מאמר שיטה

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

DOI:

10.3791/59434

⸱

3 במאי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.

זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הקשורים לדג בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של הרווארד.

1. הכנה לכלי ומגיב

  1. לעשות לולאת חוט לקצוץ עוברים
    1. קח 20 ס מ של חוט נירוסטה נוקשה ולא מאכל עם קוטר של 40 μm. לולאה התיל דרך לתוך נימי זכוכית (1.0 מ"מ קוטר חיצוני, 0.5 מ"מ קוטר פנימי, ללא פילמנט), עושה לולאה קטנה בראש (אורך הלולאה הוא 1.0 מ"מ)
    2. שים טיפה של לק מסמר ברור על קצה של נימי הזכוכית בין לולאת התיל כדי להחזיק אותו במקומו. . תן להתייבש ודא שלא לקבל לק ציפורניים על החלק לולאה, כפי שהוא עלול לגרום נזק לעוברים.
    3. חברו את נימי הזכוכית עם הלולאה אל המקל עץ (9 "במ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפחתת נפח חלמון חשוב עבור מורפולוגיה נורמלית
כפי שמתואר לאחרונה באלמואדו-קסטיליו ואח '.17, הפחתת גודל העוברים יכולה להיות מושגת ללא צמצום נפח החלמון. כדי להשוות עם וללא הפחתת נפח החלמון, בוצעו שני שלבים חיתוך (הן blastula וחלמון) ו blastula בלבד חיתוך (איור 2 ו המשלים סרט 1). שני צעדים קצוצים עוברים הראו מורפולוגיה כללית נורמלית לכאורה לעומת השליטה (בלבד) עוברים, מלבד הבדל גודל, לאורך השלבים ההתפתחותיים (ראה לוחות העליון והאמצעי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של ביסען (blastula stage), המארגן ממוקם באזור מוגבל של blastula שוליים18,19,20,21........

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים או מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי פיירקס 60 מ"מCORNING  3160-60
Agaroseaffymetrix75817להכנת תושבת להדמיה חיה
Agarose, טמפרטורת ג'ל נמוכה מסוג VII-ASIGMA-ALDRICHA0701-25G
CaCl2EMDCX0130-1עבור 1/3 תמיסת רינגר
CaSO4למי ביצים
תלוש כיסוי (25 מ"מ x 25 מ"מ, עובי 1)CORNING2845-25
מרית חד פעמיתVWR 80081-188
לוח קצףELMER'S951300לחממת מיקרוסקופ
Forcept (No 55)FST11255-20
פיפטת זכוכיתVWR14673-043
HEPESSIGMA Life ScienceH4034עבור 1/3 הפתרון של רינגר
INCUKIT XL לחממות ארונותWarehouse.comעבור חממת מיקרוסקופ
מלח ים מיידיאוקיינוס מיידי138510עבור מי ביצה
KClSIGMA-ALDRICHP4504עבור 1/3 תמיסת רינגר
מתיל תאיתSIGMA-ALDRICHM0387-100G
NaClSIGMA-ALDRICHS7653עבור 1/3 הפתרון של רינגר
צלחת פטריפלקון351029עבור הכנת תושבת להדמיה חיה
פנול אדוםSIGMA מדעי החייםP0290
משאבת פיפטהBEL-ART PRODUCTSF37898
PronaseEMD Millipore Corp53702-250KU
Tricaine-S (MS222)WESTERN CHEMICAL INC
דק במיוחד בהיר מחוסל 316L קוטר 0.035 מ"מ חוטי אריגה מנירוסטהסנדרההחוט בו השתמשנו הושג לפני ~20 שנה ולא הצלחנו למצוא בדיוק את אותו אחד. למוצר זה יש את אותו חומר וקוטר כמו זה שבו אנו משתמשים.
NC0135573

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechani....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zebrafish EmbryosSize Reduction TechniqueBlastula ChoppingYolk WoundingEmbryo RecoverySomite FormationNeural Tube ScalingLive ImagingMethyl CelluloseRinger Solution

מאמרים קשורים