תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

Summary

אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.

Abstract

הקונקטיאליות הסלולרית חיונית בהיבטים מגוונים של ביולוגיה, תהליכי נהיגה הנעים מתנועתיות וחילוק, להתכווצות רקמות ויציבות מכנית, ומייצגת יסוד מרכזי בחיי החיות הסלולאריות. בתאים חסיד, acto-רירן התכווצות נתפסת כוחות המתיחה כי תאים להפעיל על מצע שלהם. דיסרגולציה של כמובן הסלולר מופיעה במגוון של פתוגיות, ובכך מהווה יעד מבטיח בגישות אבחון מגוונות המשתמשות בביופיזיקה כמדד. יתר על כן, אסטרטגיות טיפוליות הרומן יכול להיות מבוסס על תיקון התקלה לכאורה של הקונקטיציות לתא. יישומים אלה, עם זאת, דורשים כימות ישירה של כוחות אלה.

פיתחנו סיליקון אלסטורר מבוססי כוח המתיחה מיקרוסקופ (TFM) בפורמט רב מקביל מרובה היטב. השימוש שלנו בגומי סיליקון, במיוחד polydiמתיל siloxane (PDMS), במקום נפוץ הידרוג'ל polyאקרילאמיד (צפות) מאפשר לנו לעשות מצעים חזקים ומלא מוגבל עם חיי מדף מוגדר לא דורש תנאי אחסון מיוחדים. בניגוד לגישות המבוססות על עמוד-PDMS שיש להן מודולוס בטווח הממוצע, ה-PDMS המשמש כאן הוא תואם מאוד, החל מ-0.4 kPa עד 100 kPa. אנו יוצרים פלטפורמת תפוקה גבוהה עבור tfm על ידי חלוקה אלה מונוליטי מונוליטיים גדולים מרחב לתוך בארות עצמאיות ביולוגי, יצירת פלטפורמה מרובת היטב עבור הקרנה כוח המתיחה כי הוא תואם עם מערכות מרובות היטב קיים.

בכתב יד זה, אנו משתמשים זה מערכת כוח המתיחה רב היטב כדי לבחון את האפיתל כדי Mesenchymal מעבר (חובש); אנו לגרום לפרמדיק בתאי NMuMG על ידי חשיפת אותם TGF-β, ו לכמת את השינויים ביופיזיים במהלך החובשים. אנו מודדים את הקונקטיציה כפונקציה של ריכוז ומשך החשיפה של TGF-β. הממצאים שלנו כאן להפגין את התועלת של TFM מקבילים בהקשר של ביופיזיקה מחלה.

Introduction

Acto-רירן הקונקטיטיות היא מרכיב חיוני של מכניקת התא הפעיל, להשפיע על התנהגויות תא מתוך תנועתיות והתפשטות לבידול תא גזע. ברקמות, כונני כוננים מפני הפרדת הקוטב בembryogenesis, לכיוון הפרדה בדרכי הנשימה ולפעילות לב. באופן ביקורתי, כדי ליצור מתח, התאים חייבים תחילה לדבוק הסביבה החילוץ שלהם. בפעולה זו, הדבר יוצר כוחות המתיחה על סביבתם. כוח המתיחה מיקרוסקופית (TFM) התפתחה בהמון צורות כדרך לכמת את הכוחות הללו מתאים מגוונים בתנאים שונים.

תחום ה-TFM ראה רוחב יוצא דופן של חדשנות ויישום, והתוצאות סללו את הדרך לפרספקטיבות חדשות בביולוגיה, המשלבות מכניקה וכוחות פיזיים. החל עם קמטים מצעים סיליקון¹, החוקרים החילו טכניקות שונות כדי למדוד כוחות המתיחה תא. גישות אלה השתפרו ברציפות והגיעו כעת לרמה של רזולוציה על סדר של כמה מיקרון². עם זאת, בעיה עיקרית אחת התפתחה, וזה הקושי ביצירת מצעים של נמוך כראוי מודוללי באמצעות סיליקונים זמין. כדי לעקוף בעיה זו, פוליאקרילאמיד אומץ כתחליף בשל קלות יצירת מצעים על סדר 1-20 kPa³. לאחרונה הטמיעה סיליקונים תואמי מאוד ב-TFM⁴, מה שמאפשר לנו להמציא את אותו מגוון של מודלי כמו פוליאקרילאמיד, אבל עם היתרונות של הסיליקון האינרטי והחזק.

