כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.
מאמר שיטה
כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.
בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.
מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.
זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של ביולוגיה, כולל ביולוגיה התפתחותית. בפרט, דג דג זברה הוא אידיאלי עבור vivo live הדמיה6 כי 1) הפיתוח יכול להמשיך בדרך כלל מחוץ לאם ואת קליפת הביצה, ו 2) העוברים שקופים. בנוסף, העוברים יכולים לעמוד בטמפרטורה ובתנודות סביבתיות, המאפשרים להם ללמוד בתנאי מעבדה. כמו כן, בנוסף הביטוי הגן הקונבנציונלי הפרטורציה על ידי הזרקת גוורסטינו ו mrna הזרקה7,8, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית crispr/Cas9 עשה גנטיקה הפוכה ב-דג זברה יעיל מאוד9. יתר על כן, טכניקות קלאסיות רבות ב אמבריולוגיה, כגון השתלת תאים או ניתוח רקמות ניתן להחיל4,10,11.
הפחתת גודל טכניקות פותחו במקור בעלי חיים שאינם בעלי חוליות12. לדוגמה, ב- xenopus זריזה, עוד מודל פופולרי בעלי חוליות בעלי החיים, החצייה לאורך ציר החי-ווגטל בשלב blastula, יכולים לייצר עוברים מופחתים בגודל12,13. עם זאת, בידינו זו גישה צעד אחד תוצאות העוברים מאואמים או מונאמים ב-zebrafish, ככל הנראה משום שהדטרמיניזם הדו מופץ ללא שינוי ואין לדעת את הלוקליזציה שלהם מתוך המבנה של העוברים. כאן אנו להדגים טכניקה חלופית דו-שלבים לחיתוך באמצעות הדגים המייצרת בדרך כלל אך עוברים קטנים יותר. עם טכניקה זו, תאים מוסרים לראשונה מן הקוטב חיה, אזור של תאים תמימים חסר פעילות ארגונית. כדי לאזן את כמות החלמון והתאים, שהוא חשוב עבור epiboly והבאים מורפוגנזה, חלמון מוסר לאחר מכן. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול זה ולספק שתי דוגמאות של קבוע גודל במבנה תבנית; היווצרות הצינור העצבי הגחון. בשילוב עם הדמיה כמותית, אנו משתמשים בטכניקת הפחתת גודל כדי לבחון את האופן שבו גדלים של שפופרת העצבים והצינורית העצבית מושפעים מהעוברים מופחתים בגודל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל ההליכים הקשורים לדג בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של הרווארד.
1. הכנה לכלי ומגיב
2. הכנת עוברי דג העוברים עבור הפחתת גודל כירורגי
3. הפחתת גודל כירורגי ושחזור
4. הדמיה חיה של בריידג סומאיטאוגנזה
5. הדמיה של מעצבי צינור עצביים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הפחתת נפח חלמון חשוב עבור מורפולוגיה נורמלית
כפי שמתואר לאחרונה באלמואדו-קסטיליו ואח '.17, הפחתת גודל העוברים יכולה להיות מושגת ללא צמצום נפח החלמון. כדי להשוות עם וללא הפחתת נפח החלמון, בוצעו שני שלבים חיתוך (הן blastula וחלמון) ו blastula בלבד חיתוך (איור 2 ו המשלים סרט 1). שני צעדים קצוצים עוברים הראו מורפולוגיה כללית נורמלית לכאורה לעומת השליטה (בלבד) עוברים, מלבד הבדל גודל, לאורך השלבים ההתפתחותיים (ראה לוחות העליון והאמצעי
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של ביסען (blastula stage), המארגן ממוקם באזור מוגבל של blastula שוליים18,19,20,21....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים או מתחרים.
העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת פטרי פיירקס 60 מ"מ | CORNING& | nbsp; 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | להכנת תושבת להדמיה חיה |
| Agarose, טמפרטורת ג'ל נמוכה מסוג VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | עבור 1/3 תמיסת רינגר |
| CaSO4 | למי ביצים | ||
| תלוש כיסוי (25 מ"מ x 25 מ"מ, עובי 1) | CORNING | 2845-25 | |
| מרית חד פעמית | VWR | 80081-188 | |
| לוח קצף | ELMER'S | 951300 | לחממת מיקרוסקופ |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| פיפטת זכוכית | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | עבור 1/3 הפתרון של רינגר |
| INCUKIT XL לחממות ארונות | Warehouse.com | עבור חממת מיקרוסקופ | |
| מלח ים מיידי | אוקיינוס מיידי | 138510 | עבור מי ביצה |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | עבור 1/3 תמיסת רינגר |
| מתיל תאית | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | עבור 1/3 הפתרון של רינגר |
| צלחת פטרי | פלקון | 351029 | עבור הכנת תושבת להדמיה חיה |
| פנול אדום | SIGMA מדעי החיים | P0290 | |
| משאבת פיפטה | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | ||
| דק במיוחד בהיר מחוסל 316L קוטר 0.035 מ"מ חוטי אריגה מנירוסטה | סנדרה | החוט בו השתמשנו הושג לפני ~20 שנה ולא הצלחנו למצוא בדיוק את אותו אחד. למוצר זה יש את אותו חומר וקוטר כמו זה שבו אנו משתמשים. |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה