יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

אפיון כמותי של מוצרי חלבון חיוני יותר ויותר כאמצעי בקרת איכות (QC), שניהם למטרות רגולציה בענף ביולוגיות וכדי להבטיח את אמינות ויושרה של מדעי החיים מחקר^{1 , 2}. כפי שמתואר על האתרים של חלבונים רשתות ייצור החלבון ושותפות טיהור ב אירופה (P4EU), איגוד של משאבים עבור מחקר Biophysical באירופה, ביופיסיקה מולקולרית באירופה (ארברה-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ו- https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, בהתאמה), חלבון QC יש לאפיין לא רק את הטוהר של המוצר הסופי, אבל מצבו oligomeric גם, הומוגניות, זהות. קונפורמציה, מבנה, שינויים posttranslational ואחרים מאפיינים^3,4.

אחת השיטות הנפוצות ביותר של אפיון QC היא שניה-MALS. בשיטה זו, טור שניה אנליטי רתומה MALS, גלאי spectrophotometric, refractometric, המאפשרים מדידות מדויקות של המסה טוחנת חלבון של כל שיא⁵ שניה-MALS קובע את המסה טוחנת פסגות eluted ללא תלות • תנאי האחסון, מתגבר על אי-הדיוק של ה-SEC אנליטי באמצעות כיול עמודה. התוספת של מודול דינאמי (DLS) אור-פיזור מוסיף יכולת המדידה בגודל המאפשר קביעת הרדיוס hydrodynamic. במחקר אקדמי, שניה-MALS משמש בדרך כלל כדי לקבוע את מצב oligomeric של חלבון, קונפורמציה שלה, הרמה של טוהר, ברמה של צבירת, וחלבונים שונה, כגון glycoproteins או solubilized-השומנים קרום חלבונים (לקבוע המסה טוחנת של חלבון ו נזווג את הרכיבים בנפרד)^6,7,8.

במקרים רבים, החלבון הסופי של תהליך טיהור אינו זן מולקולרית טוב-defined אך מעדיף כוללת כמה הטרוגניות. החלבונים בתערובת כאלה יכולים להיות מגוונים מבחינת מבנה (לדוגמה, oligomeric בצורות שונות), הייצורים החיים, או חלבון איזופורמים. החלבון הזה יכול להיות גם תוצאה של הבדלים משניים כימי הנגרם על ידי עיבוד ליזין C-מסוף או דיאמינציה אספרגין/גלוטמין, מובילים להאשים וריאציה^9,10. הבדלים posttranslational שינויים כגון גליקוזילציה יכול גם להוביל דגימות הטרוגנית עם תשלום וריאציות⁹. אלה סוגים שונים של הטרוגניות משתקפים מאפיינים ביופיזיקלי של החלבון, יכולים להשפיע על יציבות, פעילות ביולוגית של חלבון המטרה¹¹.

בקרת איכות אמינים מבחני דוגמאות כאלה הטרוגנית דורשים טכניקה מאוד resolutive ההפרדה האנליטית. ישנם מקרים שבהם ניתן לערער הפרדה טובה להשיג עם עמודות שניה אנליטית, עקב שלהם מוגבל רזולוציה והפרדה היכולות¹², וכתוצאה מכך ניתוח שניה-MALS פגום. שילוב של טכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים כגון IEX עם MALS ניתן להתגבר על המגבלה של שניה-MALS בדגימות הטרוגנית, מספקות שיטה משלימה איפיון חלבונים (טבלה 1 Amartely et al.¹²). בניגוד שניה, המפריד בין מקרומולקולות מאת שלהם גודל hydrodynamic¹³, IEX מפריד מקרומולקולות מאת שלהם תשלום משטח¹⁴. Exchange אניון (AIEX) ו- bind מטריצות קטיון (CIEX) באופן שלילי ולא חיובי טעונה גרסאות, בהתאמה. עם הפרדה בסדר בין אוכלוסיות חלבון המשתפים מסה יחסית קרוב או צורה, IEX-MALS בהצלחה קובע את המסה טוחנת של כל מדינה חלבונים בודדים גם עם תערובת מדגם¹².

