ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

סיכום

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

תקציר

ניטרציה חלבון היא אחת השינויים החשובים ביותר פוסט-translational (ptm) על שאריות טירוזין וזה יכול להיגרם על ידי פעולות כימיות של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו מינים חנקן תגובתי (rns) בתאי איקריוטית. זיהוי מדויק של אתרי ניטרציה על חלבונים הוא חיוני להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הקשורים לניטרציה חלבונים, כגון דלקת, הזדקנות וסרטן. מאז החלבונים הנידורגים הינם בעלי שפע נמוך בתאים, אפילו בתנאים המושרה, לא פותחו שיטות אוניברסליות ויעילות ליצירת פרופיל וזיהוי של אתרי חלבון נימזון. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה ניטרוניות באמצעות תגובת הפחתת כימית ותיוג ביוטין, ואחריו ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה. בשיטה שלנו, נגזרות של ניטרופפטיד יכול להיות מזוהה עם דיוק גבוה. השיטה שלנו מציגה שני יתרונות בהשוואה לשיטות שדווחו קודם לכן. ראשית, תיוג diמתיל משמש כדי לחסום את האמין העיקרי על ניטרופפטידים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור תוצאות כמותיים. שנית, קשר דיגואני המכיל את הגידול של מדיקל-ביוטין משמש להעשרה, שיכול להיות מופחת עוד יותר ואלשני כדי לשפר את אות הזיהוי על ספקטרומטר מסה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על מודל הפפטיד אנגיוטנסין II בעיתון הנוכחי.

מבוא

ניטרציה של שאריות טירולי בחלבונים לטופס 3-ניטרוטירולך מסדיר תהליכים ביולוגיים רבים. בשל התכונות הכימיות השונות בין טירולי ו 3-ניטרוטירולך, חלבון nitrated דורג יכול להיות מודאג הפעילות איתות^1,2. לכן, חשוב לפתח שיטות שיכולות להעשיר ולזהות אתרי ניטרציה על חלבונים ביעילות. כמו 3-ניטרוטירולך הוא שינוי שפע נמוך על חלבונים לעומת צורות אחרות של PTM, כגון זרחון ו מרחרחון, זה מאתגר לזהות אתרי נימזון אנדוגני ישירות מקווי התא או דגימות רקמות. עם זאת, המתודולוגיה של שימוש בספקטרומטר מסה (MS) כדי לאפיין את דפוס הפיצול של הנירוטפפטיד פותחה (למשל, Zhan &^שלושה), אשר מטילה את הבסיס עבור שיטות חדשות של ניטרונים.

כיום, צעד העשרה ולאחריו MS היא האסטרטגיה החזקה ביותר ליצירת פרופיל באמצעות ניטרופפטיד^4,5. ניתן לסווג את שיטות ההעשרה לשתי כיתות. מחלקה אחת מבוססת על נוגדנים שיכולים לזהות 3-ניטרוטירולי במיוחד, בעוד המחלקה האחרת מבוססת על הנגזרת הכימית שמפחית קבוצת ניטרו לקבוצת אמין^4,5. עבור השיטה המבוססת על נוגדן, העמודה זיקה של ניטרוטירולך משמשת להעשרה, שממנה החומר החומק נפתר ונותח ברזולוציה גבוהה MS^6,7. עבור השיטה המבוססת על נגזרת כימית, הקבוצות של האמין במסוף N-הטרמינוס של הפפטיד או ליזין צריכות להיות חסומות בשלב הראשון על-ידי מרחרחון, תגי איזואוריים לקוונטים יחסיים ומוחלטים (iTRAQ), או משני תגי המסה (מציון). בשלב הבא, כמפחית משמש כדי להקטין את הניטרוטירולטירואל ואחריו שינוי קבוצת האמין החדשה שהוקמה, הכוללת המרה של ביוטין ליזיט, המרת פפטיד sulphydryl, או סוגים אחרים של מערכות תיוג^{8,9, 10,11}. רוב הפרוטוקולים שהוקמו עד כה מבוססים על חלבונים מחוץ למבחנה, במקום חלבונים שאינם מדורגים באופן שורש.

במחקר הנוכחי, הליך שונה של הנגזרת הכימית של ניטרוטירולך מפותח עבור העשרה ניטרוגליצרין וזיהוי, אשר מראה רגישות מוגברת במהלך זיהוי MS והוא מתאים למטרת כימות. המחקר האחרון שלנו העסקת שיטה זו במערכות ביולוגיות זיהה כי ניטרציה של חלבון מסוים לימפוציטים טירולך קינאז (lck) ב Tyr394 על ידי rns המיוצרים מתאי מדכא מיאלואידית נגזר (MDSCs) ממלא תפקיד חשוב ב דיכוי חיסוני של מיקרואקולוגיה של הגידול¹². לכן, השיטה שלנו לזיהוי ניטרופפטיד יכולה להיות מוחלת גם על דגימות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש במודל מודל אנגיוטנסין II, אשר דפוס הפיצול ידועה בשימוש נרחב ב ניטרואומומית לימודי^8,9,10,¹¹, כדוגמה.

פרוטוקול

1. ניטרציה של אנגיוטנסין II

1. כדי ליצור פפטיד מדורגים, לדלל 10 μL של אנגיוטנסין II (DRVYIHPF) הפתרון ההורה (2 מ"מ במים) ב 390 μL PBS פתרון (10 מ"מ בלבד₂פו₄, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4) בריכוז הסופי של 50 μm.
2. הוסף 10 μL של הפראוקסיניטריט (200 מ"מ ב4.7% NaOH) לפתרון השני של אנגיוטנסין II כדי לבצע את הריכוז הסופי של הפראוקסיניטריט 5 מ"מ.
   הערה: פראוקסיניטריט הוא לא יציב וקל לפתור כאשר הוא בצורת חומצה, כך פתרון ההורה של הפראוקסיניטריט נשמר בפתרון בסיסי ומאוחסן ב-80 ° c.
3. להתאים את ערך ה-pH של הפתרון כדי 7-8 על ידי הHCl 1 M. כדי ליזום את תגובת הניטרציה, טלטל את הצינור ב 400 סל ד למשך 5 דקות.
4. השתמש בעמודת SPE מסחרית זמינה בשלב הפוך (ראה טבלת חומרים) עבור התפלה.
   1. הכן 2 פתרונות עבור התפלה, 5% מתנול במים לכביסה 80% מתנול במים עבור הימנעות.
   2. הוסף 500 μL של מתנול, ואחריו 500 μL של מים למצב מראש את העמודה, לשים 1 הצינורות mL עם הקצה על החלק העליון של הטור, לחצו על הצינורות כדי להאיץ את הזרימה.
   3. טעינת 410 μL של המדגם בשלב 1.3 בעמודה, למחוק את הזרימה.
   4. לאחר כביסה עם 500 μL של 5% מתנול, השתמש 300 μL של 80% מתנול כדי elute הניטרוגליצרין, אשר לאחר מכן מיובש באופן מלא על ידי מהירות vac בהגדרת ברירת המחדל בטמפרטורת החדר.
      הערה: התפלה חשוב מאוד עבור התגובות, מאז הממס השמאלי בשלב הקודם עשוי להיות השפעה שלילית על השלבים הבאים.

2. אלקיללציה של האמרינות הראשיות על ידי תיוג דימתיל

1. מהווים מחדש את אבקת ניטרו-אנגיוטנסין II ב 100 μL של 100 mM triethylammonium ביקרבונט (TEAB) פתרון.
   הערה: ערך ה-pH של הפתרון צריך להיות בין 7 ל -9, ולוודא שלא מוסיפים מאמין ראשי בפתרון.
2. הוסף 4 μL של 4% פורמלדהיד לפתרון, לערבב בקצרה.
   התראה: אדים פורמלדהיד רעילים; בצע את הניסויים בתוך מכסה המנוע.
3. הוסף 4 μL של 0.6 M NaBH₃CN לפתרון, לנער את הצינור ב 400 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
4. כיבוי תגובת תיוג על ידי הוספת 16 μL של 1% אמוניה פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
5. הוסף 8 μl של חומצה פורמית כדי לacidify את הפתרון ולבצע התפלה באמצעות הפוך בשלב היפוך SPE כמתואר בשלב 1.4.