גישות TFM אפשרו לתגליות מכנייות יקרות ערך, עם זאת, קיצור מתמשך הוא המורכבות שלהם, לעתים קרובות הגבלת השימוש שלהם לחוקרים בתחומי ההנדסה או המדעים הפיזיים. הדבר נובע בחלקו הגדול לחישובים הכיול והמאתגרים המפורטים הנדרשים לכמת. אתגר משמעותי נוסף הוא כי שיטות TFM הן במידה רבה תפוקה נמוכה ולכן מתאים ללמוד מצבים שונים או אוכלוסיות רבות בו⁵. זה הציג צוואר בקבוק, אשר העביר העברה של TFM מתוך הגדרת ביופיזיקה מומחה ליישומים ביולוגיים ותרופתי רחב יותר.

פיתחנו לאחרונה לוחית מרובת בפורמט TFM, אשר מאפשר לחוקרים למקביל מדידות TFM שלהם עבור כימות מהיר יותר של מדדי הקונקטיזציה, תוך חקירת ההשפעה של תרכובות שונות גם באמצעות פחות ריאגנטים⁴ . מתודולוגיה זו כוללת כלי שירות רחב במחקרים שונים של המכונה, מהערכת ההשפעות של תרכובות בפעילות הסלולר, כדי לכמת את השינויים הקונקטילה בידול או מחלה.

תחום אחד של מחקר ביו שיועיל מאוד מ TFM הוא המחקר של איך רמזים פיזיים השפעה על פנוטיפים ממאירים של תאים סרטניים. גרורה, אחראי 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן, מאופיין על ידי תאים סרטניים עוזב את אתר הגידול המקורי שלהם מטביל אתר משני. עבור תאים לעבור דרך הרקמה ולעבור פנימה והחוצה של מערכת כלי הדם, הם חייבים באופן קיצוני לשנות את הצורות שלהם כדי לסחוט את המחסומים הפיזיים האלה תוך יצירת כוחות משמעותיים כדי למשוך את דרכם לאורך מטריקס מסחטות או לנוע בין השני תאים. כוחות אלה מועברים למצע דרך אינטראקציות הדבקה מוקד^2,3, וניתן לכמת באמצעות tfm. בעוד סרטן הם ביוכימית מגוונת במיוחד, עם רפרטואר המתרחב של מוטציות ידועות שינויי חלבון, כמה שינויים פיזיים נפוצים נצפו; במגוון של סרטן, כולל שד, ערמונית, סרטן הריאות, תאים גרורתי הוכחו להפעיל 2-3 פעמים כוחות המתיחה של תאים לא גרורתי^6,7,8. תוצאות אלה מרמזות כי ייתכן שיש קורלציה חזקה בין התקדמות גרורתית וכוחות המתיחה המופעל על ידי תאים; עם זאת, קשה לבחון את השינויים תלויי הזמן המפורטים במהלך הבחינה.

המעבר האפיתל-ל-mesenchymal (חובש) הוא תהליך לפיו התאים להפחית חסיד והדוק הצומת מתווך התא תא הדבקה, להיות נדידה יותר פולשנית. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות הכוללות ריפוי בפצע ותהליכים התפתחותיים, הצוות החובש הוא גם תהליך מנוצל במהלך גרורות, מה שהופך אותו מערכת מודל שימושי כדי ללמוד את התהליך הזה. באמצעות TGF-β, אנחנו יכולים לגרום לחובש בתאי האפיתל של הפטמות של מורי (NMuMG)⁹ כדי לכמת ישירות את השינויים הפיזיים במהלך שינוי זה, ולאפיין את הזמן ואת ההשפעות התלויות במינון של tgf-β על החובשים וכלי הסלולר. במאמר זה, אנו מדגימים את כלי השירות של גישה זו על-ידי מדידת השינויים בתהליך הפעולה המושרה.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא ידריך את החוקרים בבדיית ושימוש בצלחת TFM multi-היטב המוצגת באיור 1.