כאן אנו מציגים פרוטוקול תקני לביצוע ניסוי IEX-MALS ההפרדה וניתוח של צורות oligomeric BSA הקיימים במדגם זהה. הבחירה של עמודת IEX על חלבון ספציפי היא חשובה ולא נדונה, כמו גם התנאים pH, מוליכות של מאגרי. הניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS גם מתואר צעד אחר צעד. למרות ההפרדה של BSA oligomers טובה ומספקת ב- SEC-MALS, BSA היא דוגמה טובה כדי להראות את היכולות IEX-MALS וכדי להדגים אופטימיזציה של ניסוי. דוגמאות המסכן ההפרדה מושגת על ידי שניה-MALS, הפרדה נכונה וניתוח מופעל על-ידי IEX-MALS הם דנו גם עם המחקר הקודם¹².

1. הכנת המערכת

1. להתקין את חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) ומערכת גלאי אינדקס (RI) MALS/השבירה (ראה טבלה של חומרים) יחד עם חבילות תוכנה בהתאמה שלהם בקרה, חדרי קירור והקפאה של ניתוח לכל היצרנים הוראות.
2. לחבר את MALS ואת RI גלאי במורד הזרם של גלאי UV ו מוליכות של FPLC. לעקוף את גלאי ה-pH אלא אם הדבר הכרחי עבור מעברי צבע pH, כדי למזער את אמצעי האחסון interdetector בין הגלאים UV ו MALS. השתמש צינורות קפילר של 0.25-0.5 הקוטר הפנימי מ"מ (זהות) בין עמודת, גלאי, 0.75 מ מ זהות צינורות קפילר על הפלט של הגלאי RI האספן פסולת או לשבר.
3. ודא כי החיבורים הדרושים אות בין FPLC לבין גלאי הוקמו, כולל פלט אנלוגי של UV של הגלאי FPLC לקלט MALS Aux ו פלט דיגיטלי מ FPLC MALS Autoinject ב, דרך תיבת קלט/פלט.

2. הכנת המדגם, מאגר

1. לסנן כל ריאגנטים, כולל המאגרים כביסה ו • תנאי, עם מסנן 0.1 מיקרומטר. לסנן את הראשון 50 – 100 מ של מאגר לתוך בקבוק פסולת כדי לחסל את החלקיקים של המסננים יבש, ולשמור את השארית של המאגר בתוך בקבוק נקי, סטרילי, יש כבר שטפו ביסודיות עם מים מסוננים, הכתיר כדי למנוע אבק מלהיכנס.
2. התאם מדגם BSA pH ו כוח יונית (למשל, pH = 8, 50 מ מ NaCl) המאפשרות קשירה העמודה IEX במהלך הדילול, אולטראפילטרציה או מאגר exchange הליכים.
   הערה: מומלץ לסנן מראש את הדגימה חלבון לגודל נקבובית הקטן ביותר אינו מסיר את החומר של ריבית (0.02 – 0.1 µm). לחלופין, הדגימה יכול להיות centrifuged במהירות גבוהה (13,000 – 16,000 x g) למשך 10 דקות לאפשר את המשקעים של חלקיקים גדולים.
3. להכין לפחות 0.3-0.5 מ ג של BSA (ראה טבלה של חומרים) כדי להזריק בעמודה 1 מ"ל (5/50 מ מ) להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. שימו לב כי הנפח של הזרקת ללא הגבלה.

3. בחירה ופיתוח של שיטה IEX עבור חלבון

1. לחשב את איזואלקטרית (pI) של החלבון בהתבסס על הרצף העיקרי, עבור השרתים שאליהם כגון כלי Protparam על ExPASy האתר יכול להיות בשימוש¹⁵. שימו לב כי החוקר של BSA 5.8.
2. בחר עמודה מאגר וסוג הפרמטרים.
   1. השתמש מאגרים שונים עבור AIEX ו- CIEX, בהתאם pK המאגר ואת הטבע יוניים של המאגר. שימוש מאגרי cationic בעת הפעלת AIEX עמודה על מאגרי anionic בעת הפעלת העמודה CIEX עם counterions קטן. בדוגמה זו, השתמש 20 מ מ טריס-HCl מאגר, pH 8, לניתוח של BSA על עמודת AIEX.
   2. חלבון עם חזה ענק נמוך יותר מאשר 7, כגון BSA, לשימוש של עמודה AIEX, מאגר עם pH גבוה יותר מאשר החוקר על ידי לפחות שתי יחידות. על חלבון עם חזה ענק גבוה מ- 7, להשתמש CIEX עמודה בעלת מאגר עם pH נמוך יותר החוקר חלבון לפחות שתי יחידות.
   3. למטב את מאגר ה-pH לפי עוצמת איגוד בין החלבון המטריקס עמודה. אם חלבון שאינו בקשירה. ובכן אל העמודה להשתמש pH רחוק יותר החוקר. ודא כי החלבון הוא יציב על ה-pH בשימוש.
   4. השתמש ריכוז מלח נמוך באיגוד, לשטוף את המאגרים כדי לאפשר קשירה של החלבון למטריקס, מאז חלבון מחייב תלוי כוח יונית המדגם טעון. חלבונים דורשות בדרך כלל קצת מלח ליציבות שלהם; לכן, השתמש NaCl 50 מ מ (או מלח חלופי) במהלך השלבים חלבון-וטעינה של שטיפת העמודה.
   5. • תנאי מאגר, לשימוש לכל היותר 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה.
      הערה: ריכוז המלח גבוה לא מומלצים בעת עבודה עם משאבות-מעבדות RI תקן-דגם עקב המגבלה טווח של המכשיר. עם זאת, מודל ריכוז גבוהה יכול לשמש, יוכל להכיל 2 M NaCl.
3. לבצע שיטה ראשונית כדלקמן.
   1. לטעון 1 מ ג של BSA (170 µL של 6 מ"ג/מ"ל) ב- ~0.5 מ של מאגר טעינת מאגר 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכיל 50 מ"מ NaCl. רוחצים את העמודה עם המאגר באותו אמצעי אחסון עמודה 10 – 15 (CV) לאפשר את השלם • תנאי של מולקולות לא מאוגד, חלקיקים מן המערכת עד פיזור אור (האם), UV, את אותות RI מלא התייצבו.
   2. לבצע מעבר הדרגתי מלח קצר, ליניארי של 20 – 30 CV, באמצעות מאגר • תנאי של 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכילה 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה. לבצע מעבר הדרגתי של 0%-100% (או צבע נפוצה חלופי) המאגר • תנאי או לפצל את זה ל שני מעברי צבע: 0% – 50% • תנאי מאגר ואחריו צבע נוסף של 50%-100% • תנאי מאגר, מעבר הצבע עבור CV 10 – 20. עבור BSA, השתמש הדרגתי נרחבת של 15% – 70% עבור 30 קורות חיים עבור פעולת השירות הראשוני.
      הערה: במקרים מסוימים, השיטה הראשוני עשוי מספקים הפרדה ניתוח MALS אמין, מסלולים נוספים אינם הכרחיים. במקרים רבים, השיטה הראשונית מספקת רק הנחיות נוספות שיטת אופטימיזציה.
4. לייעל את השיטה IEX להגדיל את הרזולוציה ולשפר את ההפרדה שיא על-ידי שינוי פרמטרים שונים.
   1. לשנות את שיפוע הדרגתי ואת אורך. קצר מעברי צבע עם מדרונות גבוהה מספקים פסגות אינטנסיבי עם הפרדה פחות, בזמן ארוך מעברי צבע עם מדרונות מתונים לספק פסגות נמוך עם הפרדה טובה יותר. למצוא את האיזון בין עוצמת האות של רזולוציה שיא לניתוח MALS אופטימלית.
      הערה: טעינת כמות גבוהה יותר של חלבון יכול להגדיל LS, UV, ו רי אותות אבל עושה זאת על חשבון רזולוציה.
   2. השתמש פרופיל stepwise ריכוז המלחים • תנאי. זכור כי שילוב של צעדים, צבע ליניארי משמש בדרך כלל.
   3. להקטין את קצב הזרימה כדי לשפר את השיא ההפרדה.
      הערה: עבור מטריצות עם חלקיקים קטנים מאוד, זה לא מאוד משמעותי.
   4. לשנות את ה-pH המאגר כדי להגדיל את הווריאציה תשלום בין האוכלוסיות חלבון במדגם ולשפר את ההפרדה בין משתנים אלה. שימו לב כי ניתן להפריד חלבונים שאינם מופרדים כראוי ב- pH אחד ב- pH שונים.
   5. השתמש pH הדרגתיות, ליניארי או stepwise, כדי לנתק חלבונים מן העמודה IEX. • תנאי שימוש הדרגתיים המשלבות pH והן וריאציות ריכוז מלח במידת הצורך.
   6. השתמש מלחים חזקים יותר, כגון MgCl₂או מלחי חלש יותר, כמו סודיום אצטט, כדי להגדיל את הרגישות ואת הרזולוציה¹⁶.
   7. להשתמש יותר IEX עמודות או טורים שונה מטריצה עם חלקיקים קטנים יותר כדי לשפר את היכולות ההפרדה.
   8. לשנות את סוג עמודה (AIEX/CIEX) כדי לספק דפוס שונה של הפרדה. שים לב מטריצות עם חזק, חלש או משולב ליגנדים (מצב מעורב) זמינים גם, יכול לשפר את הרזולוציה של דגימות.
   9. להשתמש בעמודת מן הספק שונים עם ליגנד באותו שאליו מחובר שרפים מטריקס שונים. שרף עצמו, ללא תלות ליגנד, ניתן לקיים אינטראקציה באופן שונה עם החלבונים, להשפיע על הפרופיל ההפרדה.
   10. כוללים תוספות (מולקולות לייצב את החלבון של הפתרון) במאגרי כדי לשפר את יציבות החלבון ולהימנע מצבור חלבון, כדי לשפר את הניסוי IEX.
       הערה: דוגמאות של תוספים כאלה הם סוכרים, כהלים, שתנן, חומרי ניקוי nonionic או zwitterionic, chaotropic ו- kosmotropic מלחי^17,18.

