מאמר שיטה

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

DOI:

10.3791/59398

⸱

2 במאי 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitophagy הוא מסלול חיוני בקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר חיוני עבור התא ביתא איון הלבלב ביואנרגיה כדי דלק מגורה ממריצים אינסולין שחרור. הערכה של mitophagy הוא מאתגר ולעתים קרובות דורש כתבים גנטיים או טכניקות משלימים מרובים לא מנוצל בקלות בדגימות רקמות, כגון איואי הלבלב האנושי העיקרי. כאן אנו להפגין גישה חזקה כדי להמחיש ומכמת היווצרות של מתחמי מפתח אנדוגניים מרכזיים באיים הלבלב האנושי העיקרי. ניצול הקירבה רגישות לסדר שיטת החיבור כדי לזהות אינטראקציה של הרגולטורים mitophagy NRDP1 ו USP8, אנחנו מסוגלים במיוחד לכמת היווצרות מתחמי mitophagy חיוניים באתרו. על-ידי צימוד גישה זו כדי להכתים את גורם התמלול PDX1, אנחנו יכולים לכמת את מתחמי mitophagy, ואת הגורמים שיכולים לפגוע mitophagy, במיוחד בתוך תאי בטא. המתודולוגיה שאנו מתארים מתגבר על הצורך בכמויות גדולות של תמציות הסלולר הנדרשות למחקרים של חלבון-חלבון אחרים, כגון immunoprecipitation (IP) או ספקטרומטר מסה, והוא אידיאלי לדגימות של איון אנושי יקרות בדרך כלל לא זמינים בכמויות מספיקות עבור גישות אלה. יתרה מזאת, מתודולוגיה זו בדקה את הצורך בטכניקות מיון זרימה כדי לטהר את תאי הבטא מאוכלוסיית איון הטרוגנית עבור יישומי החלבון במורד הזרם. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול רב ערך עבור ויזואליזציה של mitophagy תואם מאוד לשימוש באוכלוסיות תאים הטרוגנית ומוגבלת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים ביתא הלבלב לייצר את האינסולין הנדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז נורמלי, וכישלון שלהם תוצאות בפיתוח של כל צורות הסוכרת. תאי בטא שומרים על קיבולת מיטוכונדריאלי חזקה כדי ליצור את האנרגיה הדרושה לחילוף החומרים של גלוקוז עם שחרור אינסולין. לאחרונה, זה התברר כי התחזוקה של מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי היא בעלת חשיבות מרכזית עבור הפונקציה האופטימלית של תא ביתא1,2,3. על מנת לקיים מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי, תאי בטא להסתמך על מנגנוני בקרת איכות כדי להסיר תפקוד, פגום, או הזדקנות המיטוa4. אנחנו ואחרים הוכיחו בעבר כי תאים ביתא להסתמך על צורה מיוחדת של מחזור מיטוכונדריאלי, הנקרא הוראות מיטוכונדריאלי (או mitophagy), כדי לשמור על איכות מיטוכונדריאלי בקרת מכרסמים והאדם האנושי1, 2,5. למרבה הצער, עם זאת, לא היתה שיטה פשוטה כדי לזהות mitophagy, או באופן מידי הביע רכיבים mitophagy, בתאי בטא הלבלב האנושי.

לאחרונה הראינו כי במעלה הזרם של mitophagy בתאי ביתא מסתמך על היווצרות של מתחם חלבון הכולל את E3 ליגסים CLEC16A ו NRDP1 והוא USP81. NRDP1 ו USP8 הוכחו באופן עצמאי להשפיע mitophagy באמצעות פעולה על מפתח מיאופלגיה מיזם parkin6,7. NRDP1 מטרות PARKIN עבור אוביקווינציה והשפלה כדי לכבות את mitophagy6, ו USP8 במיוחד באופן בלתי מקושר K6-parkin לקדם את הטרנסלוקציה שלה כדי המיטומטר7. שיטת החיבור הצמוד (PLA) הטכנולוגיה היתה מקדמה לאחרונה בתחום של אינטראקציה חלבון ביולוגיה8, המאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות חלבונים אנדוגניים באתרו תאים בודדים, והוא אינו מוגבל על ידי חומר לדוגמה נדירים. מתודולוגיה זו מפתה במיוחד לביולוגיה של האדם/תא ביתא, בשל הספניות של זמינות המדגם, ביחד לצורך הבנת מתחמי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בתוך סוגי תאים הטרוגנית.