1. הכנת מצעים סיליקון מסדרת PDMS

1. הכנת תערובת גומי של הסיליקון PDMS מבוסס על תערובת מורכבת של שני ערכות זמינות מסחרית.
   1. הוסף חלק A וחלק B של ערכת PDMS (g., ג'ל-8100, ראה את הטבלה של חומרים) ביחס משקל 1:1 לתוך שפופרת ה50 mL.
      הערה: התערובת מעורבת על מסובבי במהירות איטית מספיק כדי שהתערובת תזרום הלוך ושוב במהלך המהפכה כדי להבטיח ערבוב מלא.
   2. להוסיף את הכמות הנדרשת של ריפוי סוכן עבור מודולוס הרצוי של המצע.
      הערה: כמות סוכן הריפוי שיש להוסיף לתערובת תלויה במודולוס הרצוי של המצע והוא עשוי לרוב לנוע בין 0.1% ל 1.8%. עיין בטבלה 1 ובאיור 3 עבור מדריך לריכוזי מקשר מסוימים וכתוצאה מכך מודלי.
   3. לערבב את הניסוח על הסובב עבור 30-45 דקות; להבטיח את הסיבוב הוא איטי מספיק כדי ערבוב יסודי.
2. השכבה התחתונה: ציפוי מצעים PDMS על שקופית זכוכית
   1. הציבו את הצ שנבנה בהתאמה אישית באיור 2 על הספין-קואטר. נקו את הזכוכית בעזרת אתנול או איזופנול, והתייבשו במחיקה ללא מוך. מניחים את שקופית הזכוכית של צ'אק ולהדליק את הוואקום כדי להחזיק את השקופית במקומה.
   2. החלת PDMS לא נרפא כ 1 ס מ מן הקצוות ולעבוד לקראת המרכז. החל מספיק (3-4 mL) PDMS כדי להבטיח את פני השטח כולו יהיה מכוסה.
      הערה: כדי לוודא ש-PDMS מתפשט באופן שווה על פני הזכוכית, מומלץ לפזר את התערובת של PDMS מהמרכז ועד לקצוות.
   3. סובב את הזכוכית עם התערובת PDMS על מסתובב ספין עם הפרוטוקול הבא.
      1. כדי להפיץ את PDMS לא נרפא בשקופית, להאיץ ב 50 rpm/s מ 0 כדי 200 rpm; להחזיק ב 200 rpm עבור 1 דקות.
      2. כדי להשיג 100 יקרומטר עבה pdms שכבה, להאיץ ב 50 rpm/s כדי 300 rpm ולהחזיק עבור 1 דקות ב 300 rpm. בעוביים שונים הרצויים מלבד 100 יקרומטר ידרשו ערכי מהירות ספציפיים.
      3. כדי להסיר, להאט את 50 rpm/s כדי 0 סל ד. בטל ואקום ולהסיר את השקופית מצופה, מטפל לא לגעת משטח מצופה.
         הערה: חשוב לכלול את ההאצה ואת צעדי ההאטה כדי להבטיח משטח רציף חלק.
         התראה: כדי לוודא שהדוגמה אינה מטיסה את ה-צ'אק, יש להשתמש במחזיק המותאם אישית כדי להחזיק את השקופית, ולא להסתמך פשוט על הוואקום ועל הצ השטוח הקיים. הפרטים והמפרטים של בעל זה ניתנים באיור 2.
   4. מניחים את המדגם מצופה הספין בתנור בטמפרטורה מומלצת ליצרן (100 ° c) עבור 2 h.
      הערה: המשטח של התנור שבו המדגם ממוקם צריך להיות מוצק (כלומר, לא מתלה תיל) ומשטח רמה כדי להבטיח חימום אחיד ועובי של המדגם. לוחית קרמיקה או פלדה מייצרת משטח אידיאלי.
3. שכבת חרוזים למעלה
   1. הוסף פתרון חרוז ביחס המתאים לתערובת PDMS הנותרת.
      הערה: יחס זה תלוי בריכוז של הפתרון חרוז מניות ואת צפיפות חרוז הרצוי על המדגם. ערכים סופיים טיפוסיים הם 9.2 x 10 חרוזים/mL ו 0.05-0.2 חרוזים/μm², ו עודף של חרוזים הוא בדרך כלל עדיף על סכום מספיק.
   2. לערבב את הפתרון חרוז עם PDMS שלא נרפא. זה עשוי להתבצע על ידי הצבת צינור על מסובבי במשך כ 30 דקות, vortexing עבור 1-2 דקות, או sonication עבור 30 דקות. שיטות אלה עשויות להיות משולבות.