4. ניסוי IEX-MALS

1. פתח New\Experiment של שיטת בתוכנה MALS ובחר את השיטה המקוונת מתיקיית שיטות מערכת פיזור אור . אם המודול DLS זמין והם DLS נתונים כדי לרכוש, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה אור Scattering\With QELS .
2. להגדיר את הפרמטרים של ההפעלה תחת מקטע התצורה .
   1. להגדיר את קצב הזרימה המרוץ במקטע משאבה כלליים את קצב הזרימה המשמשים את FPLC (1.5 mL/min), הזן או לאמת את הפרמטרים מאגר תחת המקטע הממס .
   2. הזן את השם חלבון (BSA), מקדם שבירה קבועה (dn/dc; התקן ערך עבור חלבונים הוא 0.185 mL/g), UV מקדם הכחדה-אורך הגל של 280 ננומטר (0.66 g/L^-1·cm^-1), הריכוז של המדגם חלבון (6 מ"ג/מ"ל) ב- הכרטיסיה הדגימה תחת המקטע מזרק . הכנס את אמצעי האחסון מדגם להזרקה (170 µL) כמו גם תחת אותו סעיף.
   3. בכרטיסיה בייסיק , תחת המקטע הליך , בחר בתיבת הסימון הדק על Autoinject , להגדיר את משך ההפעלה כך איסוף נתונים תימשך לפחות 5 דקות לאחר המילוי ההדרגתי הגיעה שלה הערך הסופי.
3. להגדיר את הפרמטרים ניסוי בתוכנה FPLC.
   1. ליצור התנסות חדשה בכרטיסיה עורך שיטות . הניסוי הראשוני יהיה הדרגתי ליניארי של מלח או pH (ראה שלב 3.3). שיטת אופטימיזציה, צור הדרגתי יותר ספציפי או תוכנית stepwise לפי התוצאות • תנאי במהלך שיטת הראשונית (ראה צעד 3.4 ו איור 1). לכלול אות הדופק השיטה שיפעילו איסוף נתונים בתוכנת MALS.
   2. לשטוף את העמודה ואת שסתומים עם המאגרים הרלוונטיים: 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, עם 50 מ"מ NaCl המאגר כביסה (שסתום), המאגר אותו עם 500 מ מ NaCl עבור המאגר • תנאי (B שסתום). ודא כי לשטוף את העמודה האחרונה משתמשת המאגר מחייב, המכילים ריכוז מלח נמוך, כדי לאפשר את הכריכה של החלבון אל המטריקס עמודה. לרחיצה מסיבית של זיהומים חריפה מאוגד, להשתמש 0.5 M NaOH לפני כביסה עם המאגרים הרלוונטיים, ולאחריה שטיפה מאגר ניטרול.
   3. מקם את הדגימה חלבון בתמונה באמצעות מזרק. אם יותר מ 10 מ"ל של המדגם נטען, להשתמש superloop או את משאבת השסתום של המכשיר FPLC בעת שעקף מסנן המשאבה ואת המיקסר של FPLC.
4. להתחיל את הניסוי קודם בתוכנה MALS על-ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן גם את התוכנה FPLC. נתונים ייאספו לאחר קבלת האות הדופק של המכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.
5. החל באותם הפרמטרים של במנוסה, ההוראות המתוארות צעדים 4.1-4.4 אם IEX-MALS מתבצע באופן ידני עם מצב זרימה רציפה במקום שיטה עצמאי.
6. ברגע השיטה הסופי מאומתים, לרוץ, לבצע בדיוק באותה שיטה באמצעות זריקה ריק (טעינת מאגר במקום המדגם). חשוב כי התזמון בין הדופק autoinject ה גרדיאנט הפעלה ריק הוא זהה לזה של הדגימה להפעיל.

5. ניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS

1. ביצוע הניתוח של צעד אחר צעד תחת המקטע הליך התוכנה MALS. התצוגה בייסיק מציגה אוסף נתונים גולמיים של הניסוי.
   1. השתמש בכרטיסיה ' Despiking ' כדי להחליק את chromatograms אם הם מציגים הרבה רעש. בדרך כלל, השתמש ברמה נורמלית .
   2. להגדיר את התוכנית הבסיסית עבור כל הסימנים (כל LS, UV ו רי גלאי) תצוגה בסיסית .
   3. להגדיר את הפסגות לניתוח בתצוגה פסגות . בדוק את הערכים הנכונים של dn/dc, המקדם הכחדה UV עבור החלבון תחת כל שיא.
      הערה: חלבונים, נהוג להשתמש RI סטנדרטי תוספת הערך 0.185 mL/g, אך עבור מקרומולקולות אחרות, ערכים שונים dn/dc יש להשתמש, על-פי האופי של המולקולה. Dn/dc הממוצע של polynucleotides (DNA/RNA) הוא 0.17 מ"ל/g¹⁹, בעוד saccharides, כגון סוכרוז, יש ערך ממוצע dn/dc של g/0.145 mL²⁰ ואת הערכים dn/dc של ליפידים ודטרגנטים נע בין 0.1-0.16 g²¹.
   4. לנתח את המסה טוחנת ואת הרדיוס באמצעות הפרמטרים התאמה והפונקציה המתאם מתחת לתצוגות המסה טוחנת & רדיוס של LS ו R_h מ QELS .
2. השינויים אות רי באופן משמעותי במהלך IEX-MALS לפעול עקב העלייה בריכוז המלח. לכן, להחסיר את האות הבסיסית של הזריקה ריק לחישובי המוני הדורשים RI נתונים.
   1. פתח גם חלבון וגם ניסויים IEX-MALS ריק. לחץ לחיצה ימנית על שם הניסוי חלבון בחר להחיל את השיטה, בחר את תיקיית הבסיס חיסור מתיבת דו-שיח קובץ. בחר בסוג הנכון של השיטה (למשל, באינטרנט) לניתוח המוני טוחנת סטנדרטי. שימו הפרמטרים ואת ההגדרות שהוגדרו עבור הניסוי חלבון יישמרו על שיטת נפתח חדש.
   2. תחת התצוגה חיסור בסיסית , לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות המרוץ ריק. תחת כלי נגינה (לצד לחצן ייבוא ריק ), לבדוק את כולם גלאי כדי לחסר.
   3. בתצוגה ' פסגות ', התאם את הערכים dn/dc (במקרה הצורך) בשל מוליכות הפתרון באזור שיא חלבון, מאז המהלכים הנכונים של הפתרון הוא השתנה במהלך ריצה¹².
3. לכייל את המערכת IEX-MALS עם מונומר BSA.
   הערה: בדרך כלל, מערכת IEX-MALS מעת לעת מכויל שיא יישור, הלהקה הרחבה של נורמליזציה של גלאי זוויתי. הגלאי 90° באמצעות חלבון monodisperse עם רדיוס של רגע (R_g) של < 10 ננומטר, כמו BSA מונומר. בדוגמה זו, BSA מגישה גם מולקולת כיול, הוא עצמו הנושא של הניתוח המוני טוחנת.
   1. יישר את הפסגות, תחת נהלים > תצורת תצוגה.
   2. לבצע נרמול תחת התצוגה נורמליזציה , הזנת 3.0 nm כערך_g R.
   3. תחת הלהקה הרחבת בכרטיסייה תצורה זהה, לבחור הפסגה, להתאים את האותות UV ו LS לאות רי, באמצעות הלחצן בצע להתאים .
4. הגרף של התוצאות מוצג בתצוגה תוצאות התאמה . לשנות את המאזניים ציר ופרמטרים אחרים של גרף על-ידי לחיצה ימנית על הגרף, בחירת לערוךולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם . דמות גרף עם יותר אפשרויות התצוגה זמינה גם בכרטיסיה EASI גרף : בחר המסה טוחנת מתוך התפריט הנפתח להציג בחלק העליון של החלון.
5. שים לב כי כל התוצאות, כולל המסה טוחנת, רדיוס, דרגת טוהר של אחרים, זמינים בתצוגת דוח (סיכום או מפורט) תחת המקטע תוצאות . השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף עוד תוצאות או פרמטרים, כמו גם דמויות, לדוח.