3. צמצום הניטרוגליצרין לעמינח

1. מרכיבים מחדש את הדימתיל המסומן ניטרו-אנגיוטנסין II ב 500 μL של PBS (10 מ"מ בלבד₂PO₄, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4).
2. הוסף 10 μL של 1 M נתרן dithionate לפתרון ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h. לאחר התגובה הפחתת, הצבע הצהוב של הפתרון הופך ברור.
   הערה: שוקל 174.1 מ"ג נתרן dithionate ולפזר אותו במים כדי להפוך את הנפח הסופי הוא 1 mL. ניתן לאחסן פתרון זה ב-20 ° c לא יותר משבוע.
3. השתמש בעמודת ה-SPE של השלב ההפוך עבור התפלה כמתואר בשלב 1.4.

4. ביוטילציה, העשרה וגילוי

1. מרכיבים מחדש את הדימתיל מתויג האמינו אנגיוטנסין II ב 500 μL של PBS (10 מ"מ בלבד₂PO₄, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4).
2. הוסף 5 μL של 40 nM-S-s-biotin, הומס ב DMSO, לפתרון, אחרי 2 h דגירה בטמפרטורת החדר, השתמש 1 μL של 5% הידרוקסילטין כדי להרוות את התגובה.
3. בינתיים, מחרוזת streptavidin agarose חרוזים על ידי הוספת 500 μL של PBS (10 מ"מ מילימטר₂PO₄, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4), תפרידו ב 580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ומחיקת supernatant. בצע את הequiציה 3 פעמים.
4. הוסף 100 μL streptavidin agarose חרוזים אל מערכת התגובה, הדגירה 1 h על שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר. שטוף 4 פעמים עם PBS (10 מ"מ בלבד₂PO₄, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4). עבור כל צעד כביסה, להוסיף 500 μL של PBS אל החרוזים, לערבב היטב, אז צנטריפוגה ב 580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
5. השתמש ב-400 μL של 10 מ"מ dithio, (DTT) כדי לסקול את החרוזים ב-50 ° c עבור 45 דקות, ספין למטה ב-580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את החרוזים, להוסיף 20 μl של 0.5 M האירחאמיד (יאם) על supernatant עבור 20 דקות בחשיכה
   הערה: dtt משמש כדי לשבור את הקשר הדיגופרתי בין הקישור של ביוטין ו פפטיד, האחרון משוחרר מחרוזים ועוד האלח על ידי יאם.
6. השתמש בעמודת SPE של שלב הפוך עבור התפלה המוצגת בשלב 1.4.
7. לאחר פתרון פפטידים יבשים ב 20 μl של 0.1% החומצה פורמית (הפא), הנושא את המוצר של כל קטע לתוך כרומטוגרפיה נוזלית עם טנדם המסה (LC-ms/MS) ניתוח.
   1. להפריד את הפפטידים אנג II שונה על ידי הימנעות 60 דקות הדרגתי (0-8 דקות, 2% ב; 8-10 דקות, 5% b; 10-35 דקות, 18% b; 35-50 דקות, 28% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 דקות, 2% b) בקצב זרימה 0.300 μl/min עם מערכת ננו-מערכות ה מתמודד ישירות עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
      הערה: הטור האנליטי הוא 75 יקרומטר ID, 150 מ"מ אורך, גדוש עם שרף C-18. השלב הנייד A מורכב 0.1% פורמית חומצה, ו השלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% פורמית חומצה.
   2. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי-נתונים, קבע ספקטרום מלא של סריקה מלאה (300-1800 m/z, 60 000 רזולוציה) ואחריו 20 מערכת ההפעלה של MS/MS תלויי נתונים ב -28% אנרגיית התנגשות מנורמלת.
   3. פתח נתונים ספקטרום מסה ולזהות את הפסגות של המוצר בכל שלב כדי לאשר את התגובה הכימית בוצעה בהצלחה.

