הפרוטוקול הרומן ליצירת תאי הדנדריטים הפיזיוגניים האימונולוגיים

Summary

התקן (TI) המכשיר או הלוח הקשורים הפרוטוקולים פותחו כדי לשכפל את התכונות העיקריות של כימותרפיה לחילוץ (ECP), בהגדרה ניסיונית, המאפשר ייצור של המופעל מבחינה פיזיולוגית, הדנדריטים הניתנים להפעלה תאים (DCs) עבור חיסוני סרטן.

Abstract

כימותרפיה לצילום (ECP) הוא חיסוני סרטן נפוץ בשימוש עבור לימפומה cell תא T (CTCL), פעיל מעל 350 מרכזים אוניברסיטאיים ברחבי העולם. בעוד שהיעילות הקלינית ופרופיל הבטיחות למופת של ECP הניעו את השימוש הנרחב בו, ההסבר של המנגנונים הבסיסיים נותר אתגר, באופן חלקי בשל חוסר מודל ECP במעבדה. כדי להתגבר על מכשול זה וליצור פלטפורמה פשוטה וידידותית למשתמש למחקר ECP, פיתחנו גרסה מצומצמת של המכשיר לעיבוד לוקיציט הקליני, המתאים לעבודה עם מודלים לעכבר ולדגימות דם קטנות של בני אדם. התקן זה מגדיר את החדר של "טרנסימוניזציה" (TI), או את הצלחת. בסדרה של ניסויים בציון דרך, המכשיר המזעור שימש כדי לייצר חיסון הסלולר שיזם באופן קבוע חסינות נגד סרטן הטיפולית בכמה מודלים הגידול בעכבר syngeneic. על-ידי הסרת גורמים בודדים מהמערכת הניסיונית וברור את תרומתם לתגובה בvivo נגד הגידול, לאחר מכן הובהר מנהלי מפתח המכונה החיסון ECP הפוטנציאל. באופן קולקטיבי, התוצאות שלנו התגלו כי ההשפעות נגד הגידול של ECP הם ביוזמת תאים דנדריטים (DC), שנוצר פיזיולוגית באמצעות אינטראקציה דם מונוציט עם טסיות בצלחת TI, טעונים עם אנטיגנים מתאי הגידול אשר התא האפוטוטיק שלו המוות הוא מאוד מושפע מחשיפה לסוכן ה-DNA המקשר בין האדם לבין מתיונין והאור המוקשה (8-סמרטוט). כאשר חזר אל העכבר, זה החיסון הסלולרי מוביל לחסינות מסוים להעברה אנטי סרטניים T. אנו מאומתים כי תא TI מתאים גם לעיבוד דם אנושי, הפקת בקרי מניות אנושיים באופן מלא במצב הפעלה ופרופיל לאלה הנגזרים מתאי ה-ECP הקליני. הפרוטוקולים המוצגים כאן מיועדים ללימודי ECP בעכבר ובאדם, הדור מבוקר של תאים סרטניים האפוטוטיים עם 8-מגב, והפקה מהירה של בקרי התחום הפיזיולוגיים של האדם והעכבר מונוציט עבור מגוון יישומים.

Introduction

(ECP) הוא טיפול חיסוני מבוסס שהוא פעיל נרחב במרכזים אוניברסיטאיים ברחבי העולם. השימוש בו מונע על ידי יעילות מיוחדת של בסלקטיביות, בטיחות וכיוונית של טיפול ECP, תכונות שמניות ECP עם המערכת החיסונית הפיסיולוגית עצמה, שאליה היא מופיעה כשותפה. ECP הוא באופן סלקטיבי החיסון נגד תאים ממאירים בתוך לימפומה cell עורית (ctcl)^1,2, ו טולריזינג סלקטיבי עבור אנטיגנים ממוקדים בהשתלה, חסינות אוטומטית, והשתל-מול-מארח הגדרות (gvhd) ההגדרות מיכל שלוש ^{, 4}. המערכת החיסונית של ECP מודגשת על-ידי התלות שלו על תא תא CD8 T שלמים ב CTCL⁵, בעוד הפרט משתקף על ידי הפרופיל של ECP מאוד לוואי תגובה, ללא דיכוי החיסון מחוץ למטרה בהשתלה או הגדרות GvHD, ולא מוגברת הרגישות לדלקת אופורטוניסטי ב CTCL, שבו שיבוטים שאינם פתוגניים תא T יכול להיות איבד יחד עם תאים T ממאירים.

בהתחשב בחשיבות הקלינית של ה-ECP, התקווה כי הבנה טובה יותר של מכנייותיה עשויה להרחיב את ההישג הטיפולי של ה-ECP בספקטרום רחב יותר של סרטן והפרעות בהפרעות פיזיולוגיות. שתי סדנאות מורשה לאומית, מכון לבריאות ארצי (NIH) סימפוזיון המדינה-המדע⁶ והחברה האמריקנית לכנס הקונצנזוס של apheresis⁷, נערכו ודווחו, במטרה לזרז את ה זיהוי של התורמים הסלולריים העיקריים להשפעות האנטי-סרטניים והטולוגניים של ECP.

עד כה, למרות דיווחים רבים שפורסמו בניסיון לטפל במנגנון של ECP, שני מכשולים ראשוניים התשבו בהתקדמות מדעית. ראשית, חקירת מנגנוני ה-ECP בהגדרת המעבדה הניסיונית הוגבלה על-ידי חוסר התקן ECP זעיר שישקף במלואו את הסלולר של ECP ובהשפעות vivo, ויחולו על דגמי בעלי חיים. שנית, ניתוח מעבדה מעמיק של דגימות ECP בהגדרה הקלינית הוגבלה על ידי הזמינות המוגבלת של תאי החיסון של המטופל מעובד ECP, אשר דורשים גישה למרכזי טיפול, וכפופים בנוסף לעיתוי ה של המטופל, והצורך המוסרי לערכות ללא פשרות של לוקיציטים מטופלים.

כדי לפתור את המכשולים המחקשים את ההתקדמות של מחקר ECP, יצאנו לפתח מכשיר ECP זעיר שיהיה מקרוב ביותר לחקות את המרכיבים העיקריים של הטיפול. הטיפול הסטנדרטי של ECP כרוך במעבר של לוקיהרזיס של החולה-לוקיולוציטים מועשר באמצעות 1 מ"מ-עבה, אולטרה סגול אור (מיטת)-שקוף, צלחת פלסטיק^6,8. בצלחת, הלוקוציטים חשופים ל 8-מתיונין (8-מגב), סוכן צילום-פעילות אשר על-ידי חשיפה מגונה הוא המרה באופן מחודש לטופס תגובתי (8-מגב), מסוגל לחצות את ה-DNA באמצעות הכריכה הביונטית שלה כדי לבסס את הפיברילין על . האחיות די. אן. איי^9,10 מעובד, 8-מגב מטופלים לוקיציטים נאספים ומוחזרים באופן מידי למטופל.

מאז ECP עצמו הוא טיפול דו-כיווני, החיסונים בסרטן וטולריזינג בהשתלה, חסינות עצמית והגדרות GvHD, עבור הבהרה יש לנו בשם מודל החיסון של ECP המודל "ארעיות", ואת המצב הטולארוגניים "ההמרה". התמקדנו לראשונה במודאליות של הטרנזיזציה. התקן ה-ECP של העכבר לאדם שדווח לאחרונה על מזעור מיניאטורי, החדר או הלוח המקביל, והפרוטוקול המתאים, משכפל הן את vivo הסלולר והן את ההשפעות של התקן ה-ECP האנושי בהגדרת סרטן¹¹.

