אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי, שמנגן תפקידים חשובים במסלולי איתות שונים, והוא מעורב בעיקר בתיאום תפקוד כרומטין ותהליכים הקשורים ל-DNA. שינוי זה כולל פעולה רציפה של אנזימים מספר כולל E1 אוביקוויב-הפעלה, E2 אוביקוויב-מעלה-מעלה ו-E3 אוביקוויב-ligase והוא הפוך על ידי דאוביטיות (DUBs). אוביקווינציה גורמת השפלה של חלבונים או שינוי של פונקציית החלבון כולל אפנון של פעילות אנזימטית, חלבון-חלבון אינטראקציה ולוקליזציה subcellular. צעד קריטי להפגין אוביקוויטיות חלבון או דאובינציה היא לבצע תגובות מחוץ לחומרים עם רכיבים מטוהרים. התגובות אוביקוויטיות יעיל והתגובה הדו יכול להיות מושפע מאוד על ידי רכיבים שונים המשמשים, האנזים שיתוף גורמים, מאגר תנאים, ואת האופי של המצע. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לניהול אוביקווינציה ותגובות דאוטיות. אנו ממחישים את התגובות הללו באמצעות רכיבים מינימליים של מתחם העכבר polycomb סרק מורכב 1 (PRC1), BMI1, ו RING1B, E3 אוביקוויב ליגאז לפני שהוא H2A על ליזין 119. דאוביטיות של נוקלאוטיז H2A מבוצע באמצעות מורכבות מינימלית של הפולימסרק (PR-דאב) המורכב על ידי האדם deubiquitinase BAP1 והמתאם הדו (דאובאד) התחום של הגורם המשותף שלה ASXL2. ניתן לנהל את הרקומביננטי האלה בהקשר של מישהו משני הצדדים בחלבונים מטוהרים בחיידקים או בנוקלאוזומים מקומיים מטוהרים מתאי מיונקים. אנו מדגישים את המורכבויות שיכולה להשפיע באופן משמעותי על תגובות אלה ואנו מציעים כי העקרונות הכלליים של הפרוטוקולים הללו יכולים להתאים במהירות ל-E3 אחרים ולליקוויטיות.
מבוא
אוביקווינציה היא אחת השינויים השכיחים ביותר שלאחר ההעברה והיא קריטית עבור מגוון רחב של אורגניזמים כולל שמרים, צמחים ובעלי חוליות. אוביקווינציה מורכבת ההחזקה הקוולנטי של אוביקוויב, 76 שמרו באופן מאוד polypeptide חומצות אמינו, כדי למקד את החלבונים ומתרחשת בשלושה צעדים רציפים מעורבים שלושה אנזימים, כלומר, E1-הפעלה, E2-מעלה מעלה ו E3 ליגאז1, 2,3. השינוי הפוסט-טרנסלייתי הזה ממלא תפקידים מרכזיים בספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים. אכן, E3 ליגסים, אשר לספק את הספציפיות של התגובה, מהווים משפחה גדולה של אנזימים הם האנזימים הנפוצים ביותר של מערכת אוביקוויב4....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. GSH-לטיהור אהדה של GT-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 אוביקוויב לילגאוס קומפלקס
- השתמש pGEX6p2rbs-GT-RING1B (1-159 aa)-BMI1 (1-109aa) חיידקים ביטוי לבנות להפוך BL21 (DE3) חיידקים (ראה טבלת חומרים)23. בונה זה מאפשר את הביטוי של מורטין RING1B תחום 1-159 התמזגו BMI1 תחום 1-109 עם תג GT ב pGEX-6P-2 השדרה.
- לבצע תרבות התחלתית לילה על ידי הRING1B RIL-בקטריה המבטא GT-(1-159 aa)-BMI1 (1-109 aa) ב 20 מ ל של מדיום מרק LB בנוכחות של 100 μg/mL אמפיצילין ו50 μg/mL כלורמפנול. מודטה על ידי טלטול ב 37 ° c בלילה. ביום למחרת, להוסיף את התרבות הראשונית לבקבוקון 1 L המכיל 500 mL של מדיום ליברות טרי מרק (1/26 דילול) עם אמפיצילין....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
GT-BMI1 וחלבונים RING1B מיוצרים היטב בחיידקים ניתן לחלץ בקלות בשבר מסיסים. איור 1A מראה כתמים כחולים coomassie עבור טיהור אופייני של מתחם GT-BMI1-RING1B. GT-BMI1 ו RING1B הלהקות להגר במשקל מולקולרי צפוי, ~ 45 kDa ו ~ 13 kDa בהתאמה. בעיקר מורכבות E3 ליגאז הוא הומוגנית מאוד עם רמות נמוכות מאוד של חיידקים חלבונים מזהמים ו/או מוצרים השפלה. יתר על כן, הסטואיצ'ימטריה של הקומפלקס מטוהר הוא אופטימלי, כמו עם יחס טוחנת של 1:1, עוצמת הלהקה של חלבון GT-RING1B צפוי להיות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר יתרונות של יצירת עמידות בפני מבחנה אוביקוויטיות ומוסר דאוביסטי לחלבונים של עניין. מאמר זה יכול לשמש ל: (i) לבסס תנאים אופטימליים ולהגדיר דרישה מינימלית לתגובות אלה, (ii) לקבוע הקבועים אנזימטית וביוכימיים (iii) להגדיר את התפקידים של קופנים או מעכבי שיכולים להשפיע על תגובות אלה, (iv) זיהוי ממשקי אינטראקציה, (v) לבחון את ההשפעה של מוטציות מלאכותיות או מחלות הקשורות ו (vi) ליצור תנאי שימוש שניתן להשתמש עוד כדי לפתח תפוקה גבוהה הקרנת ההקרנה הכימית. כאן, אנו מדגימה אלה מאמר על ידי תיאור כיצד אנו מבצעים BMI1/RING1B-בת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים לדיאנה אדז'נו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (2015-2020), הגנום קוויבק (2016-2019) ו הגנום קנדה (2016-2019) כדי E.B.A. E.B.A. הוא מלומד בכיר של כפות דה לה Recherche du קוויבק-סנטרה (FRQ-S). ל-L. M ו-N.S.K. יש מלגת דוקטורט מ-FRQ-S. ה. ב. הייתה מלגת דוקטורט מהמשרד להשכלה גבוהה וממחקר מדעי של תוניסיה וקרן קול.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חרוזי אגרוז עמילוז | ניו אינגלנד ביולאבס | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים 10K | סיגמא-אולדריץ' | #UFC501096 | |
| אנטי H2AK119ub (H2Aub) | טכנולוגיית איתות תאים | #8240 | |
| חרוזים נגד דגל-אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | #A4596 | |
| קוקטייל נגד פרוטאז | סיגמא-אולדריץ' | ||
| BL21 (DE3) טכנולוגיות אג'ילנט של חיידקי CodonPlus-RIL | #230240 | ||
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| עמודת כרומטוגרפיה ריקה | Biorad | #731-1550 | |
| פפטיד דגל | סיגמא-אולדריץ' | #F3290 | |
| חרוזי GSH-agarose | סיגמא-אולדריץ' | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| אימידזול | סיגמא-אולדריץ' | #I5513 | |
| נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase) | סיגמא-אולדריץ' | #N3755 | |
| חרוזי אגרוז Ni-NTA | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| מסנן מזרק נקבוביות 0.45 μ m | Sarstedt | # 83.1826 | |
| פוליאתילנימין (PEI) | Polysciences Inc | # 23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159) -BMi1 (1-109) | Addgene | # 63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
מקורות
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
