מאמר שיטה

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

DOI:

10.3791/59391

⸱

16 ביוני 2019

 ,  , 
1Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 3Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 4Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, 5Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, 6Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטרציה חלבון היא אחת השינויים החשובים ביותר פוסט-translational (ptm) על שאריות טירוזין וזה יכול להיגרם על ידי פעולות כימיות של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו מינים חנקן תגובתי (rns) בתאי איקריוטית. זיהוי מדויק של אתרי ניטרציה על חלבונים הוא חיוני להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הקשורים לניטרציה חלבונים, כגון דלקת, הזדקנות וסרטן. מאז החלבונים הנידורגים הינם בעלי שפע נמוך בתאים, אפילו בתנאים המושרה, לא פותחו שיטות אוניברסליות ויעילות ליצירת פרופיל וזיהוי של אתרי חלבון נימזון. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה ניטרוניות באמצעות תגובת הפחתת כימית ותיוג ביוטין, ואחריו ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה. בשיטה שלנו, נגזרות של ניטרופפטיד יכול להיות מזוהה עם דיוק גבוה. השיטה שלנו מציגה שני יתרונות בהשוואה לשיטות שדווחו קודם לכן. ראשית, תיוג diמתיל משמש כדי לחסום את האמין העיקרי על ניטרופפטידים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור תוצאות כמותיים. שנית, קשר דיגואני המכיל את הגידול של מדיקל-ביוטין משמש להעשרה, שיכול להיות מופחת עוד יותר ואלשני כדי לשפר את אות הזיהוי על ספקטרומטר מסה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על מודל הפפטיד אנגיוטנסין II בעיתון הנוכחי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטרציה של שאריות טירולי בחלבונים לטופס 3-ניטרוטירולך מסדיר תהליכים ביולוגיים רבים. בשל התכונות הכימיות השונות בין טירולי ו 3-ניטרוטירולך, חלבון nitrated דורג יכול להיות מודאג הפעילות איתות1,2. לכן, חשוב לפתח שיטות שיכולות להעשיר ולזהות אתרי ניטרציה על חלבונים ביעילות. כמו 3-ניטרוטירולך הוא שינוי שפע נמוך על חלבונים לעומת צורות אחרות של PTM, כגון זרחון ו מרחרחון, זה מאתגר לזהות אתרי נימזון אנדוגני ישירות מקווי התא או דגימות רקמות. עם זאת, המתודולוגיה של שימוש בספקטרומטר מסה (MS) כדי לאפיין את דפוס הפיצול של הנירוטפפטיד פותחה (למשל, Zhan &שלושה), אשר מטילה את הבסיס עבור שיטות חדשות של ני....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניטרציה של אנגיוטנסין II

  1. כדי ליצור פפטיד מדורגים, לדלל 10 μL של אנגיוטנסין II (DRVYIHPF) הפתרון ההורה (2 מ"מ במים) ב 390 μL PBS פתרון (10 מ"מ בלבד2פו4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4) בריכוז הסופי של 50 μm.
  2. הוסף 10 μL של הפראוקסיניטריט (200 מ"מ ב4.7% NaOH) לפתרון השני של אנגיוטנסין II כדי לבצע את הריכוז הסופי של הפראוקסיניטריט 5 מ"מ.
    הערה: פראוקסיניטריט הוא לא יציב וקל לפתור כאשר הוא בצורת חומצה, כך פתרון ההורה של הפראוקסיניטריט נשמר בפתרון בסיסי ומאוחסן ב-80 ° c.
  3. להתאים את ערך ה-pH של הפתרון כדי 7-8 על ידי הHCl 1 M. כדי ליזום את תגובת הניטרציה, טלטל את הצינור ב 400 סל ד למשך 5 דקות.
  4. השתמש בעמודת SPE מסחרית זמי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים הזרימה ליצירת פרופיל ניטרוגליצרין בכתב יד זה מוצג באיור 1. איור 2, 3, 4 ו- 5 מציגים את הספקטרום ההמוני של אנגיוטנסין ii, ניטרו-אנגיוטנסין Ii, דימתיל-אנגיוטסין ii ו דימתיל, המסומנים בשני אנגיוטנסין, בהתאמה. המשקל המולקולרי של התרכובת יכול להיות משתקף על ידי ערכי m/z של הפסגה מונו-איזוטופ בכל דמות, המציינת את השינוי הכימי של אנגיוטנסין II הושג בהצלחה עבור כל שלב. איור 6 מציג את .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר את ההעשרה. והפרופיל של הניטרוגליצרין השימוש באנגיוטנסין II כפפטיד מודל, אנו מומחש את ההליך המוצג באיור 1. לאחר קבלת ניטרו-Angiotensin II, האמין העיקרי על פפטיד צריך להיות חסום כדי למנוע את הקוניוגאמין נוסף, שהוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. בפרוטוקול הנוכחי, תיוג דימתיל משמש לחסימת האמרינות העיקריות משתי סיבות: הראשונה, היא מאפשרת רכישת תוצאות כמותיים; שנית, העלות עבור תגובה זו נמוכה יותר מאשר התגובה מבוססת, היעילות החוסמת הוא גבוה13. עבור כימות.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית לחקר הסרטן מוסדיים IRG-14-195-01 (מ. שרון מחסנית הוא חוקר ראשי; X.L. הוא חוקר נמענים משנה). פרסום זה התאפשר עם תמיכה חלקית מתוך גרנט מספרים KL2 TR002530 ו UL1 TR002529 (א. שחאר, PI) מן המכונים הלאומיים לבריאות, המרכז הלאומי לקידום מדעי העבר, פרס קליני וטרנסלטיל מדעים. X L. הוא המקבל של אינדיאנה KL2 החוקר הצעיר פרס. ס. פ. נתמך על ידי וולטר סרטן הקרן קידום מענקים בסיסיים בסרטן. X. W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין התוכנית הכללית (גרנט No. 817773047).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שבחים pepmap 100 C18 עמודתרמו-פישר164534
1 M תמיסת TEABסיגמא-אולדריץ'T7408
50% הידרוקסילמיןתרמו-פישר90115
אצטוניטרילתרמו-פישרA955MS
כיתה דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'43819
פורמלדהידSigma-AldrichF8775ביולוגיה מולקולרית כיתה
פורמלדהיד-D2טורונטו כימיקלים מחקרייםF691353
חומצה פורמיתסיגמא-אולדריץ'695076 מגיב ACS
היתוך Lumos ספקטרומטר מסהתרמו
איזואצטמידסיגמא-אולדריץ'I1149
מתנולתרמו-פישרA456MS Grade
NHS-S-bitionThermo-Fisher21441
אואזיס HLB עמודה (10 מ"ג)מים186000383
פרוקסיניטריטMerck-Millipore516620
נתרן ציאנובורוהידריטסיגמא-אולדריץ'42077PhamaGrade
נתרן דיתיונאטסיגמא-אולדריץ'157953כיתה טכנית
סטרפטווידין ספרוזGE HealcareGE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLCThermo

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Pr....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים