פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
צבירה חריגה של החלבון טאו מעורב באופן פתולוגי במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD). למרות שדגמי העכבר של טאונופתיה סיפקו משאב בעל ערך לחקירת מנגנוני הנוירורעילים של האוניברסיטה הנצברת, הוא הופך להיות יותר ויותר ברור כי, בשל הבדלים בין מינים נוירופיזיולוגיה, המוח בעכבר אינו מתאים ל מידול המצב האנושי. ההתקדמות בשיטות תרבות התאים הפכו את התרבויות העצבי האנושיות לנגישות לשימוש ניסיוני בתחום החוץ וסייעו בפיתוח הneurotherapeutics. עם זאת, למרות ההסתגלות של תרבויות התאים הנוירואליות האנושית, במודלים של מבחנה של הטאופתיה האנושית עדיין אינם זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה מתאר את המודל התאי של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים מהאנטי-ויראליות הקוד עבור מוטציה בפתוניים התמזגו לכתב חלבון פלורסנט צהוב (YFP). תרבויות התמרה לייצר אגרגטים טאו הכתם באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג סמנים של רעילות נוירולית, כגון אורך האקסון הופחת ונפח ליסוזומגדל. הליך זה עשוי להיות מודל שימושי וחסכוני ללימוד tauopathies אנושיים.
מבוא
צבירה פתולוגית של המיקרו-מחלות החלבון המקושר היא תכונה מוגדרת של הרבה במחלות ניווניות, כולל לספירה, דמנציה מתקדמת (ftd), מחלת ברים, ושיתוק מוחין גרעיני (PSP)1. במדינה שאינה חולה, מאוגד הטאו ומייצב את החוטים המיקרוסיבים העצביים ב-2. עם זאת, היפרזילציה הקשורים למחלות של הטאו מקדמת את צבירת הטאו, דיסוציאציה ממיקרוטובולים ורעילות עצבית3. ההשפעות הרעילות של הטאו הצבור עשוי להיות כרוך הפעלה חריגה של cholinergic4 ו glutamatergic קולטנים5 וכתוצאה מכך דיסתקנה של סידן תאיים ובסופו של דבר, מוות תאים. במודלים של בעלי חיים, הפחתת המוח המוחי משפרת את הפתולוגיה בעכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה וריאגנטים
- הפשרת ציפוי מטריצות של קרום המרתף ללוחות התרבות ב-4 ° צ' (אל תאפשר למטריצת הממברנה להתחמם או שהיא תפדה). הפוך את 1 mL ואחסן אותם ב-20 ° c או-70 ° c.
- מהווה מחדש את גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ בסיסי (bFGF) ב מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS) ב 10 μg/mL ולעשות 10 μL aliquots. אחסן אותם ב-4 ° c.
- לבקבוק חדש, לא נפתח, 500 mL של DMEM/F12 עם גלוטמין, להוסיף (10 מ ל), N2 (5 מ ל), ו פניצילין-סטרפטומיצין (5 mL). מקום 50 mL של תא גזע זה (המועצה לבטחון לאומי) מדיה בצינור חרוט ולהוסיף 10 μL של 10 μg/μL (2 μg/mL סופי) bFGF. אחסן את המדיה לבטחון לאומי (+) bFGF ב-4 ° c.
- כדי לבצע (-) bFGF מדיה, להשתמש באותו מתכון כפי שמתואר בשלב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טאו-RDLM-YFP-התמרה הנוירונים הייתה מתוייגת בעזרת YFP, ו RDLM-התמרה תרבויות הציג אגרגטים לאחר התמרה. אלה הכללות מוכתם חיובי עבור thioflavin (איור 1). כפי שאיור 1 ממחיש, פרוטוקול זה מייצר תרבויות נוירואליות המציגות את האגרגטים החיוביים של הטאו. עבור ניסויים ראשוניים, מומלץ כי בידול עצבי הוא אישר על ידי אימונויניום לסמן את העצב הספציפי β-טובולין III בתרבויות. חשוב מכך, פלואור מתויג באמצעות נוגדנים משניים צריך להיות הספקטרום עירור/פליטה כי אינו חופף עם זה של YPF (Cy.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל בלתי מתורבת של טאונופתיה האנושית שמוצגים כסף-כתם חיובי אגרגטים ו thioflavin-חיובי נוירופיבריליאן סבך. יתר על כן, תאים התמרה להציג הפתולוגית המושרה טאו כגון פגמים מורפולוגיים, synaptogenesis מופחתת, ונפח ליסוזוממוגבר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק מודל נגיש וחסכוני של טאונופתיה עצבית, שניתן להשתמש בו ללימודי סינון סמים, כמו גם לניתוח רעילות של הטאו. מודל זה ממלא את הצורך החומרי במחקר ניווניות כמו קווי התאים של טאונופתיה אנושיים עדיין לא זמין באופן נרחב והשימוש של הטאו טרנסגניי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים רוצים להודות לד ר פיטר דייויס במכללת אלברט איינשטיין לרפואה בגין אספקת הנוגדנים PHF-1 ו-CP13 ו ד ר מארק דיאמונד באוניברסיטת טקסס, בדרום-מערב, למתן מבנים של הטאו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של האגודה לאלצהיימר (נירנברג g-14-322164) כדי S.H.Y. ומהמכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית (TB1-01193) ליחסי ציבור
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחות תרבית 10 ס"מ | Thermofisher | 12556002 | |
| צינורות 15 מ"ל | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 צלחות תרבית באר | Thermofisher | 930186 | |
| צינורות 50 מ"ל | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% אתנול בבקבוק | ריסוסמקורות שונים | NA | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | |
| מטריצת ממברנת הבסיס (מטריג'ל) | קורנינג | 356231 | |
| בסיסי FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא | A7906 | |
| חממת תרבית תאים | מקורות שונים | NA | |
| צנטריפוגה | מקורות שונים | NA | |
| DMEM-F12 מדיה תרבית עם גלוטמין | תרמופישר | 10565042 | |
| אתנול (ריכוז 50% ומעלה) | מקורות שונים | NA | |
| נוגדנים משניים המסומנים באופן פלואורסצנטי | מקורות שונים, תלוי ניסוי | NA | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | מקורות שונים | NA | |
| כיסויי זכוכית | Thermofisher | 1254581 | |
| זכוכית שקופיות | Thermofisher | 12-550-15 | |
| תאי גזע עצביים אנושיים | מקורות שונים | NA | |
| וקטורים לנטיוויראלים | מקורות שונים | הזמנה | |
| מדיה הרכבה | Thermofisher | P36934 | |
| N2 תוסף | Thermofisher | 17502048 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Thermofisher | 15140122 | |
| פוספט חוצץ | מלח Thermofisher | 14190250 | |
| נוגדנים ראשוניים | מקורות שונים, תלוי ניסוי | NA | |
| נדנדה או פלטפורמה מסתובבת | מקורות שונים | NA | |
| מכסה מנוע | תרבית תאים סטרילימקורות שונים | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| אמבט מים | מקורות שונים | NA |
מקורות
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