      הערה: ביישום שלנו, אנו מוצאים כי sonication יעיל בשבירת אגרגטים חרוז, וסיבוב יעיל ערבוב. חרוזים מסונתז יכולות לצבור באחסון. לפני השימוש, הם עשויים להיות מושעה מחדש הקסאן ו sonicated. אם יש אגרגטים גדולים משמעותיים, אחד יכול לסנן את השעיית חרוז דרך מסנן מזרק 5 יקרומטר. שלב סינון זה הוא אופציונלי; זה עוזר לחלוק את המדגם עם חרוזים מונוטוני, אבל חלק משמעותי של חרוזים עלול לאבד את הפילטר.
   3. מניחים את השקופית מהתנור, מאפשרים לצנן את טמפרטורת החדר ולהניח אותה על הספין-מאטר.
   4. הוסף 3-4 mL של התערובת ובלתי נרפא PDMS על פני השטח של המדגם מצופה.
      הערה: התערובת עם חרוזים הוסיף היא צמיג פחות בשל ההקאן. ודא שלא לגעת במשטח של המצע כפי שהוא עלול לגרום נזק המצע מצופה PDMS. בנוסף, תערובת חרוז עשוי בתחילה לא להרטיב את פני השטח; לדאוג כי התערובת לא לזרום מיד את המשטח PDMS נרפא.
   5. סובב את הדגימה. עם הפרוטוקול הבא
      1. כדי להפיץ את התערובת וללא נרפא PDMS, להאיץ ב 100 rpm/s מ 0 כדי 500 rpm; להחזיק ב 500 rpm עבור 1 דקות.
      2. כדי להשיג שכבה דקה של חרוז מוטבע PDMS (~ 1 μm), להאיץ ב 200 rpm/s מ 500 כדי 5000 rpm; להחזיק ב 5000 rpm עבור 10 s.
      3. כדי להסיר, להאט את 100 rpm/s כדי 0 סל ד. להשבית ואקום ולהסיר שקופית מצופה, מטפל לא לגעת משטח מצופה.
   6. מניחים את המדגם מצופה הספין בתנור ב 100 ° c עבור 1 h.
      הערה: טמפרטורות מעל 100 ° צ' או משכים יותר מ 1 h יכולים להפחית את הזריחה חרוז. ודאו שטמפרטורת התנור מוגדרת ל-100 ° c ואינה גבוהה יותר.
   7. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. כדי לאחסן את המדגם, לכסות את פני השטח כדי למנוע חשיפה לאבק ואור. ודא ששום דבר לא נוגע בפני השטח. המדגם הוא יציב מדף בטמפרטורת החדר לנצח.
4. הרכבת צלחת
   1. הוסף חלק א (בסיס) וחלק ב' (סוכן מרפא, לדוגמה, Sylgard) של ערכת אלסטומר PDMS ביחס משקל 10:1 לתוך צינור השפופרת 50 mL.
   2. מערבבים את התערובת על הסובב עבור 30-45 דקות.
      הערה: עבור צלחת אחת, לערבב 5 מ ל בסיס עם 0.5 mL של ריפוי סוכן. עד 1 מ ל של הקסאן ניתן להוסיף כדי להקטין את צמיגות של התערובת.
   3. החילו את התערובת על תחתית המחיצה והפיצו את התערובת.
      הערה: יש להציב את המפריד הפוך.
   4. הנח את המצע על המפריד הפוך.
   5. מניחים את המדגם הפוך בתנור ב 65 ° c עבור 2 h.
   6. קחו דגימות מהתנור ונקו את החלק התחתון של הזכוכית עם 70% אתנול או איזופנול כדי להסיר שאריות PDMS.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדי לאחסן את המדגם, המקום מכסה על מצע ולעטוף את המכשיר רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. המדגם הוא יציב מדף בטמפרטורת החדר לנצח. המפריד שנוצל בשיטה זו הוא בפורמט 96-והיטב; עם זאת, החוקרים עשויים להעסיק פורמטים אחרים (384-ובכן, 2-ובכן, 4-טוב, 8-ובכן, וכו ') בהתאם הגדרות הניסוי הרצוי וזמינות של חלוקת מבנים. ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף.