על מנת להפוך את הארעיות במודל vivo כמו הרלוונטי קלינית ככל האפשר, אנו יזמו את הטיפול חיסוני לאחר תת-עורי הוזרק גידולים בעכבר syngeneic הפך מוחשי, ובכך בדיקת יעילות הפרוטוקול בסרטן הוקמה. בדומה לECP ב-CTCL, הפרוטוקול החד החסין בפני העיקרון של מלנומה משתמש בתאי דם היקפיים (PBMC) מבעלי חיים לגידול. התאים עוברים דרך הצלחת TI בזרימה. בעוד ששמונה -מנקה טיפול בתאים בתאי המיניאטורות אפשרי, עדיף לנהל אותו בנפרד, כדי לוודא שרק סוג התא הרצוי נחשף למגב_של8. מחקרים מוקדמים יותר מצביעים על כך שהאפקט הטולגניים של הECP מתווך על-ידי התאים המכילים 8-_{למגב המציג בתאי}הגוף¹², בעוד שאפקט החיסונים דורש 8-למגב פציעה של תאים סרטניים מטרה¹¹. בפרוטוקול הארעיות או בתאי הגידול, או בתאים החיסוניים, ניתן לחשוף באופן סלקטיבי ל-8 -מגב לפי הצורך. מאז למקסם את הזמן של מגע בין 8-למגב תאים סרטניים ותאי הדנדריטים המושרה (DC) הוכח לשפר באופן משמעותי את היכולת החיסונית של ECP קליני¹³, אנו משולבים לילה שלב הדגירה המשותף לפרוטוקול שלנו. לאחר הדגירה הלילה, התאים המטופל מוחזרים לחיה נושאת הגידול.

מערכת זו מופחתת באופן אמין צמיחת הגידול ויזמה חסינות מסוימת נגד הגידול בעכברים עם גידולים syngeneic הוקמה¹¹, ואיפשר לנו לנתח את המנגנון של היעילות הקלינית אנטי סרטניים של ECP. בכמה מחקרים הדגמנו כי חסינות ECP הוא יזם דרך הפעלת טסיות vivo לשעבר בלוח TI^14,15. טסיות מופעל לאחר מכן לאותת התבגרות תא מונוציט-to-דנדריטי¹⁴, המוביל לייצור DCs הפיזיולוגי. בקרי הבית החדש שנוצר מונוציט הנגזרים מסוגלים להצליב בהווה אנטיגניםהפניל1 מ 8-למגב תאים סרטניים כדי להפעיל את התגובות הספציפיות לאנטיגן T¹⁶. כפי שהוצע בעבר^12,17, עם זאת,8-מגב המושרה נזק של בקרי התחום המתהווה עצמם יכולים נגד לפעול או אפילו להפוך את האפקט נגד הגידול¹¹, מתן קישור מכניסטי לסובלנות ECP.

לוחית TI השתמשה גם כדי לייצר בקרי Dc המופעלות מבחינה פיזיולוגית מ-PBMC אנושי. בדומה ללימודי העכבר, בקרי ה-TI האנושיים שלהם תלויים במעבר הצלחת בנוכחות טסיות עבור הדור שלהם, מופיעים פנופנסטים זהים לאלה המיוצרים בצלחת ה-ECP הקליני, והם מסוגלים לעבד ביעילות ו הצגת החוצה אנטיגנים הגידול האנושי להפעלה של תאים האדם T^11,16.

בחשיפת המנגנון של טיפול חיסוני ECP, גילינו אפוא שיטה להפקת במהירות העכבר הפיזיולוגי ותאים הדנדריטים של האדם באופן מומלץ, כי ניתן לאפנן מבחינה פונקציונלית. התקן TI החדשני והפרוטוקול יש חשיבות פוטנציאלית משמעותית בתחומים של מחקר ECP וטיפול חיסוני סרטן באופן נרחב יותר, ובכל שדה אחר עם עניין פיזיולוגית, תאים דנדריטים פונקציונלי בחיסון או המודריזציה. אנו מקווים שפרסום זה יספק את הכלים הנחוצים לבעלי עניין בתחומי מחקר כאלה.

Protocol

כל שיטות העכבר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת ייל, בהסכמה עם המכונים הלאומיים של הנחיות בריאות בעלי חיים. כל מחקרים אנושיים בוצעו עם דם שנתרם על ידי מתנדבים בריאים, עם הסכמה מושכלת בכתב. לימודי דם אנושיים נערכו בהתאם להנחיות המוסריות המוכרות (למשל, הצהרת הלסינקי, CIOMS, דוח בלמונט, ארה ב כלל משותף), ואושרו על ידי מועצת המחקר של ייל לניסויים קליניים תחת פרוטוקול מספר 0301023636.

הערה: להלן פרוטוקול המתאר ארעיות עבור טיפול נגד הגידול של גידולים בעכבר syngeneic.

1. השתלת הגידול בשנת 1.7

1. בצע את הפרוטוקולים הקבועים לגידולים syngeneic השתל לתוך מאגפים של עכברים לפי המתאים לקו הגידול של העניין.
   הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר את מודל הגידול של מלנומה C57BL/6 העכבר. יוממ 1.7 תאי מלנומה סופקו באדיבות ד ר בוסנברג, ייל¹⁸.
2. הפשרת מקטע של תאים קפואים והשתמש בתאים לאחר מעבר תא אחד. תרבות טרי-מופשר בתאים 1.7 מטרים בתערובת המזון התזונתי של הנשר השונה מסוג F-12 בינוני (DMEM/F12), שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות, תחת תקן מצבים של תרבית רקמה (37 ° c, 5% CO₂).
   1. לאסוף את התאים 1.7 מטרים ב 60 \ u201270% זרימה על ידי הוספת מספיק טריפסין-EDTA לכסות את החלק התחתון של הצלחת תרבות התא או בקבוקון (g., 4 מ ל עבור T75 בקבוקון).
   2. הנח את כלי התרבות של התאים בטמפרטורת החדר עבור 3 \ u20124 min, הקשה בעדינות על החלק התחתון או הצדדים של כלי הקיבול מדי פעם כדי לעזור לנתק את התאים.
   3. להוסיף 1 מ ל של סרום של שור עוברי (FBS) לכל 4 מ ל של טריפסין-אתיליניהאמארבחומצה (EDTA) כדי לעצור את התגובה ברגע שרוב התאים מנותקים. לאסוף את התאים על ידי ליטוף לתוך 15 מ"ל צינור חרוט. שטפו את הבקבוקון עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) והוסיפו את השטיפה לאותה צינורית קולקציה. מלאו את הצינורית ל-15 מ"ל עם הערוץ.
   4. קח מספר קטן. ותספור את התאים
   5. ספין למטה עבור 10 דקות ב 250 x g בתוך צנטריפוגה התרבות רקמה סטנדרטית כדי לאסוף את התאים הסרטניים.
3. השהה מחדש את התאים 1.7 מטרים ב-PBS בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/mL.
4. הזריק 1 x 10⁵ יוממ 1.7 תאי גידול תת-עורי ב 100 ΜL של PBS לתוך האגפים הימני של הנמען 4 עד 6 שבועות מסוג פראי גברים C57BL/6j, מורדם על פי הנחיות מוסדי (למשל, 3 \ u20125% isofממסים נדיפים גז, הרדמה אושר על-ידי חוסר רפלקס הרגל האחוריות).
5. ניטור נפח הגידול באמצעות דו-שבועי מדידות של קטרים הגידול הניצב גובה באמצעות caliper. חישוב יוממ 1.7 (נפח הגידול כמו אורך הגידול x רוחב x גובה)/2.
6. התחל טיפול ארעיות כאשר גידולים הופכים רק מוחשי; עבור יוממ 1.7 גידולים, זה בדרך כלל יום 7 \ u201210 post השתלת הגידול.