ניצול הגישה PLA, אנחנו מסוגלים להתבונן מרכזי מפתח אנדוגניים מתחמי בתאי בטא הלבלב האנושי העיקרי וקווי התאים עצביים, ולהדגים את ההשפעות של סביבה diabetogenic על מסלול מיטואופג'י1. לסיכום, מטרת היסוד של פרוטוקול זה היא לנתח מתחמי חלבון mitophagy ספציפיים ברקמות חסר חומר שופע, או כאשר מחקרים קונבנציונאלי-חלבון האינטראקציה אינם אפשריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של האדם תורם דה מזוהה הלבלב האנושי הוא באמצעות הלוח סקירה מוסדית (IRB) פטור ובהתאם למדיניות האוניברסיטה של מישיגן IRB. איונים הלבלב האנושי סופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון/NIDDK של משולב הפצת האיים (IIDP).

1. הכנה לדוגמא של האדם איון

  1. דיסוציאציה של תא בודד
    1. התרבות בדגימות איון האנושי (4000 – 6000 איון שווי/10 mL מדיה) עבור לפחות 1 יום ב 37 ° c ב הלבלב איון מדיה (PIM (S)) מדיה בתוספת גלוטמין 1 מ"מ (PIM (G)), 100 יחידות/mL antimycotic-אנטיביוטי, 1 מ"מ נתרן פירובט ו 10% העובר עוברי סרום (FBS) או סרום AB אנושי.
    2. השתמש במיקרוסקופ אור לנתיחה בהגדלה של 3x כדי לספור איונים אנושיים בודדים מהתרבות. לאסוף 40 איונים לכל טיפול/מצב של עניין (כגון רעילות msm ליפו, לתוך 1.5 מ ל צינורות במדיה איון.
    3. האיים צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב 10 ° c כדי משקעים.
    4. לשטוף דגימות, על ידי היפוך קצר של צינורות בטמפרטורת החדר, פעמיים עם 1 mL פוספט באגירה מלוחים (PBS) המכיל 50 μM PR619 (מעכב דאויקוויאיאז; כדי לשמר אוביקוויטים התלויים אינטראקציות חלבון), עם צנטריפוגה בין כל לשטוף ב 400 x g עבור 1 דקות ב-10 ° c.
    5. הנתק איים לתוך תאים בודדים עם 125 μL של 0.25% טריפסין המכיל 50 μM PR619 על ידי הדגירה הקדם-שחומם (37 ° c) עבור 3 דקות עם כדורי איון. בעדינות לפזר איונים במהלך הזמן הזה עם ליטוף עדין תקופתי באמצעות 200 μL פיפטה.
    6. כיבוי טריפסין עם 1 mL מחומם (37 ° צ') PIM (S) מדיה המכילה 50 μM PR619, ואז תאים משקעים על ידי תפרידו ב 400 x g עבור 1 דקות.
    7. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות, פעמיים, עם PBS + 50 ΜM PR619.
    8. בסופו של דבר, השעיית תאים מחדש ב-150 μL PBS המכיל 50 μM PR619.
  2. הדבקות וקיבוע תאים בודדים
    1. לאחר השעיה מחדש, לסובב את הפתרון התא על מזוגג, טעונה, שקופיות מיקרוסקופ באמצעות ציטוצנטריפוגה ב 28 x g עבור 10 דקות.
    2. לאחר cytocentrifugation, לתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי (לראות את הטבלה של חומרים) כדי למזער את אמצעי האחסון נוגדן/משחק לפתרון הדרוש. תקן תאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.
    3. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע כתמים/מפלה מיד, או בתוך 24 h. במקרה הצורך, יש לאחסן דגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לצביעת לא יותר מ-48 h.