BSA הוא חלבון נפוץ אשר משמש הכרומטוגרפיה כיול של מערכת ניסויית22 ומתאים מאוד לתרגול IEX-MALS, כמו גם שניה-MALS. היא בעיקר monomeric עם מסה מונומר תיאורטי של 66.7 kDa, בדרך כלל משלבת מספר קטן של הדימרים ו oligomers גבוהה23.

BSA נותחו על IEX-MALS באמצעות עמודת אנליטית של exchange אניון (ראה טבלה של חומרים). פונקציה קווית רחב הדרגתי בהיקף של 30 CV מן 75 מ"מ עד 350 מ"מ NaCl הופרדו BSA מונומרים oligomers גבוה יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחנת מונומר מחושב של 66.8 kDa ± 0.7, מסה טוחנת דימר מחושב של 130 ± 5 kDa (איור 1א').

על סמך את מוליכות מאגר על הפסגות eluted, מעבר הצבע שונתה תוכנית אחרת: שלב ארוך של 175 מ מ NaCl ואחריו הדרגתי לינארית מ- 175 מ מ עד 500 מ מ NaCl. מעבר הצבע החדש לשפר באופן משמעותי את הרזולוציה ואת ההפרדה מעולה BSA מונומר (עם מסה טוחנת מחושב של 66.1 ± 0.7 kDa) בין המינים oligomeric העליונים שלה (עם מסה הממוצע המחושב של 132 ± 2 kDa) (איור 1B). להתמקד גם המין oligomeric גבוהה וכדי לחשב טוחנת המוני בכל צורה oligomeric אישית של BSA, הוחלה תוכנית stepwise של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. הניסוי הזה, גרמו הפרדה מצוינת בין BSA מונומר (עם מסה מחושב של 62.4 ± 0.4 kDa) דיימר (עם מסה מחושב של 130 ± 10 kDa), trimer (עם מסה מחושב של 170 ± 10 kDa) (איור 1C). כל הניסויים IEX-MALS מראים כי BSA elutes בעיקר בתור מונומר עם טוהר של 80%, מסכים עם תוצאות שניה-MALS שבו מונומרים BSA elute עם טוהר של 85%12.

איור 1 : אופטימיזציה של הניסוי IEX-MALS עבור BSA. (א) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית הדרגתי של 75 – 350 מ"מ NaCl. (B) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית של צעד NaCl 175 מ מ, ואחריו תוכנית מעבר צבע ליניארי של 175 – 500 מ מ NaCl. (ג) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית שלב של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. Chromatograms הצג UV באור 280 nm (כחול), מפזרים על זווית 90 מעלות (אדום), ואת את מקדם שבירה (ורוד). את עקומות מוליכות (אפור) יחד עם המסה טוחנת של כל שיא המחושב על-ידי MALS (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ד. ש. הוא עובד של תאגיד הטכנולוגיה וויאט, שאת מוצריו מנוצלים של פרוטוקול זה. ש א הוא מועסק ע י דניאל ביוטק, מפיץ של מכשירים וויאט ואת ÄKTA.