2. אוסף תאי דם היקפיים לארעיות

1. לאסוף 100 \ u2012150 μL של דם מעכבר הנושאת כל גידול באמצעות דימום הלחי.
2. כמו דם נאסף, בריכה דם מכל קבוצת הטיפול בעכבר (כל 5 עכברים ניסיוני +5 עכברים שליטה) בתוך שפופרת 15 מ ל בודד המכיל 5,000 U/mL הפרין. השתמש 10 μL של 10% הפארין לכל 100 μL שנאספו דם.
   הערה: לערבב את הצינור לעתים קרובות במהלך איסוף כדי למנוע קרישת דם. בעוד בקרת הגידול עכברים הנושאת ניתן לדמם באותו זמן כמו העכברים ניסיוני, כדי להבטיח תנאים שווים עם קבוצת הטיפול, את "שליטה" דם יכול להיות נמחק, או בשילוב עם הדם של קבוצת הטיפול כדי לספק נוספים PBMC ניסיוני עבור קבוצת הטיפול, לפי שיקול דעתה של החוקרים.
3. הגדרת שפופרת 1 15 mL עם 4 מ ל של בידוד לימפוציטים בינונית (לראות את הטבלה של חומרים) לכל 5 \ u201210 עכברים דימם. באיטיות שכבה דם (שנאסף מעכברים נושאת הגידול) על גבי המדיום. לסובב את התאים 20 דקות ב 1000 \ u20121, 500 x g כדי להפריד את pbmc מתאי דם אדומים.
4. בסוף צנטריפוגה, לאסוף את שכבת פלזמה העליון, עוזב ~ 0.5 mL נשאר מעל מעיל באפי, ולאחסן ב 4 °C לשימוש מאוחר יותר (שלב 7.1).
5. לאסוף את שכבת מעיל באפי לתוך נקי 15 מ"ל צינור, מילוי עם PBS כדי 15 mL, ספין עבור 10 דקות ב 250 x g ב צנטריפוגה תרבות רקמה סטנדרטית כדי לאסוף את pbmc.
6. והשהה מחדש את הגלולה. באמצעות השפופרת לא decant, כמו הגלולה הוא רך יכול להיות אבוד. הוסף 2 מ ל של ACK מאגר הפירוק של תא דם אדום (לראות את הטבלה חומרים) לצינור כדי להסיר את כל תאי הדם האדומים הנותרים מ pbmc. . מודקון על קרח במשך 10 דקות
7. ממלאים את הצינור עם PBS כדי 15 mL, ו ספין למטה עבור 10 דקות ב 250 x g בצנטריפוגה התרבות רקמה סטנדרטית כדי לאסוף את pbmc.
8. . ומשהה מחדש את הגלולה באמצעות מצליף לא decant, כמו הגלולה הוא רך יכול להיות אבוד.
   הערה: בשלב זה, PBMC מטוהרים ניתן לשנות כמו המתאים ביותר לניסוי. רכיבי PBMC שונים (טסיות, מונוציטים, סוגים אחרים של תאים חיסוניים) ניתן לרוקן או מבודדים מן PBMC לפי הצורך. כמו כן, PBMC עצמם יכולים להיות חשופים 8-מגב, או לפני או אחרי סעיף 4 (לפני או אחרי מעבר הצלחת — לאחר סעיף 2 או לפני סעיף 5), על ידי ביצוע שלבי הפרוטוקול 3.3 \ u 20123.8 והחלפת pbmc עבור יוממ 1.7 תאים. זה יהיה לחתוך את הקיבולת החיסונית של הטיפול, ובמקום זאת לקדם את הסובלנות החיסון.
9. עבור כל קבוצת טיפולים (כל 5 עכברים ניסיוני +5 עכברים שליטה), להשעות מחדש את הגלולה PBMC ב 300 μL FBS.

3.8-מנקה/מטפל בתאים סרטניים

1. תרבות ולאסוף בתאי הגידול של יוממ 1.7 כמתואר בשלבים 1.2 – 1.3 כדי להכין מקור_{של 8 מטאטא של תא הגידול החשוף ממקור}אנטיגן.
2. להכין 2.5 x 10⁶ יוממ 1.7 תאים סרטניים לכל קבוצת טיפול של 5 עכברים. עבור כל קבוצת טיפול, להשעות מחדש את הגלולה תא הגידול ב FBS ב 2.5 x 10⁶ תאים/300 μl (~ 8.33 x 10⁶ תאים/mL).
3. עם האורות של תרבות הרקמה כבוי, להוסיף 8-מגב (לראות את הטבלה של חומרים) על הבולם התאים של הגידול יוממ 1.7 עבור ריכוז 8-מגב אחרון של 100 Ng/mL.
   שים לב: שמונה-סמרטוט הוא סוכן DNA-הגורם לנזק ומסרטן. נקוט זהירות בעת טיפול וחילוק, הימנע מיצירת קשר עם העור החשוף והשמט כראוי.
4. מערבבים היטב את התאים, עוטפים את המיכל התא בנייר כסף, ו דגירה עבור 20 דקות ב 37 °C.
5. Pre-מעיל לוח 12-היטב התרבות רקמה על ידי מילוי אחד טוב עבור כל קבוצת הטיפול של 5 עכברים (2.5 x 10⁶ יוממ 1.7 תאים סרטניים) עם 1 מ ל של fbs, וצלחת מלאה למקרר עבור 20 דקות ב 4 °C.
6. הפעל את מקור האור המקורי כדי לחמם אותו מראש.
   זהירות: האור הוא מסרטן. בעבודה עם מקורות האור הפועלים במהירות ובזהירות, הגנו על העור מפני חשיפה והשתמשו במגן פנים או במשקפיים כדי להגן על הפנים והעיניים.
7. לאחר 20 דקות, להזיז את הצלחת בקירור 12-הבאר (שלב 3.5) אל השכונה תרבות הרקמה, להסיר FBS מן בארות, ולהוסיף 300 μL (2.5 x 10⁶ תאים/גם) הגידול מטאטא התאים הסרטניים (משלב 3.4) לכל טוב.
8. לחשוף את הצלחת התא המכיל את מקור האור הטרום מחומם ביותר עבור הקרנה סה של 4 J/cm².
   הערה: הריכוז של 8 המגב והמינון המתואר כאן מכוילים לאורך קו הגידול של יוממ 1.7. טיטור של 8-למגב/מינון, מספיק כדי לגרום 100% מוות תאי הגידול בתוך 1 שבוע של חשיפה, יש לבצע עבור כל קו הגידול ניסיוני, כדי לקבוע מינון יעיל להרוג. זה חשוב באופן ביקורתי עבור העכבר בניסויים vivo TI, כי התאים מוזרק מחדש רטרו-אורבאלי (שלב 6.1) ולכן כל תאי הגידול ניזוק עשוי אחרת טופס גידולים העין בבעל החיים המטופל. כמנחה, 4 \ u20128 J/cm² של ומלא, 100 \ u2012200 Ng/mL 8-מגב, הוא טווח יעיל טיפוסי עבור התאים הסרטניים ביותר קווי.
9. לאסוף 8-מגב תאים סרטניים מטופלים מכל באר, מתערבל את הצלחת וליטוף בזהירות כדי להבטיח התאוששות מלאה התאים.

4. TI בלוח מעבר של תאים

1. עבור כל קבוצת טיפול של 5 עכברים, לשלב אחד 1.5 mL חרוט שפופרת 300 μL של PBMC המתאים (משלב 2.11) ו 300 μL של 8-מגב תאים סרטניים מטופלים (משלב 3.9). ערבב את התאים.
2. השתמש מזרק 10 מ ל כדי למלא את "כניסה" ו-"יציאה" סטים של צינורות TI (ראה את
   רשימת חומרים) עם FBS. פתח את התפסים אבובים כדי למלא את הצינורות, ולסגור מלחציים לאחר צינורות מתמלאים לפני ניתוק המזרק, כדי לשמור על FBS בתוך אבובים.
3. השתמש בפיפטה P1000 כדי להוסיף את ה-PBMC ואת שילוב תא הגידול (משלב 4.1) ללוח TI (לראות את הטבלה של חומרים). להחזיק את הצלחת בזווית 45° , מניחים את הצינור באופן מאובטח לתוך צריכת לוחית TI, ולמלא את הצלחת לאט, הימנעות בועות.
4. הסר את הסיכה מהקליטה לפני שתשחרר את הבוכנה. הצלחת מחזיקה 450 μL; החזר את התאים הנותרים לשפופרת החרוט 1.5 mL.
5. מודטת את הצינורות המלאים של FBS, את הצלחת ה-TI של התא, ואת שפופרת ה-1.5 mL המכילה את התאים הנותרים בחממה לתרבית רקמות ב 37 °C עבור 1 h. לאחר הדגירה, לרוקן את צינורות TI על ידי כוח הכבידה, שחרור התפסים.
6. השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר תאים מהצלחת TI על-ידי הוספת העצה עם הבוכנה מדוכאת לתוך יציאת הצלחת. להחזיק את הצלחת בזווית 45° ולמלא את הקצה P1000 tte. המקום תאים בחזרה המקורי שלהם 1.5 mL חרוט.
7. כדי להפעיל את לוחית TI, חבר את צינור היציאה לצלחת ואבטח את הצלחת TI לתוך מערכת ההפעלה של הלוח.
8. באמצעות מזרק 1 mL, לצייר את 600 μL של PBMC ו לערבב תא הגידול מ-1.5 mL שפופרת חרוט, להיפטר כל בועות במזרק, לצרף את המזרק לצינור הכניסה עם מלחציים לפתוח לאט מילוי עד הנוזל מגיע לסוף אבובים.
9. הצמד את הקצה החופשי של צינור הכניסה ללוח TI והמשך לטעון בעדינות את העוצמה הנותרת. סגור את מהדק הכניסה.
10. לנתק את מזרק 1 mL ולחבר את צינורות הכניסה למשאבת מזרק. אבטחו את צינורות היציאה לצינור הניקוי החרוט 1.5 mL.
11. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל 0.09 mL/min, אך אל תפעיל את המשאבה עדיין. הטה את לוחית ה-TI ב-30° לכיוון צד משאבת המזרק, באמצעות לוחית הפעלה של ti או כל אמצעי אחר (לדוגמה, אובייקט שטוח קטן תחת קצה אחד של הלוח).
12. שחררו בזהירות את המלחציים על צינור הכניסה. הפעל את משאבת המזרק, התבוננות בקפידה כיצד ממלאים את הצלחת TI, וצינורות קפיצי או צלחת בהתאם לצורך, יש לעכב את הזרימה בועות אוויר.
13. לאחר הצלחת TI מלאה לחלוטין, להטות אותו ~ 30° בכיוון ההפוך כפי שהוא מרוקן. כאשר כל התאים והנוזלים נמצאים בצינור 1.5 mL, לעצור את המשאבה.
14. כדי לשטוף את הצלחת TI, לנתק את צינורות הכניסה מן המשאבה מזרק, להתחבר מזרק 1 mL מלא עם 600 μL FBS, ובצע את ההליך עבור שלבים 4.8 \ u 20124.9.
15. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.49 mL/min, שחרר את תפס הכניסה, והפעל את לוחית ה-TI כמתואר בשלבים 4.12 \ u 20124.13, איסוף השטיפה בצינור האוורור של אותו 1.5 mL. קפיצי או הקש על צלחת TI בעדינות כל הזמן, כדי לסייע להתנתק ולהתחמק כל התאים חסיד.
16. לסובב את האוסף 1.5 mL שפופרת חרוטי ב שחקן הספסל microfuge ב 250 x g עבור 8 דקות. להיפטר supernatant.

5. הכנת סרום ללילה בינונית-תרבותית

1. לאסוף דם מ 10 \ u201212 הישן C57BL/6J עכברים על ידי כל שיטת מאושר מבחינה כלשהי (למשל, דימום העין, וריד הזנב, בליד הלחי, או מסוף לדמם החוצה על ידי ניקוב לב), ללא קרישה כלשהי. הערכת איסוף של דם 1 מ"ל עבור כל 300 μL של הסרום הדרוש.
   הערה: אחד צריך 300 μL של סרום עבור כל קבוצת טיפול של 5 עכברים בניסוי.
2. הניחו לדם לעבור לילה ב -4 ° c.
3. לסובב את הדם תקרש ב 3,000 x g עבור 15 דקות. בזהירות לאסוף את הרובד העליון המכיל סרום
   הערה: סרום יכול לשמש מיד כדי להפוך את התא לילה דגירה בינונית (שלב 6.1), או נשמר לניסויים בעתיד. כדי לשמר את הנסיוב, להקפיא ב-20 ° c.

6. לילה Co-דגירה של PBMC עם אנטיגן

1. השהה מחדש את הגלולה PBMC ו הגידול (שלב 4.5) ב 2 מ ל של RPMI ברור עם סרום לעכבר 15% (מוכן בשלב 5). צלחת ב 35 mm ללא רקמה-רקמות מטופלים התבשיל סטרילי, ו דגירה לילה תחת התנאים תרבות רגילה רקמה (37 ° c, 5% CO₂).
   הערה: אם pbmc נמצאים בשימוש עם אנטיגן שאינו סלולרי (פפטיד, ננו-חלקיק, חלבון, וכו '), להשמיט את סעיף 3 של הפרוטוקול, ולהמשיך מסעיף 2 ישירות לסעיף 4, הוספת האנטיגן הרצוי לצלחת TI-עבר pbmc עבור לילה שיתוף הדגירה כאן ב שלב 6.1.
2. ביום למחרת, לנתק בזהירות כל תאים חסיד מהחלק התחתון של המנה עם מגרד התרבות רקמה, סיבוב המנה תוך גירוד כדי להבטיח גם אוסף תאים. לאסוף את התאים בצינור 15 מ ל.
3. הוסף 2 מ ל PBS אל המנה וחזור על הצעד הגרד, איסוף התאים לתוך הצינור זהה. לשטוף את הצלחת 35 mm עם 1 mL PBS ולהוסיף את השטיפה לאותו צינור.
4. ספין עבור 10 דקות ב 250 x g בתוך צנטריפוגה תרבות הרקמה הסטנדרטית כדי לאסוף את התאים. ולהשעות מחדש את הגלולה. באמצעות השפופרת לא decant, כמו הגלולה הוא רך יכול להיות אבוד.