2. פונקציונליזציה של פני השטח

1. התמוססות 80 μL של Sulfo-SANPAH תוך 40 מ ל של 0.1 M HEPES מאגר (pH 7-9).
   הערה: הכינו את Sulfo-sanpah אמצעות המסת 100 mg של אבקת Sulfo-SANPAH 2 מ ל של דימתיל סטרילי סולפוקסיד (DMSO). הכינו 0.1 M hepes מאגר על ידי דילול 50 mL של hepes ב 450 מ ל של מים מעוקרים סטרילי ולסנן דרך מסנן הנקבוביות ה0.22 יקרומטר.
2. הוסף 200 μL של פתרון Sulfo-SANPAH מדולל כל טוב של הצלחת 96-באר.
3. לחשוף את הצלחת כדי UV (300-460nm) אור במרחק המתאים ומשך.
   הערה: לאחר חשיפה UV, הצבע של הפתרון צריך להיות כהה יותר. מרחק חשיפה UV ומשך תלוי בכוח המנורה UV. באפליקציה שלנו, אנו חושפים עבור 10-15 דקות במרחק של 5 ס"מ.
4. הסר את הפתרון Sulfo-SANPAH מבארות ולהוסיף 200 μL של 5 μg/mL fibronectin פתרון לכל טוב.
   הערה: לציפוי פני השטח ניתן להשתמש בחלבון שצוין לחוקר. כמה חלבונים בשימוש נפוץ הם קולגן, fibronectin, ו למינציה. יש לנו מצאנו Sulfo-SANPAH להיות השיטה היעילה ביותר, וניקוי פלזמה בעוד לפעמים העסקת PDMS הוא מיואש כפי שהוא יוצר שכבת סיליקון דו חמצני בעליל נזקים המשטח.
5. מודקת את הצלחת ב 4 ° c בלילה.
   הערה: ניתן להחיל שיטות דגירה שונות בהתאם לחלבון המשמש לציפוי.
6. הסר את הפתרון fibronectin ולשטוף כל טוב עם מלוחים מואגור פוספט (PBS) פעמיים.
7. . שים מכסה על הדגימה
8. הוסף 200 μL של PBS לכל טוב.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את הדגימות מציפוי fibronectin ב-4 ° צ' עד 2 שבועות.

3. העיקור של קרינת UV

1. לחטא את המדגם תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגי עבור 30 דקות.
   הערה: עוד פעמים חשיפה UV עשוי להשפיע לרעה על הזריחה חרוז. יש לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים סטריליים.

4. תרבית תאים

1. להסיר PBS מכל באר ולהוסיף 200 μL של תאים הושעו במדיית התרבות לכל טוב.
   1. לוחית את התאים בצפיפות התא הרצויה. צפיפות התא תלויה בניסוי הרצוי. עבור לימודי תא בודד, על התאים להיות מינימלי של 50 יקרומטר בנפרד ותאים הקרובים לקצות חלון ההדמיה לא ייכללו במדידה tfm. עבור תאים מונאולייר, חלון ההדמיה צריך להיות שדה הצפייה מכוסה בשכבה שוטפת של תאים.
   2. הכינו את מדיית תרבות הצמיחה המלאה עבור תאים NMuMG על ידי השלמת DMEM עם 5% FBS, 10 מ"מ HEPES, 10 μg/mL אינסולין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"מ L-גלוטמין, ו 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B.
   3. הכנת מלאי אינסולין על ידי מחדש במים acidified (2.5 mL של חומצה אצטית קרחוני ב 130 מ ל של מים מומלים) לריכוז של 10 מ"ג/mL. אחסן את פתרון המניה ב-4 ° c. המתן עד שהפתרון יהיה ברור ולאחר מכן סנן דרך מסנן נקבובית של 0.22 יקרומטר.
2. TGF-β הוספה
   1. כדי להכין את מלאי tgf-β, התמוססות 2 μg של tgf-β ב-100 μl של חומצה לימון של 10 מ"מ (pH 3.0) ומסנן לעקר עם הנקבוביות 0.22 יקרומטר. מערבולת הצינור ו-סדרת מחלקים לתוך הכרכים הרצויים. אחסן את הליאביטים ב-80 ° c.
   2. הוסף 1.5 μL של TGF-β פתרון מניות ל 10 מ ל של מדיה התרבות התא השלם להוות את התקשורת התרבות התא עם הריכוז TGF-β האחרון של 3 ng/mL.
      הערה: כדי להפוך 10 מ"מ pH 3.0 לימון חומצה, לדלל את החומצה במים ולהתאים את ה-pH כדי 3.0 על ידי הוספת HCl.

