות 80% זרימה בבקבוקון T75.
    1. תאי תרבות בבקבוקון T75 בחממה לתרבות התא ב-37 ° c ו-5% CO2 במדיום המועצה לבטחון לאומי המורכב בסיס בסיסי, B27, חומצות אמינו לא חיוניות, גלוטמין 2 מ"מ, ו-10 Ng/mL בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם (FGFb או FGF2).
    2. להסיר תאים מן החממה ברגע שהם מגיעים 80% המפגש ומוריד את מדיום המועצה לבטחון לאומי. הוסף כמות מתאימה של מגיב הדיסוציאציה של התא (3 מ ל עבור בקבוקון T75; רשימת חומרים) ו הדגירה עבור 5 דקות בחממה.
    3. לאחר הדגירה, להוסיף 7 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי ב T75 תרמוס ו פיפטה במרץ כדי להבטיח את כל התאים להיות מנותקים. העבר את פתרון התא המנתק ל-15 מ ל שפופרת ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
    4. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט מהצינור והשהה את התאים מחדש ב-10 מ ל של בינונית ולאחר מכן מונה תאים.
    5. לקרוא ריכוז של תאים כדי 200,000 תאים/mL עם מדיום המועצה לבטחון לאומי. ודא שהתאים מושעים מחדש באופן מלא לציפוי אחיד לבארות.
    6. צלחת 100 μL של תערובת התא (20,000 תאים) ב 60 בארות הפנים של 3 96-טוב צלחות כי כבר מצופה כמתואר בסעיף 1.1. השתמש בשישה מתוך שמונת החריצים של משבצות רב-ערוצי בעלת 8 ערוצים לתאי לוח בטור בעמודה.
    7. הוסף 100 μL של בסיס בינוני או מדיום לבטחון לאומי לכל הבארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מבארות החיצוני.
    8. תחת מיקרוסקופ של תרבות התא, לבדוק באופן חזותי לפחות 10 בארות על כל אחד 3 96-היטב צלחות כדי לוודא כי התאים הם שנזרע על הצפיפות הצפויה. אל תמשיכו עם המבדק אם התאים מצופים בצפיפות דלילה מדי או צפופה מדי.

2. טיפול בתאים עם תרכובות

הערה: הספרייה תוצרת בית נבדק בהפגנה זו מכילה תרכובות לווסת את wingless/משולב (Wnt), חומצה retinoic, שינוי גורם הצמיחה-בטא (TGF-β), ו קיפוד קולי מסלולים איתות כמו גם מגוון של טירולי.