7. הזרקה מחדש של תאים מטופלים TI לתוך הגידול עכברים נושאת

1. הספין פלזמה אוטוולוגי (מוכן בשלב 2.4) ב 750 x g עבור 15 דקות כדי משקעים כל החלקיקים. השהה מחדש את הגלולה (משלב 6.4) ב 600 μL של פלזמה אוטוולוגי או PBS.
2. הכנס תאים ב 100 μL לכל עכבר לתוך מקלעת הרטרו מסלולית של מורדם כראוי (למשל, 3 \ u20125% Isofלינה גז ממסים נדיפים, הרדמה אושרה על ידי חוסר רפלקס הרגליים האחוריות) מנושאת הגידול עכברים ניסיוני. אם כל כך רצוי, להזריק מחדש בקרת הגידול עכברים נושאת עם 100 μL של פלזמה אוטוולוגי בלבד, או PBS.
3. בשביל יותר טוב מ 1.7 עכברים הנושאת גידול, לחזור על הטיפול (שלבים 2-7.2) פעמיים בשבוע עבור 3 שבועות, עבור סך של 6 טיפולים. לאסוף ולעבד את PBMC מפני הגידול עכברים הנושאים שבועי (מקטעים פרוטוקול 2 \ u20124) בימי שני וחמישי, ו להשרות מחדש לאחר הדגירה לילה (סעיפים הפרוטוקול 5 \ u20127) בימי שלישי ושישי.
   הערה: משטר טיפול זה פותחה עבור קינטיקה הצמיחה הספציפית של יוממ 1.7 גידולים בעכברים. ייתכן שיהיה צורך להיות טיטרציה עבור מערכות גידולים אחרים עם שיעורי צמיחה איטית או מהירה יותר של הגידול — בהתאמה גוברת או צמצום מספר טיפולים.
4. ניטור נפח הגידול באמצעות מדידה דו-שבועי-רצוי בזמן מינהל הטיפול (שלישי ושישי)-של קטרים הגידול הניצב גובה באמצעות caliper. סיים את הניסוי כאשר השליטה באמצעי הגידול מגיע לגודל המקסימלי המותר על-ידי הנחיות ופרוטוקולים מוסדיים.

8. התאמת פרוטוקולים לטיפול בכרכים של דם אנושי

1. להתאים את הפרוטוקול לשימוש עם התאים האנושיים על ידי בידוד ראשון PBMC מהדם האנושי. השתמשו בהפרין כאנטי-מקריש, עם פרוטוקול בידוד המועדף על PBMC.
2. ודא ששבר PBMC מבודד מכיל מספר פיזיולוגי של טסיות, לקבלת תוצאות הפרוטוקול הטובות ביותר. מוניטור טסיות ספירות בידוד לפני ואחרי PBMC באמצעות כל מונה המטולוגיה רגיל.
3. אם משתמשים במקור אנטיגן תאי אנושי, התייחסו לתאים האנטי-גניים האנושיים בעקבות הצעדים המתוארים בסעיף 3 לתאים בעלי יותר מ-400. מינון 8-מגב ומנות בהתאם.
4. בצעו מעבר ללוח הצעדים המתואר בסעיף 4, באמצעות עד 3 x 10⁷ pbmc לוחית.
5. תרבות PBMC לילה עם אנטיגן הסלולר/אחרים של הבחירה, כפי שמתואר בסעיף 6, אבל החלפת 15% סרום AB האדם עבור פלזמה העכבר האנושי עבור בינונית תרבות הלילה בשלב 6.1.
6. השתמש בתאים המתקבלים בכל שיטת הרצוי. לדוגמה, שיתוף תרבות עם תאי T מגיבים אנטיגן להתבונן תגובות תא T ספציפיות לאנטיגן שיזם התאים שטופלו על-ידי TI.

Results

פיתחנו לאחרונה מכשיר ECP מיניאטורי של עכבר לאדם, לוחית TI (איור 1A), ותוכנן פרוטוקולי טיפול מתאימים. ההתקן והפרוטוקול לשכפל מפתח סלולרי בתכונות vivo של החיסון ECP, כינה "ארעיות".

פרוטוקול ההוכחה העקרונית של החוק¹¹ (איור 1b) כולל מעבר לצלחת החילוץ של הלוח ההיקפי של דם היקפי (pbmc) מתוך עכברים הנושאת הגידול יחד עם האפוטוטיק 8-סמרטוט-חשוף תאים סרטניים. בעיקר, תא TI הוא שקוף ובגודל התואם לפורמט המיקרוסקופ הרגיל, ומאפשר הדמיה קלה של אינטראקציות תאים בתוך לוחית ה-TI בכל נקודה של הפרוטוקול (וידאו 1). TI-פלייט המופעל תאים חיסוניים מודבטים בן לילה עם 8-_{למגב בתאי}הגידול חשופים, הקלה ספיגת התא הגידול, עיבוד, והעברה של אנטיגנים הגידול אל DCs. ביום שלמחרת, התרכובת הסלולרית מוחזרת לזרם הדם של החיה נושאת הגידול. בעלי חיים לשלוט לעבור הליכים זהים איסוף דם, כדי לנרמל עבור כל ההשפעות של lymphodepletion על גידול בגידול, אבל במקום זאת לקבל את החליטות של PBS. צמיחת הגידול בכל בעלי החיים מפוקחת במהלך הניסוי.

במחקרים המשתמשים במודל מלנומה של מורג 1.7 ממורג, הפרוטוקול הארעיות חזר פעמיים בשבוע במשך שלושה שבועות, במשך שישה טיפולים בכל בעל חיים (איור 1B). הטיפול הופיע נסבל היטב בכל בעלי החיים שטופלו (> 100), ובעקביות הראה הפחתת הגידול של בעלי חיים 1.7 הצמיחה מטופלים לעומת בעלי בקרה, כפי שנצפו 9 ניסויים עצמאיים שנערכו מעל 2 שנים (איור 2A, ב). התוצאות להראות הגידול המצטבר נתונים הצמיחה בבעלי חיים מטופלים ושליטה על כל הניסויים שבוצעו (איור 2A), כמו גם מייצגים הצמיחה עקומות הגידול עבור בעלי חיים בודדים בתוך ניסוי אחד, כדי לספק תחושה השונות במערכת (איור 2B).

מצאנו כי ההצלחה של הפרוטוקול באופן ביקורתי תלוי בנוכחות של מונוציטים ב-PBMC שטופלו, נוכחות של טסיות בשבר PBMC, ואת לוחית המעבר של הלוח TI. כאשר מעבר צלחת מושמט, או כאשר טסיות או מונוציטים מרוקנים את השבר PBMC, ההשפעה הטיפולית כבר לא נצפתה (איור 3A). הטיפול גם דורש נוכחות של תאים סרטניים האפוטוטיים. זה לא יעיל בהעדר של התאים החיסונית או מקור אנטיגן, או בנוכחות של אנטיגן לא תואם, למשל כאשר עכברים הנושאים בעלי השפעה רבה יותר 1.7 גידולים מטופלים באמצעות MC38 תאים קרצינומה של המעי הגס (איור 3B). עבור התוצאה החיסון הוא קריטי גם כדי למנוע חשיפה PBMC ל 8-מגב. 8-_מנקהpbmc חשוף לא רק מבטלת, או אולי אפילו הפוכה, אנטי הגידול חסינות (איור 3c), אבל גם לעכב את החיסון הפוטנציאלי של תאים לא חשופים, כמו בניסוי שבו מספר שווה של 8-מגב_החשופהו 8-מגב Pbmc מוגן שימשו ללא השפעה הנצפה נגד הגידול (איור 3c).

עם ה-PBMC האנושי, תא TI ופרוטוקול הארעיות מובילים להפעלת מונוציט מוצלחת לתוך DC, הניתנים להבחנה על-ידי משטח התא וסמני הפעלה תאיים שהושגו על-ידי צלחת ה-ECP הקליני (טבלה 1). כמו בלימודי העכבר, DC הפעלה (איור 4a) ואת היכולת של בקרי מעבר שנוצרו של ארעיות כדי לעבד ולהציג אנטיגן (איור 4a,C) באופן ביקורתי לסמוך על נוכחות של טסיות ב-pbmc, ועל מעבר לוחית TI. הפעלת בקרי הגוף האנושי המופעל באמצעות ארעיות יכול ביעילות לעבד ולהצליב אנטיגנים משני הצדדים (איור 4B),או אנטיגנים מן שלמות 8-מגב תאים סרטניים האדם, כדי להפעיל את הגוף אנטיגן האנושי ספציפי T קווי מחוץ לתחום (איור 4C), בצורה של TI וטסיות-דם (איור 4C, C).