5. רכישת נתונים

1. עבור כל תנוחה, לרכוש תמונה אחת לפחות של חלקיקים ותאים הנאמנות. התמקד בשכבת חרוז.
   הערה: גודל הפיקסל צריך להיות ממוטב בהתבסס על גודל חלקיקי הנאמנות ושיטת עיבוד התמונה בשימוש. ביישום זה, המחברים להשתמש במטרה 10x 0.4 NA, ותמונות נרכשים עם 1024 x 1024 רזולוציה, עם 455 nm/פיקסל. באופן כללי, זה מועיל לשמור על רזולוציה של לפחות כ 1-5 פיקסלים לכל חרוז; כאן, חרוזים הם פוליהתפזר ויש להם גודל בודד של 300-500 ננומטר. חשוב לעשות שימוש בחרוזים של מרכז הפלורסצנט במיקוד של תמונות שישמשו לחישובי TFM. המיקוד ואיכות ההדמיה של החרוזים צריכים להיות בעדיפות גבוהה יותר על הדמיה של התאים עצמם. לא צריך להיות שיחה צולבת בין ערוצים שונים, במיוחד כל זריחה לא מחרוזים הנאמנות אשר מופיע ספקטרום ההדמיה של החרוזים.
2. ברגע שכל המיקומים המעניינים נרשמו, הוסף פתרון התנתקות לכל באר כדי לרכוש תמונות התייחסות ללא כוח של חלקיקי הנאמנות.
   1. כדי להכין את פתרון התנתקות התא, לערבב פתרון מימית המכיל 2% TritonX-100, 50 mM הנתרן azide, ו 500 מילימטר אשלגן הידרוקסיד.
      הערה: התמונה לעיל מסופקת כדוגמה לפתרון התנתקות אפקטיבי. פתרונות ניתוק שונים בשיקול הדעת של החוקרים עשויים לשמש לניתוק התאים ממשטח המצע.

6. ניתוח תמונה

1. בצע ניתוח תמונה מתאים כרצונך.
   הערה: תוכנת ניתוח פותחה בתוך הבית. ניתן לבצע ניתוח תמונה בתוכנות או בתוכנות מותאמות אישית הזמינות באינטרנט.

7. חרוז לסינתזה

הערה: הפרוטוקול הבא מבוסס על שיטת הסינתזה המתוארת על ידי קליין ואח '¹⁰.

1. מתחת למכסה המנוע, הכינו את הבקבוקון התלת-צווארי עם הקבל ריפלוקס מקורר מים.
   התראה: הגדרת סינתזה במיזוג כימי מאוורר היטב.
2. הוסף 0.5 mL של מייצב PDMS ו fluorophore אל הבקבוקון.
3. לצייד צוואר אחד עם מחיצת גומי עם מחט מפרץ חנקן ומחט לשקע ולצייד את הצוואר השני עם מחיצת גומי להוסיף הכימית עם מזרק.
4. הוסף 100 mL של הקסאן בשנת 250 mL לבקבוקון ולהוסיף בר מגנטי קטן.
5. מניחים את הבקבוקון באמבט השמן המינרלים ב-75 ° c ומטהר אותו בעזרת גז חנקן במשך 1 שעות.
6. הוסף 6 מ ל של מתיל מתילאקריל 25 מ"ל בקבוקון התחתון עגול.
7. להוסיף 0.100 g של 2, 2 '-אזוביוביוזוטריל (AIBN) לתוך הבקבוקון התחתון עגול ולטהר את התערובת עם גז חנקן עבור 1 h.
   הערה: הסרת מעכבי לפני השימוש בטור מראש. הוסף תערובת של מתילאמאטיאקריל. ובקבוק שלוש הצוואר
8. הפתרון בתחילה הופך מעונן והופך חלבי. תן את התגובה לרוץ 3 h לאחר הפתרון הופך מעונן.
9. לאחר 3 שעות, מניחים את הבקבוקון באמבט מים בקרח.
10. ואקום-לסנן את הפתרון עם נייר סינון גס.
11. צנטריפוגה את הפילטרט ולהשעות מחדש את החלקיקים הקסאן.
    הערה: נפח ההקאן שיש להוסיף תלוי בריכוז הרצוי של פתרון החרוז. Sonication מקלה פיזור מחדש של חלקיקי חרוז בתמיסה הקסאן. חרוזים המיוצרים על ידי המחברים יש לפזר קטרים של כ 300-500nm. בשל השימוש במעקב אחר מיתאם דפוס כדי לקבוע displacements, חרוזים חד מונוסון אינם נדרשים.

8. מדידה לפרוטוקול ראולוגיה

הערה: Rheology אינו נדרש עבור כל חוקר או ניסוי, אבל הוא הכרחי כדי לכמת את המודוללי עבור ניסוחים חדשים של PDMS. בפרוטוקול זה, אנו מעסיקים מדידת הטיה כדי למדוד את ההשפעות של מקשר, תדר, ולהתאמץ על מודלי של דגימות PDMS. בהתאם לכלים ולמומחיות הזמינים, ניתן למדוד את מודולים גם באמצעות גישות רבות אחרות של ניתוח מכני. בנוסף, החוקרים באמצעות פרוטוקול זה עשויים לבחור להשתמש שלנו שפורסמו מודלי הציג בטבלה 1, איור 3 ואיור 4.

1. השתמש במטר עם קוטר של 25 מ"מ מקביל לצלחת מקבילית. ניתן להשתמש בגאומטריות אחרות.
2. אתחל את המערכת וכיול את מערכת ההתקן והמדידה (הלוח המקביל, d = 25 מ"מ). לאחר מדידת פער האפס, התחל לטעון את דגימת PDMS.
3. ברגע אלסטואר PDMS ו-crosslinking קישור מעורבים, ללטף את התערובת על הצלחת התחתונה של rheometer.
   1. הזז את הציר כלפי מטה כדי ליצור קשר עם החלק העליון של דגימת PDMS.
   2. לקצץ בזהירות את מדגם שנטען עודף מלוחית התחתונה.
4. בבדיקה לטאטא זן, להחיל זנים הגדלת עבור כל קומפוזיציה עם צפיפות שונה הקישור החוצה כדי להבטיח את שרידי מבנה פולימרי במשטר גמיש ליניארי אלסטי במהלך כל מדידות להטות.
   הערה: ערכי הזנים הרלוונטיים ללימודי תא הם בדרך כלל בטווח של 0.1-10%. מצאנו PDMS להיות ליניארי עד כ 100% המתח.
5. מדוד את מודול האחסון הדינאמי להטות (G), ומודולוס הפסד (G ' ′) של רשת PDMS בזמן מבחן לטאטא עם תדירות של 1 Hz ו מנדנוד הטיה של 0.5% ב 100 ° c.
6. כדי לקבוע את גמישות והתלות הזמן של הרשת PDMS הסופי, להחיל מבחן לטאטא תדר עם תדירות הנע 0.1-100 Hz ו מנדנוד להטות את המתח של 0.5%.

Results

לפני הוספת TGF-β, מונאולייר של התאים יש הריצוף כמו הצורה והוא ארוז היטב. עם TGF-β הטיפול, תאים הופכים מאורכים יותר מורפולוגיה, הגדלת שטח התא ורכישת פנוטיפ יותר mesenchymal. ניצול מכשיר multi-היטב מפוברק עם אלסטומרים רך PDMS, המאפיינים הפיזיים של תאים בסך הכל 17 תנאים שונים נחקרו. התאים טופלו עם ארבעה שונים TGF-β ריכוזי (0.5, 1, 2, ו 4 ng/mL) וארבע פעמים הדגירה שונים (12, 24, 48, 96 h), ותוצאות אלה מסוכמים באיור 5. התאים שטופלו TGF-β להחיל מדגיש המתיחה גדול יו...