2. אימונוהיסטוכימיה

  1. חסימת
    1. שטוף את התאים פעמיים ב-1x PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. תא לחסום פתרון, כדי למנוע כתמים ברקע, עם 10% החמור סרום ב-PBS המכיל 0.3% ניקוי (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  2. צביעת
    1. מודלת תאים עם העכבר הראשי או נוגדנים הארנב נגד USP8 (1:250) ו NRDP1 (1:250) בהתאמה (לראות את הטבלה של חומרים) מדולל מלוחים באגירה פוספט עם אבקת (pbt, ראה לוח חומרים), ב 4 ° c לילה, כדי ל זיהוי מתחם מיטלהגיה איתות באמצעות PLA.
    2. שיתוף בתאי התאים עם סמן ספציפי עבור זיהוי תא ביתא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע לאות PLA. במקרה זה התאים האלה לדגירה עם PDX1 נגד עז (1:500) ב PBT. מודטה את כל הנוגדנים העיקריים לילה ב 4 ° c, באמצעות הסרט פלסטיק על גבי הפתרון כדי למנוע אידוי.

3. שיטת היטל קירבה

  1. בדיקה וכתמים של משחק הנגד
    1. להכין את הפתרון בדיקה PLA על פי הוראות היצרן, כלומר, לעשות 20 μL של פתרון בדיקה לכל מדגם על ידי הכנת ריכוז סופי של 1:5 פתרון של שניהם נגד העכבר ואנטי ארנב פתרון בדיקה PBT, ו דגירה עבור 20 דקות בחדר טמפרטורה.
    2. לאחר הדגירה לילה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.
    3. ממש לפני דגירה עם פתרון בדיקה, להוסיף אנטי עז Cy5 משני בריכוז הסופי של 1:600 לפתרון בדיקה (לזיהוי של אנדוגניים PDX1). הוסף 20 μL פתרון בדיקה לכל תנאי תא, לכסות בעדינות עם הסרט פלסטיק ו דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
  2. צדו
    1. לשטוף את התאים פעמיים, בטמפרטורת החדר, עם מאגר A (לראות את הטבלה של חומרים עבור המתכון) עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.
    2. הכינו פתרון לחלקים (חלק מריאגנטים האיתור, ראו טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן. בשביל זה, לדלל את המניה (5x) 1:5 ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים מטופלים. מיד לפני הדגירה להוסיף 0.025 U/mL ligase. הוסף 20 פתרון הנוגע לתאי μL לתאים. כיסוי עם הסרט פלסטיק ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות.
  3. גברה
    1. שטוף את התאים פעמיים בטמפרטורת החדר עם מאגר A עבור 2 דקות כל אחד.
    2. להפוך פתרון הגברה (חלק של ריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן. לדלל מאגר הגברה (5x) 1:5 ב DEPC מטופלים מים ולשמור בחושך עד השימוש. הוסף דילול 1:80 של פולימראז (חלק מהריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) לפתרון מיד לפני הוספת הפתרון לתאים.
    3. הוסף 20 μL של פתרון הגברה לתאים. כיסוי עם סרט פלסטיק ומקום בחושך ב 37 ° c עבור בין 1 h 40 דקות עד 2 h עבור אות מקסימלית.
  4. הכנה להדמיה
    1. לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר B (לראות את הטבלה של חומרים למתכון) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, על הנדנדה.
    2. לבסוף, לשטוף את התאים פעם אחת 0.01 x מאגר B, עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
    3. מעלה דגימות על ידי הוספת טיפה של מדיה הרכבה המכיל 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ובזהירות הצבת שמיכות מעל דגימות באמצעות להב אזמל ללחוץ על כל בועות שנוצרו. חותם שמיכות באמצעות לק ברור ציפורניים סביב הקצוות.