איור 1: ארעיות (TI) שרטוט החדר והפרוטוקול. (א) דיאגרמה ומפרטים של חדר הטיפול הארעיות (לוחית TI). (ב) תיאור סכמטי של זרימת עבודה ניסיונית לטיפול בטרנזיזציה. בקצרה, בעלי חיים הם מחוסן תת-עורי (ספורטינג ראגה) עם תאים סרטניים syngeneic; בעלי חיים עם גידולים ממשית מטופלים פעמיים בשבוע על ידי למתוח דם, בידוד של PBMC מ דם, מעבר זרימה PBMC דרך לוחית מצופה טסיות הדם אוטוולוגי בנוכחות של 8-מגב/מטופלים תאים סרטניים, PBMC ו-הגידול שיתוף הדגירה הלילה, ו הזרקת מחדש של התאים באופן מידי לתוך אותו בעלי חיים הנושאת גידול. נפח הגידול נמדד לאורך הניסוי. . הדמות הזו השתנתה מ^-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ארעיות שולטת בצמיחה של יוממ 1.7 גידולים מלנומה syngeneic. (א) יוממ 1.7 נפח הגידול לאורך זמן המותוות עבור C57BL/6 עכברים מחוסן עם 1 x 10⁵ טוב יותר 1.7 תאים סרטניים, וקבלת או שישה מעבר טיפולים (קו שחור), או שישה טיפולי בקרה (הקו האפור). הנתונים מצטברים על פני תשעה ניסויים עצמאיים שנערכו למעלה משנתיים. (ב) נתונים מנציג אחד בלבד, הניסוי השני של הארגון, עם כל שורה המציגה גידול לעכבר בודד. (A and B) עכברים בשליטת הPBS בכל הניסויים היו מדמם על אותו לוח זמנים כמו בעלי החיים הניסיוניים, אך התקבלו שש חליטות מחדש של ה-PBS. קווי שגיאה מייצגים את SEM, ערכי p שחושבו עבור כל נקודת זמן באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של Sidak; * *, p = 0.0013; , p < 0.0001. . הדמות הזו השתנתה מ^-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ארעיות דורש מונוציטים וטסיות בצלחת TI-עבר PBMC השבר, כמו גם 8-למגב טיפול בתאי הגידול אנטיגן בהתאמה ו 8-מגב חוסך pbmc. (א) יוממ 1.7 נפח הגידול לאורך זמן המותוות עבור C57BL/6 עכברים מחוסן עם 1 * 10⁵ יוממ 1.7 תאים סרטניים, וקבלת או שישה טיפולים ארעיות (קווים שחורים מוצק), שישה טיפולי שליטה (קווים אפורים מוצק), או שישה טיפולים TI כאשר מונוציטים או טסיות היו מרוקנים PBMC לפני המעבר הלוח (באמצעות a-CD11b ו-a-CD41 ערכות מחסור, בהתאמה), או מעבר הצלחת הושמט (קווים מנוקדים). (ב) נפח הגידול לאורך זמן הותווה עבור C57BL/6 עכברים מחוסן עם 1 x 10⁵ בתאי הגידול, וקבלת שישה טיפולים ארעיות (קווים שחורים מוצק), שישה טיפולי שליטה (קווים אפורים מוצק), pbmc לבדו (קו מקווקו), 8- _{הטיפול במטלית מטופל בתאים}1.7 מטרים בלבד, או TI בשימוש בתאי גידול MC38 (קווים_{מנוקדים}). (ג) נפח הגידול לאורך זמן המותוות עבור C57BL/6 עכברים מחוסן עם 1 x 10⁵ בתאי הגידול, וקבלת או שישה טיפולים ארעיות (קווים שחורים מוצק), שישה טיפולי שליטה (קווים אפורים מוצק), שישה טיפולים TI שבו PBMC היו חשופים באופן אחיד 8- מגב מיד לפני הצלחת מעבר, שישה טיפולים TI שבו pbmc היו חשופים באופן אחיד 8-מגב מיד לאחר מעבר צלחת, או שישה טיפולים שבהם תאים TI לאחר מעבר צלחת היו מעורבים 1:1 עם מספר שווה של PBMC שנחשפו בצורה אחידה 8-מגב_הקרנה (קווים מנוקדים). (A, B ו- C) עכברים בשליטת הPBS בכל הניסויים היו מדמם על אותו לוח זמנים כמו בעלי החיים הניסיוניים, אך התקבלו שש חליטות מחדש של ה-PBS. נתונים ניתנים לניסויים מייצגים. בארים מייצגים את SEM, P-ערכים שחושבו עבור כל נקודת זמן באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של Sidak; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; , p < 0.001; , p < 0.0001; NS = הבדלים אינם משמעותיים. . הדמות הזו השתנתה מ^-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פרוטוקול TI עם תא TI במהירות גורמת התבגרות DC, פרופיל הפעלה ייחודי, ו-T הפעלת הקיבולת של ה-PBMC אנושי, תלוי במעבר לוחית וטסיות.
A. facs ניתוח של סמנים המצוין ב CD11c⁺ תאים בין האדם בודד טרי pbmc ("שליטה"), pbmc שטופלו עם פרוטוקול ti ("ti"), או TI-טופלו pbmc שבו מעבר צלחת הושמט, טסיות התרוקנו באמצעות a-CD41 חרוז לפני מעבר צלחת, או שניהם של הנ ל בוצעו. נתונים מסכמים שישה ניסויים עצמאיים עם שלושה תורמים דם. סרגלים מייצגים ערכים מרעים, בעוד שקווי שגיאה מייצגים את SEM. ערכי P עבור כל השוואה שחושבה באמצעות מבחן t משויך; *, p < 0.05; * *, p < 0.01. חלוניות ששונו מ-¹¹. ב. טסיות דם-המכיל או טסיות-לרוקן TI מטופלים האדם pbmc האנושי היו שיתוף לילה עם בלתי רלוונטי (si,) פפטיד, או עם פפטיד ארוך עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים-HPV E7 הקשורים חלבון. PBMC השתמשו אז כדי לעורר קו התא האנושי CD8 T מגיב במיוחד ל E7 פפטיד. גירוי תא T נמדד על ידי הפקה של IFNg לאחר 5 ימים של תרבות. (ג) טסיות דם-המכיל או טסיות-דם מטופלים TI-מטופל pbmc האדם היו שכונתיות לילה עם 8-מגב מטופל הראש וצוואר קרצינומה_שלתאים תא תאים SCC61, או לבטא (SCC61 HPV E6/7) או לא לבטא (SCC61 אין hpv ) HPV E6 ו-E7 חלבונים האנטיגניים¹⁹. PBMC השתמשו אז כדי לעורר קו התא האנושי CD8 T מגיב במיוחד ל E7 פפטיד. גירוי תא T נמדד על ידי הפקה של IFNg לאחר 5 ימים של תרבות. (B ו- C) הנתונים מציגים ניסויים מייצגים עם שלושה משכפל בכל אחד. ברים מייצגים ערכים מרעים, בעוד שקווי שגיאה מייצגים את SEM. P-ערכי-השוואה לכל ההשוואה המחושבים באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של Sidak; , p < 0.001; , p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סמן	פרמטר	טופל	לוחית ECP עם פרוטוקול TI	לוחית TI עם פרוטוקול TI	ECP בערך p לעומת TI
א. ל. ד	Δ MFI	100.1 ± 42.4	439.8 ± 152.5	417.7 ± 152.2	NS
CD80	Δ	3.9 ± 1.1	22.3 ± 7.2	24.5 ± 7.2	NS
CD83	Δ MFI	0.3 ± 0.2	53.3 ± 9.7	51.4 ± 17.4	NS
CD86	Δ MFI	10.8 ± 1.7	103.9 ± 23.4	87.1 ± 17.6	NS
מיכל האור	Δ MFI	54.5 ± 12	721.4 ± 183.6	528.7 ± 135.5	NS
ICAM1	Δ MFI	12.2 ± 1.6	179.6 ± 28.5	192.5 ± 25.4	NS
ITGB5	Δ MFI	53.6 ± 25.7	97.1 ± 31.6	103.8 ± 32.8	NS
CCL2 (MCP-1)	Δ	0.6 ± 0.5	70.1 ± 6.7	55.2 ± 8.9	NS
CXCL5	Δ	0.7 ± 0.4	39.1 ± 7.2	41.5 ± 4.7	NS
CXCL16	Δ	0.3 ± 0.2	28.0 ± 8.8	35.3 ± 11.7	NS
CD105 (אנגלין)	Δ MFI	3.6 ± 0.3	124.3 ± 25.4	141.8 ± 33.2	NS
CD112 (הנקטין 2)	Δ MFI	10.9 ± 1.8	47.3 ± 5.2	50.9 ± 9.2	NS
CD120a (TNFR-1)	Δ MFI	10.1 ± 2.6	2.2 ± 1.4	1.8 ± 1.1	NS
CD137L (4-1BBL)	Δ MFI	2.9 ± 1.5	1.0 ± 0.4	1.2 ± 0.6	NS