  1. מסך ראשי גישוש עבור רעילות/מספר תאים
    1. מספר 50 ל-100 מ ל של עד 57 תרכובות מבחן (שולחן משלים 1) בריכוז של 10 מ"מ ב 100% diמתיל סולפוקסיד (dmso) לתוך הפנים 60 בארות של U-התחתית, V-תחתית או עגול-התחתית 96-באר צלחת עם שלושה dmso בארות כפקד (לראות איור 1 עבור מפת צלחת). זה ישמש את הצלחת המתחם הראשי עם 25 μL של תרכובת זה יכול להיות קפוא להפשיר מספר פעמים.
      הערה: לוחות בעלי תחתית שטוחה לא צריך לשמש כפי שיהיה קשה יותר לחלק כמויות קטנות של תרכובות מתוכם עם פיאור ספסל העליון.
    2. הסר את לוחיות התרבות של התאים מחממה 16-24 h לאחר פיצול כמתואר בסעיף 1 ולאחר שהוא מוריד את המועצה ההמועצה לבטחון לאומי על-ידי עמודה עם שמונה ערוצים רב-ממדי, תוך שימוש בשישה מתוך שמונה משבצות מרובות היטב. הוסף 95 μL של מדיום טרי לבטחון לאומי לתאים בכל אחד משלושת הצלחות לשכפל לוחות למקם בחזרה בחממה עד שלב 2.1.4 למטה הוא הושלם.
    3. הוסף 49 μL של המדיום המועצה לבטחון לאומי לכל אחד הפנים 60 בארות של התחתית הריקה U, V-בתחתית או התחתית העגולה 96-באר עם שמונה ערוצים multi-היטב פיפטורים. בטל את החותם של צלחת המתחם הראשי ולהשתמש בצינורות העליון הספסל או מכשיר שווה ערך לפיילט 1 μL של תרכובת מלוחית הבסיס לתוך 49 μL של המועצה לבטחון לאומי בכל אחד הפנים 60 בארות.
    4. מערבבים את מתחם 3x מדולל עם הספסל העליון מושב צינורות.
    5. הסר את 3 96-צלחות הבאר של NSCs מן החממה, פיפטה 15 μL של כל מתחם מדולל עם פיאור הספסל העליון ולוותר 5 μL ליטר של תרכובת לתוך כל אחד משלושת הצלחות.
      הערה: זה 1:20 דילול של תרכובת לתוך התאים בשילוב עם הראשונית 1:50 דילול בשלב 2.1.3 תשואות 1:1000 לדילול כזה את הריכוז הסופי של תרכובות על NSCs יהיה 10 μM עם ריכוז DMSO של 0.1% ואת הסופי ריכוז עבור שולטת DMSO יהיה 0.1%.
    6. התאים דגירה עם תרכובת עבור 72 h ולהמשיך עם הרעלת ציטוזה. מרווחי זמן קצרים יותר ניתן להשתמש אבל תקופת הדגירה של 72 שעות צריך למקסם את ההשפעות הפוטנציאליות ציטוטוקסיים של תרכובות נבדק.
  2. שיטת התגובה של המינון
    הערה: ההגדרה עבור 96-השימוש הטוב במינון-תגובה מוצגת באיור 2.
    1. השתמש בעמודה 2 עבור שישה משכפל בקרת DMSO ולבדוק טריליטים של עד שלושה תרכובות שונות בשתי מנות טוריות מתקפלות בשישה מינונים החל במינון גבוה של 10 μM.
    2. לדלל 4 μL של DMSO או מתחם בדיקה ב DMSO לתוך 196 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 25 μL של DMSO לעמודה של בארות מ-B2-G2 ו-50 μL של תרכובות הבדיקה לשורה מ B3-B11 עם שלושת התרכובות נבדק 10 מ"מ מטריפליטים בשורות B3-B5, B6-B8, ו B9-B11.
    3. פיפטה 25 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי לעמודות הריקות שנותרו בחלק הפנימי של צלחת 96-ובכן. הסרת 25 μL של תרכובת מבארות B3-B11 עם פיפטורים רב-ערוצית, להוסיף בארות C3-C11, ולערבב לפחות חמש פעמים. חזור על התהליך עבור השורות הנותרות כדי ליצור מטריליטים בשתי מנות מתקפלות עבור סכום כולל של שישה מינונים עבור כל אחד מהתרכובות.
    4. צור NSCs עבור תגובת המינון בדיוק כפי שמתואר עבור המסך הראשי בסעיף 2.1. תרכובות עבור תגובת המינון מתווספים ו מודבטים על התאים בדיוק כפי שמתואר בשלבים 2.1.5 ו 2.1.6.
      הערה: שלושה משכפל ביולוגי של שיטת המענה המינון מתבצעים על-ידי חזרה על הNSCs במעברים שונים בימים נפרדים.

3. הדמיה של תאים בקורא לוחית

  1. לאחר התאים כבר מודבטים עם תרכובות עבור הזמן המוקצב, התמונה בתאי על הקורא צלחת לקבוע את מספר התא טרום הטיפול לכל טוב.
    הערה: הוראות לתאי דימות הן ספציפיות לקורא, אך בדרך כלל מעקב אחר אסטרטגיה דומה. ההנחיות שלהלן חלות על הקורא המשמש בהפגנה זו (טבלת חומרים).
  2. להסיר את הצלחת מן החממה ולמקם אותו בתוך קורא לוחית. פתח את תוכנת צמידה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים עבור המחקר. עבור למצב ידני Imager על מנהל המשימות ולחץ על לכידת כעת....
  3. בחר 96-צלחת הבאר כסוג כלי, בחר 10x עבור ההגדלה, ו חלבון פלורסנט אדום (RFP) 531 ו 593 עבור הדמיה tdTomato. בחר באר, ולאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, ו לחשוף אוטומטית לזמן חשיפה נאותה. התאם ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.
  4. לאחר ההתמקדות הנכונה וחשיפה הושגו, לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על תהליך/לאנלאזי מעל התמונה כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול ובחר בכרטיסיה ניתוח.
  5. לחץ על ניתוח סלולארי בשלב הוספת ניתוח לימין התמונה ולחץ על START (התחל). התמונה תציג תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. ניתן ללחוץ על בחירת האפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור בתאים טובים יותר בהתבסס על סף הזריחה או על גודל התא. אם הצמידה סופר כראוי את התאים, ולאחר מכן לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך.
  6. לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות, אשר יפתח חלון עם הניסוי. לאחר פתיחה, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול ובחלון החדש שנפתח בחר קרא, ואז בחלון החדש לחץ על הצלחת המלאה כדי לבחור רק את 60 בארות המכילות את התאים (B2... G11). לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים ולאחר מכן לחץ על אישור בחלון השגרה.
  7. הצלחת יכול כעת להיות בתמונה על ידי פרוטוקול זה ואת הקובץ ניסיוני ניתן לשמור. לחץ על סמל המחזה כדי להפעיל את הצלחת. לאחר שלוחית הרישוי הראשונה הייתה מהתמונה, התמונה של שני הצלחות האחרות. עם סיום ההדמיה, הורד את הנתונים של ספירת התאים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. לקחת את כל התמונות בהגדלה 10x.

4. שיטת הרעילות מטרמינל MTT

הערה: הפעל את שיטת MTT בתוך שעתיים של השלמת הדמיה tdTomato.

  1. לעשות 5 מניות mg/mL MTT פתרון על ידי שקילה החוצה 25 מ"ג של MTT ולהשעות אותו ב 5 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי. וורטקס הפתרון עד שלא יהיו מאיצים גלויים של MTT, אשר יכול להימשך מספר דקות.
  2. הסר את לוחיות התרבות של התאים מהאינקובטור ושרטט את מדיום תרבות התא. לדלל MTT 1:10 בינונית תרבות התא ולהוסיף 100 μL של MTT כל טוב של תאים.
  3. התאים הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 2 h. מזרז ארגמני צריך להיות גלוי בערך בפרופורציה למספר התאים בבאר. או מוריד את פתרון MTT את הצלחות או להפוך את הצלחת במהירות כדי לחבוט פתרון מתוך הצלחת.
  4. הוסף 50 μL של 100% DMSO לכל היטב ולנענע צלחות בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות ב 400 rpm. קראו את ספיגת הבאר ב595 nm בקורא צלחות והיצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.

5. ניתוח נתונים

  1. בצע ניתוח של ספירות תאים של tdTomato וספיגת התוכנה עם התוכנות המתאימות (גיליון אלקטרוני מסחרי, R). חישוב ממוצעים לספיגה או ספירת תאים של שלושה משכפל DMSO על כל צלחת לצורך נורמליזציה, לאחר מכן לחלק את הערך עבור ספירת תאים או ספיגה של כל הבאר על הצלחת על ידי ממוצע זה ולהמיר לאחוזים. הדבר מניב את ספירת התאים המנורמלת או הספיגה ביחס ל-DMSO עבור כל צלחת.
  2. חשב את הספירה המנורמלת או הספיגה וסטיית התקן עבור שכפול בארות על שלושת הלוחות.
    הערה: בשלב זה אמורות להיות ארבע סדרות שונות של ערכים מנורמל: אחד עבור כל אחד מהלוחות וממוצע אחד עבור שלושת לוחיות השכפול.
  3. להיות שמרני ולהשתמש בערך מנורמל בתוך או מתחת 25% עבור הממוצע על פני שלושה לוחות לשכפל לסווג תרכובת כמו רעילים. גם, כי רק טיפול יחיד לכל מתחם מבוצע על כל צלחת, רק התווית תרכובות ליפול מתחת לסף זה על כל שלושת לוחיות לשכפל כמו רעיל. לבחון תמונות פלורסנט של כל התרכובות כי ניתוח זה מסננים רעילים כדי לאשר חזותית רעילות.
    הערה: הזיהוי של תרכובות עם אפקט של המשך צמיחה או שיפור הצמיחה קשה יותר להעריך את הערך הניסויי של סוג זה עקב חוסר שכפול על כל צלחת. עם זאת, להלן דרך מהירה לזהות תרכובות שעשויות להאט או לשפר את הצמיחה התאית.
  4. חשב את סטיית התקן עבור שלושת שכפול הפקדים DMSO על כל צלחת ולאחר מכן לסנן עבור כל התרכובות בעלי ערכים ממוצעים לפחות שתי סטיות סטנדרטיות מעל או מתחת לפקד DMSO. תרכובות שנופלות ממסנן זה על כל אחד משלושת הלוחות רשאים לבצע חקירה נוספת.
  5. השתמש באותה אסטרטגיית ניתוח למענה המינון כמסך הרעילות העיקרי. חשב את הממוצעים עבור בקרת DMSO עבור כל שכפול ביולוגי והשתמש בערכים אלה כדי לנרמל את אחוז התאים החיים או אחוזי הספיגה של אחוזים עבור כל שילוב של תרכובת/מינון. חשב את האמצעים ואת השגיאה הסטנדרטית של האמצעים עבור כל שילובי התרכובת/מינון עבור שלושת המשכפלת הביולוגית.
  6. הפוך את הריכוז לערך יומן הרישום שלו, צור עקומת מינון עבור יומן הריכוז לעומת יכולת הקיום המנורמלת, והתאם את העקומה באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארי (ניתן לבצע ניתוח ב-R או במספר סטטיסטי מסחרי חבילות). לחשב את המינון הקטלני 50 (או מבחינה טכנית במקרה זה מינון קיימא 50) או ריכוז של תרכובת שתוצאתה 50% רעילות מהמשוואה של עקום זה. חבילות תוכנה רבות יחושבו באופן אוטומטי איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתונים האוטומטיים ספירת תאים זיהה אחד-עשר תרכובות עם פחות מ -25% כדאיות כאשר מנורמל לפקד DMSO בעוד נתוני MTT זיהה אותם תרכובות ועוד שני אחרים (טבלה 1 ושולחן 2, מוצל אדום). שני תרכובות נמצאו רעילים רק בתוך שיטת MTT (בארות F3 ו G10) היו 31% ו 39%, בהתאמה, מספר תאים tdTomato-חיוביים כפקד ועל ידי סדר הדירוג היו שני תרכובות רעילות ביותר