    4. דגימות תמונה על מיקרוסקופ מסוגל ללכוד מטוסי מיקוד מרובים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד לייזר, או מיקרוסקופ הפוכה הפוך עם יכולות פירוק, נטילת לפחות 9 מטוס מוקד שונים תמונות.
      1. לכידת תמונות בהגדלה של 100x, עם גובה של כ-0.45 מ"מ מחסנית z. לכידת PLA ב 550 הריגוש nm, 570 פליטת nm; נגד כתמים ב 650 הריגוש nm, 670 פליטת nm; ו DAPI ב 405 הריגוש nm, 450 פליטת nm.
    5. כדי להבטיח אותות הרקע של התמונה הפלואורסצנטית ואת האור התועה הם ממוזערים עבור ניתוח במורד הזרם של אירועי PLA (במיוחד על מיקרוסקופים שטח), עיבוד תמונות באמצעות אלגוריתם דו-מימדי (השכן הקרוב) דרך מ תוכנה סטנדרטית לעיבוד תמונה של בחירה.
      הערה: לשימוש האולימפוס CellSens, ניקון להשתמש באלמנטים שקלים, לייקה להשתמש לאס X, Zeiss-זן, התמרה, MATLAB, הויגנס תוכנה, כמו גם תוספים מספר זמין דרך תמונה-J. לצורך ניתוח, יש לנתח את המספר הכולל של אינטראקציות בכל ערימות ה-z באמצעות תוכנת Image-J, ולהבטיח שרק תאים חיוביים של Pdx-1 ינותחו (סעיף 3.5).
  5. קוונפיקציה של אינטראקציות PLA
    1. פתח את יישום התוכנה חינם Image-J ופתח את תמונת ה-PLA. התחל מהתמונה החדה הראשונה בפוקוס PLA.
    2. לחצו על הכרטיסייה ' תמונה ' ובחרו ' התאם ', ולאחר מכן לסף ( איור 1a). כוונן את הסף כדי להסיר את כל אות ה-PLA שאינו ספציפי, רשום את התאמת הסף ונסה לשמור על עקביות במהלך הניתוח.
    3. לחץ על הכרטיסיה תהליך ובחר בינארי ולאחר מכן הפוך לבינארי ( איור 1b). השתמש בתמונה הבינארית כדי למדוד חלקיקים, על-ידי לחיצה על הכרטיסייה "ניתוח" והקשה על החלקיקים (איור 1c).
    4. לצורך ניתוח ודא שההגדרות הן כדלקמן: Size = 0 – אינסוף, מעגליות = 0 – 1.0, הצג = קווי מתאר, תיבות סימון עבור תוצאות תצוגה ותוצאות ברורות (איור 1d). לחץ על אישור. רשום לפניך את מספר החלקיקים שנותחו בדוגמה של גיליון אלקטרוני ומיקום מחסנית z.
    5. חזור על שלבים 3.5.2 – ה3.5.4 עד לבדיקה של כל ה-z-מיקוד של המדגם. סכם את מספר החלקיקים הכולל עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת מספר כולל של אינטראקציות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערכנו ניסויים הראשונית קו הלבלב MIN6 ביתא תא ואת SH-SY5Y ונוירובלסטומה חוט התא SH-SY5Y, כדי למטב ולאשר הן ספציפיות של הנוגדנים ואת אינטראקציות החלבון דמיינו. MIN6 תאים היו מצופים שמיכות ב 30,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 48 h, SH-SY5Y תאים היו מצופים שמיכות ב 15,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 24 h. לאחר מכן הפרוטוקול PLA התחיל לעיל, החל משלב 1.2.3. כדי להבטיח את הספציפיות של אותות PLA, אנו הראשון ביצע גישה זו בנוכחות של (אני) אין נוגדן ראשי (איור 2A,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים גישה פשוטה ויעילה לשימוש NRDP1: USP8 PLA ברקמות/תאים של עניין היווצרות מכמת של מכלולי mitophagy במעלה. בעבר אישרו את היווצרות של מורכבות CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy בתאי ביתא הלבלב על ידי כמה מתודולוגיות, כולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים, תא ללא אינטראקציה לימודי, וחוץ גופית, כמו גם תא מבוסס והפגינו כיצד מורכב זה כוננים מורכבים השטף מיטואני מוסדר1,15. לימודי ה-PLA שאנו מדווחים ומתארים כאן מאפשרים תצוגה מהירה, כמותית, ומיוחדת לתא של מסלול mit...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בתמיכת JDRF (CDA-2016-189 וסרה-2018-539), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK-108921), משפחת Brehm, ומשפחת אנטוני. פרס לפיתוח קריירה JDRF ל-S.A.S. נתמך בחלקו על ידי האקדמיה לסוכרת דנית, אשר נתמכת על ידי קרן נובו Nordisk.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTA 1XLife Technologies25200-056
טכנולוגיות חיים אנטיביוטיות-אנטימיקוטיות15240-062
תמיסת בלוקביתי1X PBS, הוסף 10% סרום חמור ו-0.3% חומר ניקוי טריטון X-100.
חוצץA תוצרת ביתלהכנת 1 ליטר: מערבבים 8.8 גרם NaCl, 1.2 גרם בסיס Tris, 500ul Tween-20, עם 750 מ"ל ddH20. pH עד 7.5 עם HCl, וממלאים עד 1 ליטר. מסננים ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס. מביאים ל-RT לפני השימוש הניסיוני
Buffer Bתוצרת ביתלהכנת 1 ליטר: מערבבים 5.84 גרם NaCl, 4.24 גרם בסיס Tris, 26 גרם Tris-HCl עם 500 מ"ל ddH20. pH עד 7.5, וממלאים ל-1 ליטר. סנן תמיסת ואחסן 4C. הביאו ל-RT לפני השימוש הניסיוני
AffiniPure donkey מצומד נגד עזיםJackson Labs705-175-147
ריאגנטים לזיהויRed Sigma- AldrichDU092008-100RXNערכה המכילה: מלאי תמיסת קשירה (5X), ליגאז, מלאי תמיסת הגברה (5X) ופולימראז.
DuoLink PLA בדיקה נגד עכבר MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA בדיקה נגד ארנב PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
סרום
עיזים פוליקלונלי אנטי-PDX1 (שיבוט A17)סנטה קרוזSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
קו תאי לבלב MIN6מתנה מ- D. Stoffersקו תאי אינסולינומה של עכבר, המשמש לבדיקות מבוססות תאים.
נוגדן חד-שבטי נגד USP8 של עכבר (שיבוט US872)Sigma-AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
Parafilmהשתמש כדי לאטום נוגדנים ולבדוק תמיסות על התאים שלך כדי למנוע אידוי בעת שימוש בנפחי תמיסה קטנים.
PBT (תמיסת מלח חוצצת פוספט עם טריטון)תוצרת ביתלהכנת 50 מ"ל: 43.5 מ"ל LddH2O, 5 מ"ל 10X PBS, 0.5 מ"ל 10X BSA (תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל 10% טריטון X-100 תמיסת ddH20)
פניצילין-סטרפטומיצין (100X)Life Technologies15140-122
תמיסת מלח חוצצת פוספט, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) סרום AB אנושיProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (גלוטמין)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) מדיהProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold antifade Reagent עם DAPILife Technologies (בדיקות מולקולריות)P36935
ארנב פוליקלונלי אנטי-FLRF / RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
תאי SH-SY5Yמתנה מקותאי נוירובלסטומה אנושית L. Satin, המשמש לבדיקות מבוססות תאים.
נתרן פירובט (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
מים לעבודת RNA (DEPC מים)Fisher ScientificBP361-1L
לשימוש בקר עוברי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NRDP1 USP8PDX1CytospinImageJ

מאמרים קשורים