שולחן 1: פרוטוקול ti עם תא ti מעורר במהירות את ההבשלה בגיל הבירה לתוצאה של פרוטוקול ti עם תא ECP קליני. FACS ניתוח של שינוי של סמנים המצוין מתוך בקרות IgG המקביל ב-CD11c האנושי לחיות בתאים בין או מבודדים טריים PBMC ("ללא טיפול"), PBMC עבר דרך צלחת ה-ECP הקליני בעקבות פרוטוקול TI ("לוחית ECP עם פרוטוקול TI") ו נותחו בעקבות הדגירה לילה, או PBMC שטופלו בפרוטוקול TI ("לוחית הרישוי עם הפרוטוקול") ונותחו לאחר הדגירה הבאה של הלילה. עבור סמנים, כגון HLA-DR, שבו כל אוכלוסיית התא שונתה, הנתונים מבוטאים כשינוי בעוצמת קרינה מרושעת (MFI). עבור סמנים שבהם רק תת-ערכה של תאים מבטאים את הסמן, כגון CCL2, ההפרש באחוזים מסמן התאים החיוביים של live CD11c + PBMC מיוצג במקום. נתונים מסכמים שישה ניסויים עצמאיים עם שלושה תורמים דם. נתונים עבור כל סמן מבוטא בתור שגיאה סטנדרטית של ממוצע-גיל ± של הממוצע (SEM). ערכי P עבור כל השוואה שחושבו באמצעות בדיקה לא משויכת; NS = הבדלים אינם משמעותיים. הטבלה שונתה מ-¹¹.

וידאו 1: הדמיית תאים חיים של האינטראקציות של תא טסיות ותאים חיסוניים בתוך לוחית TI.
PBMC הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול 2 מעל ונחשף לצלחת הארעיות כמתואר בסעיף 4, למעט תקופת הדגירה הסטטית בשלב 4.2.3 הופחת מ 1 h כדי 30 דקות. במהלך פרוטוקול TI, הצלחת TI, הזהה בגודלה לשקופית מיקרוסקופ רגילה, הותאמה לתוך שלב ההמתנה של מערכת הדמיה פלואורסצנטית והתאים שבתוכו הפכו לתמונה בהגדלה של 40 x וב37 ° c במהלך מילוי הצלחת (4.2.2 ), לוחית הדגירה (4.2.3), וזרימת צלחת (4.3.5) שלבים. תמונות רצופות נרכשו וסרטים שיוצרו באמצעות תוכנת "שגרת הסריקה האוטומטית". הכיתובים שמתחת לווידאו מציינים את שלב הפרוטוקול שבו מצולמים התאים. חיצים ועיגולים בווידאו, עם הכיתובים המשויכים, הצבע את התאים ואת תחומי העניין. סרגל בקנה מידה 10 μM נמצא בפינה הימנית התחתונה לאורך הווידאו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Discussion

התקן המזעור והפרוטוקול המתוארים לעיל מאפשרים חקירת מעבדה יעילה של מנגנונים של ECP במערכות הניסוי של העכבר ובדגימות דם קטנות של בני אדם. זוהי מקדמה גדולה; למשל, זה איפשר לנו להדגים בפעם הראשונה את היעילות של ארעיות נגד גידולים מוצקים במודל העכבר ¹¹, פתיחת האפשרות העתידית של יישום דומה באונקולוגיה אנושית.

לפני התפתחותה של התקן הארעיות והשיטה המתוארים כאן, לא ניתן היה לחקור באופן מלא את כל ההיבטים של ECP. בדגמי העכבר, למרות שהמגב של הטיפול יכול להיות משוכפל במידה מסוימת על-ידי טיפול בתאים בצלחת פטרי^12,20, לא היתה יכולת להשתלב בשיטה שמעבר הצלחת, אשר הוכח ל ספק אינטראקציות טסיות דם דינאמיות החשובות באופן ביקורתי עבור הפעלת DC הפיסיולוגית של ECP¹⁴. במחקרים אנושיים, לחילופין, רכיב הזרימה היה נוכח במלואו, אך היכולת לחשוף באופן סלקטיבי רכיבים סלולאריים מסוימים ל-8-למגב, או להגן עליהם מפני זה, היה חסר^21,22. זה מנע את ההבנה המלאה של מנגנון ECP, והאופטימיזציה שלה לחסינות או סובלנות. בנוסף, כמות הדם הדרושה לעבודה עם מנגנון ה-ECP הקליני היא חקירה מדעית גדולה ומתעבדת. התקן ECP במזעור והפרוטוקול המתואר כאן בפעם הראשונה מאפשר מידול מעבדה יעילה, גמישה לחלוטין וגמיש מאוד. בנוסף, לוח TI מאפשר הדמיה בזמן אמת וניטור של אינטראקציות תאים בתוך הצלחת על ידי מיקרוסקופ.

עבור ההצלחה של הפרוטוקול באמצעות הן במערכות vivo ו ex vivo, זה קריטי כי PBMC מטופלים מכילים מונוציטים שניתן להפעיל בקרי Dc תפקודית. כדי להמשיך בהפעלה זו, יש צורך גם להבטיח ששבר ה-PBMC מכיל מספר פיזיולוגי של טסיות בריאות, הפעלה, ושפרוטוקול מעבר הלוח של TI מלווה בקפדנות. על מנת לכוון את בקרי התחום החדשים שהופעלו כלפי פעילות חוזרת ספציפית, הם חייבים להיות מסופקים עם אנטיגן. מצאנו כי השיטה היעילה ביותר של משלוח אנטיגן עבור חסינות נגד סרטן היא לילה שיתוף דגירה של DCs המופעל לאחרונה עם אנטיגן המכיל8-מגב תאים סרטניים חשופים. זה יש את היתרון הנוסף של היכולת ליצור התגובה אנטי סרטניים חיסוני מבלי לחייב את הידע הקודם של אנטיגנים הגידול, על ידי התרת DCs לבחור אותם. עם זאת, במקרים שבהם האנטיגן ידוע, היתה לנו הצלחה מסוימת במערכות vivo ex כאשר משתמשים בפפטידים בחינם כאנטיגנים בתוך הדגירה המשותף. עבור יישומים אימונוגניים, בקרי התחום עצמם צריכים להיות מוגנים מ-8-לטאטא חשיפה. לבסוף, ב vivo ניסויים, חשוב לעבוד עם מודל חיה כי הוא מסוגל חסינות נגד הגידול. ארעיות יצירות על ידי יצירת מופעל, אנטיגן ספציפי DCs, אשר עובד בגוף ליזום תגובות החיסונית מולדת ואדפטיבית. פעילות לקויה או חוסר של התאים NK, CD4, או CD8 T בעכבר המטופל ישפיע על יעילות הפרוטוקול^5,11.