הבאה בספריה זו לאחר אלה שנחשבו רעילים. ערכי סטיית התקן עבור שתי הבארות האלה לא הציעו שתהיה הבחנה בין שלושת הצלחות שמסטנות את הממוצע, וכאשר בודקים את המספרים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המטרה העיקרית של מאמר זה הייתה לתאר אסטרטגיה שיכולה ביעילות ובזול לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים בהקרנה נמוכה עד בינונית תפוקה. שתי טכניקות אורתוגונאליות נוצלו להערכת מספר התאים כדי להגביר את האמון במסקנות ולהציע תובנות נוספות שלא יהיו זמינות אם נעשה שימוש באחד בלבד. אחד הבחני אומר השתמשו תא פלורסנט צמידה כדי לספור ישירות tdtomato-חיוביים תאים השני היה תלוי היכולת המאופיינת היטב של המיטוסים כדי לדבוק mtt כדי formazans ובכך משמש proxy עבור תא מספר10. סך של 57 תרכובות מבחן העריכו בהפגנה זו למר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר של NINDS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001רכיב בינוני של תאי גזע עצביים.   
פיפטור BenchTopSorenson Bioscience73990מספק יכולת להחדיר ספריית תרכובות לתוך צלחת של 96 בארות במכה אחת.
BioLite 96 באר רב-תכליתיתThermo Scientific130188כל צלחת תרבית תאים 96 באר תעבוד.  אנו משתמשים בהם בעבודתנו.
מיקרוסקופ תרבית תאיםNikonEclipse TS100בדיקה ויזואלית של תאים כדי להבטיח צפיפות נאותה.
ציטציה 5 / קורא הדמיהBioTekCYT3MFVמשמש להדמיית תאים וקריאות ספיגה.
DMSOFisher Scientific610420010ממס לתרכובות המשמשות במסך. ממיס משקעי MTT כדי להקל על מדידות הספיגה.
FGF-basicPeprotech100-18Bרכיב בינוני של תאי גזע עצביים.   
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202מטריצת ממברנת בסיס של תאי גזע עצביים.  מאפשר לתאים להיצמד ללוחות תרבית תאים.
BioTekGen5 3.04לקביעת ספירת תאים עבור תאים המבטאים tdTomato.
גלוטמיןThermoFisher Scientific25030081רכיב בינוני של תאי גזע עצביים.   
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077אחסון ספריות מורכבות.
MTTThermoFisher ScientificM6494מגיב בדיקה פעיל לקביעת כדאיות תאית.
פיפטה רב-ערוציתRaininE8-1200תוספת עמודה אחר עמודה של מדיום תרבית תאים, MTT או DMSO.
מדיום נוירובזאליThermoFisher Scientific21103049מדיום בסיס תאי גזע עצביים.
קוביית מסנן RFPBioTek1225103מסנן ב-Cytation 5 המשמש להדמיית תאים מבטאים tdTomato.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036מגיב דיסוציאציה של תאים.
תוכנת ניתוח

מקורות

  1. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
  2. Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
  3. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  4. Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
  5. Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
  6. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  7. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
  8. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  9. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  12. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  13. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  14. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  15. Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).
  16. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  17. Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
  18. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).
  19. Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
  20. Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
  21. Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
  22. Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MTTtdTomatoDMSO

מאמרים קשורים