Discussion

להצלחת שיטה זו, חיוני לקבל מדגם מצופה אחיד עם עובי קבוע של כ 100 μm. יש לבחור במודולולוס בקפידה כדי לבחון את המשמעות הפיזית של מערכת העניין הביולוגית. בעת בדיית שכבה עליונה, הריכוז של חלקיקי פלורסנט fiducial צריך להיות ממוטב לניתוח מדויק של הזחה וסטרס המתיחה. ניתוח תאים בודדים מבודדים דורש שכבת נאמנות צפופה יותר מאשר מדידת conolאיירס הקונאואני. בנוסף, המשטח של המצע צריך ציפוי יציב ואחיד של מולקולות הדבקה כגון קולגן, fibronectin, ו למינציה כדי להבטיח חיבור תקין של התאים למשטח המצע. יש לנקוט בטיפול מיוחד בעת חיבור המפריד ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>צלחת
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	דיאלקטרי בטוהר גבוה, ערכת ג'ל סיליקון רך
Dow Corning Sylgard 184 סיליקון Encapsulant שקוף 0.5 ק"ג ערכת	דבקי אלסוורת'	184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג	חומר ריפוי
זכוכית חתוכה בהתאמה אישית	Hausser Scientific Company		109.6 מ"מ & plusmn; x 72.8 מ"מ & plusmn; x 1 מ"מ עובי
יעד 2TM מסנן מזרק ניילון	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96 באר Stripwell ביצת ארגז רצועת	מחזיק קורנינג	2572
פוליסטירן מכסה מיקרופלייט אוניברסלי עם חריץ פינתי	קורנינג	3099
אלכוהול אתילי	גרינפילד גלובל	P016EA95	0.95
2-פרופנול	סיגמא-אולדריץ'	190764	מגיב ACS, ≥ 99.5%
<חזק>ציפוי פני השטח
Sulfo-SANPAH Crosslinker	Proteochem	c1111-100mg
פלזמת בקר פיברונקטין תמיסת	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	, מסוננת סטרילית, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים
PBS, 1X	Wisent	319-005-CL	pH 7.4, ללא סידן ומגנזיום
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
<תרבית תאים חזקה>
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4.5 גרם/ליטר גלוקוז, עם L-גלוטמין, נתרן פירובט ופנול אדום
FBS (סרום בקר עוברי)	Wisent	080-150	באיכות פרימיום,   אנדוטוקסין < 1, המוגלובין < 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M, חומצה חופשית
אינסולין אנושי רקומביננטי		Wisent 511-016-CM
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין	Wisent	450-201-EL	100 X, מסונן סטרילי לתרבית תאים
תמיסת L-גלוטמין	Wisent	609-065-EL	200mM, מסונן סטרילי לתרבית
תאיםאמפוטריצין B	Wisent	450-105-QL	250μ גרם/מ"ל, מסונן סטרילי לתרבית תאים
רקומביננטי אנושי TGF ובטא; 1	Peprotech	100-21	HEK293 חומצה אצטית נגזרת
	Sigma-Aldrich	537020	קרחון, ≥ 99.85%
חומצה ציקטרית	סיגמא-אולדריץ'	251275	מגיב ACS, ≥ 99.5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	קו תאים של בלוטת החלב של העכבר נתרן
אזיד	פישר שיאנטיפיק		AC190385000 99%, טהור במיוחד, ACROS Organics
אשלגן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ	' 221473	מגיב ACS, ≥ 85%, כדורים
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	בדרגת מעבדה
<סינתזת חרוזים חזקה>
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100 מ"ג	97%
מתיל מתאקרילט	סיגמא-אולדריץ'	M55909-500ML	מכיל ≤ 30  ppm MEHQ כמעכב, מסיר
מעכב	סיגמא-אולדריץ'	306312-1EA עמודה	ארוזה מראש להסרת הידרוקינון ומונומתיל אתר הידרוקינון
Methacryloxylpropyl סיומת פולידימתילסילוקסן	ג'לסט	DMS-R31 (25,000 גרם/מול)	מייצב פולידימתילסילוקסן, 25,000 גרם/מול, 1,000 cSt
2,2′-אזוביס (2-מתילפרופיוניטריל) (AIBN)	סיגמא-אולדריץ'	441090-25G	98%
הקסאן	סיגמא-אולדריץ'	296090-2 ליטר	נטול מים, 95%
הקסאן, תערובת איזומרים	סיגמא-אולדריץ'	227064-1L	נטול מים, ≥ 99%
ווטמן  נייר סינון איכותני, דרגה 1	סיגמא-אולדריץ'	WHA1001055	עיגולים, קוטר 55  מ"מ,
<חזק>ציוד
לורל WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP מנורת UV כף יד דגם UVGL-58	VWR	21474-622
ריאומטר	אנטון פאר	MCR 302 WESP