בעוד הפרוטוקול המתואר כאן הוא הוכחה של עקרון אחד, כי כבר אופטימיזציה עבור מודל גידול מוצק של העכבר הסינגנטי, זה בכל זאת חושף הזדמנויות רבות. המנגנונים של ECP באונקולוגיה רק מובהר, ויש עדיין מקום רב להבנה משופרת. באופן כללי יותר, את היכולת ליצור עכבר מופעל באופן מבחינה פיזיולוגית ו-Dc אנושי, ו להפנות אותם בצורה סלקטיבית לכיוון החסינות אנטיגן ספציפי יש יישומים פוטנציאליים רבים מעבר לסרטן. היכולת לעשות את אותו הדבר, אבל במקום זאת להפנות את DCs לכיוון עמידות ספציפית אנטיגן, כפי שהוצע על ידי היעילות הטולריזינג של ECP עצמו, יש גם השלכות רפואיות רחב-טווח. עם שיטה זו, אנו מקווים לספק את הכלים ולפתוח שדרת פורה של מחקר עבור כל אדם עם עניין של הטיפולים הפיזיולוגיים DC.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 מ"ל)	Therakos, Inc	Rx בלבד, NDC מס' 64067-0216-01	פרוטוקול שלבים 3 ו-8 - טיפול בעכבר ובבני אדם 8-MOP/UVA בתאים
סרום AB	Lonza BioWhittaker	14-498E	שלב 8.5 - תרבית לילה של מאגר ליזה של תאי ליזה אדומים PBMC ACK אנושי
	Lonza BioWhittaker	10-548E	שלב 2 - הכנת
PBMC לעכברהרדמה מערכת V1 שולחנית עם ניקוי פעיל	VetEquip	901820	פרוטוקול שלבים 1 ו-7 - מבוא לגידול sc בעכבר ומתן TI
פלזמת עכבר אוטולוגית	הכנה במעבדה	n/a	הכנה לפי פרוטוקול שלב 2.4, שימוש ב  7.1 - ניהול טיפול TI בעכבר
סרום עכבר אוטולוגי	הכנה במעבדה	n/a	הכנה לפי פרוטוקול שלב 5, שימוש בשלב 6.1 - תרבית לילה של עכברי PBMC
C57Bl/6J	מעבדות ג'קסון		0000664 פרוטוקול שלבים 1, 2, 5 ו-7 - הזרקת גידול בעכבר, איסוף דם/סרום והחזרת טיפול
דימום לחיים GoldenRod lancet, 5 um	Medipoint	9891620	פרוטוקול שלב 2 - הכנת PBMC עכבר
Clear RPMI	Gibco מאת LifeTech	11835-030	פרוטוקול שלבים 6 ו-8 - תרבית לילה של עכבר/PBMC אנושי
DMEM/F12	Gibco מאת LifeTech	11330-032	פרוטוקול שלבים 1 ו-2 - תרבית תאים YUMM1.7
צלחות פטרי EasyGrip, פרוטוקול Falcon 351008 35 מ"מ			שלבים 5 ו-8 - תרבית לילה של עכבר/PBMC אנושי
Eppendorf 1.5 מ"ל צינורות חרוטיים	DOT Scientific	1700-GMT	שלבים 1-8
FBS (סרום בקר עוברי, מומת בחום)	SAFC Biosciences	12306C-500mL	פרוטוקול שלבים 1-4 - תרבית תאים YUMM1.7, טיפול 8-MOP/UVA בתאים, צלחת TI
Hemavet 950FS מונה המטולוגיה	Drew Scientific	HV950FS	פרוטוקול שלב 8.2 - ניטור מספרי טסיות דם אנושיים
Heparin 5,000U/mL	McKesson שירותי אריזה	949512	פרוטוקול שלבים 2 ו-8 - הכנת PBMC עכבר ואדם
Isoflurane	Abbott Laboratories	5260-04-05	פרוטוקול שלבים 1 ו-7 - מבוא לגידול sc בעכבר ומתן TI
מדיום בידוד לימפוציטים M מדיום בידוד לימפוציטים	Cedarlane Labs	CL5035	פרוטוקול שלב 2 - הכנת PBMC עכבר
חומצות אמינו לא חיוניות	Gibco by LifeTech	11140-050	פרוטוקול שלבים 1 ו-2 - תרבית תאים YUMM1.7
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)	Gibco by LifeTech	14190-144	שלבי פרוטוקול 1-7
עט/סטרפטוקוק	Gibco by LifeTech	15140-122	פרוטוקול שלבים 1 ו-2 - תרבית תאים YUMM1.7
צינורות חרוטיים פוליפרופילן 15 מ"ל	שלבי פרוטוקול	Falcon	352097
משאבת מזרק דו-ערוצית ניתנת לתכנות	Era Pump Systems Inc	דגם NE-4000	פרוטוקול שלבים 4 ו-8 - הפעלת לוחית TI
מחטי הזרקה רטרו-אורביטליות, 27G x 1/2	BD Biosciences	305109	פרוטוקול שלב 7 - מזרקים לטיפול ב-TI בעכבר
, 10 מ"ל (LUER-LokTip)	BD Biosciences	309604	פרוטוקול שלבים 4, 8 - הפעלת מזרקי צלחת TI
, 1 מ"ל (קצה החלקה)	BD Biosciences	309659	פרוטוקול שלבים 1, 4, 7, 8
סט צלחות וצינורות TI	Transimmune AG	אינו זמין מסחרית	אנא צרו קשר עם פרופ' ר. אדלסון או טרנסאימון על מנת לקבל את המכשיר על בסיס שיתוף פעולה.
פלטפורמת הפעלת הצלחות של TI	Transimmune AG	אינה זמינה מסחרית	אנא צרו קשר עם פרופ' ר. אדלסון או טרנסאימון על מנת לקבל את המכשיר על בסיס שיתוף פעולה.
צלוחיות תרבית רקמות, T75 (75 סמ"ר)	פלקון	353136	שלבים 1, 2, 6 ו-8 - תרבית תאים של עכברים ובני אדם
לוחות תרבית רקמות,	פלקון	353043	שלבים 3 ו-8 - טיפול בעכברים ובני אדם 8-MOP/UVA בתאים
מגרדי תרבית רקמות	פלקון	353085	פרוטוקול שלבים 6 ו-8 - תרבית לילה של PBMC עכבר/אדם
טריפסין-EDTA 0.25% (1x)	Gibco by LifeTech	25200-056	פרוטוקול שלבים 1 ו-2 - תרבית תאים YUMM1.7
מחטי הזרקת גידול, 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	פרוטוקול שלב 1 - מבוא גידול תת עורי בעכבר
UVA irradiator	ג'ונסון אנד ג'ונסון	לא זמין מסחרית	המנגנון פותח במיוחד על ידי J& J עבור המעבדה של פרופ' ר. אדלסון. מספר מכונות זמינות במעבדה על בסיס שיתופי; אנא צור קשר עם פרופ' ר. אדלסון לשימוש באחד. רדיאטורים חלופיים של UVA זמינים מסחרית אך לא נבדקו על ידינו.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 מערכת הדמיה	מכשיר הדמיה פלואורסצנטי	Invitrogen