5. קוונפיקציה של ניטרוגליצרין

1. הכן 3 סטים של פתרונות ניטרו-Angiotensin II משלב 1.4, כל ערכה המכילה 2 ריכוזים של ניטרו-אנגיוטנסין II: להגדיר1, 20 nmol ב צינור A ו 20 nmol ב צינור B, כל אחד 100 μl TEAB פתרון; הגדר2, 10 nmol ב צינור C ו 20 nmol בצינור D, כל אחד ב100 μl TEAB פתרון; Set3, 40 nmol ב צינור E ו 10 nmol ב צינור F, כל אחד 100 μl TEAB פתרון.
   הערה: שני הריכוזים של ניטרו-Angiotensin II בכל ערכה משמשים עבור תיוג diמתיל, כדי להגיב עם פורמלדהיד (אור) ו-פורמלדהיד-D2 (כבד), בהתאמה.
2. עבור כל ערכה, להוסיף 4 μL של 4% פורמלדהיד ו-פורמלדהיד-D2 למדגם להיות מתויג כמו אור וכבד, בהתאמה. בצע את השלבים 2.3 כדי 2.5 כדי לסיים תיוג diמתיל.
3. ערבב את הדגימות האור והתוויות הכבדות.
4. בצע את השלבים מ 3.1 עד 4.6 עבור הפחתת, biotinylation, העשרה, ואיתור.

תוצאות

תרשים הזרימה ליצירת פרופיל ניטרוגליצרין בכתב יד זה מוצג באיור 1. איור 2, 3, 4 ו- 5 מציגים את הספקטרום ההמוני של אנגיוטנסין ii, ניטרו-אנגיוטנסין Ii, דימתיל-אנגיוטסין ii ו דימתיל, המסומנים בשני אנגיוטנסין, בהתאמה. המשקל המולקולרי של התרכובת יכול להיות משתקף על ידי ערכי m/z של הפסגה מונו-איזוטופ בכל דמות, המציינת את השינוי הכימי של אנגיוטנסין II הושג בהצלחה עבור כל שלב. איור 6 מציג את ...

דיון

הפרוטוקול מתאר את ההעשרה. והפרופיל של הניטרוגליצרין השימוש באנגיוטנסין II כפפטיד מודל, אנו מומחש את ההליך המוצג באיור 1. לאחר קבלת ניטרו-Angiotensin II, האמין העיקרי על פפטיד צריך להיות חסום כדי למנוע את הקוניוגאמין נוסף, שהוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. בפרוטוקול הנוכחי, תיוג דימתיל משמש לחסימת האמרינות העיקריות משתי סיבות: הראשונה, היא מאפשרת רכישת תוצאות כמותיים; שנית, העלות עבור תגובה זו נמוכה יותר מאשר התגובה מבוססת, היעילות החוסמת הוא גבוה¹³. עבור כימות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שבחים pepmap 100 C18 עמוד	תרמו-פישר	164534
1 M תמיסת TEAB	סיגמא-אולדריץ'	T7408
50% הידרוקסילמין	תרמו-פישר	90115
אצטוניטריל	תרמו-פישר	A955	MS
כיתה דיתיותרייטול	סיגמא-אולדריץ'	43819
פורמלדהיד	Sigma-Aldrich	F8775	ביולוגיה מולקולרית כיתה
פורמלדהיד-D2	טורונטו כימיקלים מחקריים	F691353
חומצה פורמית	סיגמא-אולדריץ'		695076 מגיב ACS
היתוך Lumos ספקטרומטר מסה	תרמו
איזואצטמיד	סיגמא-אולדריץ'	I1149
מתנול	תרמו-פישר	A456	MS Grade
NHS-S-bition	Thermo-Fisher	21441
אואזיס HLB עמודה (10 מ"ג)	מים	186000383
פרוקסיניטריט	Merck-Millipore	516620
נתרן ציאנובורוהידריט	סיגמא-אולדריץ'	42077	PhamaGrade
נתרן דיתיונאט	סיגמא-אולדריץ'	157953	כיתה טכנית
סטרפטווידין ספרוז	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo