עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

Joshua Deal; Andrea Britain; Thomas Rich; Silas Leavesley

doi:10.3791/59448

מאמר שיטה

עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

DOI:

10.3791/59448

⸱

22 באוגוסט 2019

Joshua Deal¹^,²^,³ , Andrea Britain²^,³ , Thomas Rich²^,³ , Silas Leavesley¹^,²^,³

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, ²Center for Lung Biology, University of South Alabama, ³Department of Pharmacology, University of South Alabama

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ספקטרלית הפך פתרון אמין לזיהוי והפרדה של אותות מרובים של זריחה במדגם אחד והוא יכול בקלות להבחין אותות של עניין מרקע או פלואורסצנטית אוטומטי. עירור-סריקת הדמיה hyperקטרראלית משפרת בטכניקה זו על ידי הפחתת הזמן הדרוש לרכישת תמונה תוך הגברת היחס האות לרעש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות אחדות מסתמכות על גילוי אותות של קרינה פלואורסצנטית כדי לזהות או לחקור תופעות או להבהיר פונקציות. הפרדת האותות הללו בעלי קרינה פלואורסצנטית הוכחו מסורבל עד הופעתו של הדמיה היפרספקטראלית, שבו מקורות פלואורסצנטית ניתן להפריד זה מזה, כמו גם מאותות הרקע ומלא התאמה אוטומטית (נתון הידע של שלהם ספקטרלי חתימות). עם זאת, מסורתי, סריקת פליטה הדמיה hyperקטרלית סובלת מזמני רכישה איטית ויחס אות לרעש נמוך בשל הסינון הדרוש של שני עירור ואור פליטה. זה כבר הוכח כי עירור הדמיה היפרספקטקטרלית מפחית את זמן הרכישה הדרוש תוך הגברת היחס אות לרעש של נתונים שנרכשו. באמצעות ציוד מסחרי זמין, פרוטוקול זה מתאר כיצד להרכיב, לכייל ולהשתמש במערכת מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרראלית להפרדת אותות ממספר מקורות פלואורסצנטית במדגם אחד. בעוד שהיא ישימה מאוד לדימות מיקרוסקופיים של תאים ורקמות, טכניקה זו עשויה גם להיות שימושית עבור כל סוג של ניסוי ניצול הקרינה שבה ניתן לשנות את אורכי גל עירור, כולל אך לא מוגבל: הדמיה כימית, יישומים סביבתיים, טיפול בעיניים, מדעי המזון, מדע הזיהוי הפלילי, מדע הרפואה ומינרלוגיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ספקטרלית ניתן לבצע במגוון דרכים והוא מכונה על ידי כמה מונחים¹^,²^,³^,⁴. באופן כללי, הדמיה ספקטרלית מתייחסת לנתונים הנרכשים לפחות שני ממדים מרחביים ומימד ספקטרלי אחד. הדמיה רב ספקטראלית והיפרספקטקטרלית מאופיינת לרוב במספר הלהקות של אורך הגל או אם הלהקות הספקטרליות הן רציפות¹. עבור יישום זה, נתונים היפרספקטקטרליים מוגדר נתונים ספקטרליים שנרכשו עם מסגרות גל רציפים שהושגו על ידי מרווח של אורכי גל מרכזי לא פחות ממחצית רוחב מלא על חצי מקסימום (FWHM) של כל מסנן בנדנה המשמש עירור (כלומר, 5 ננומטר מרווח אורך גל מרכזי עבור מסנני bandpass עם 14-20 ננומטר רוחב פס). הטבע הרציף של להקות הנתונים מאפשר דגימת יתר של ערכת המידע, ומבטיח שקריטריוני נייקוויסט יהיו מרוצים בעת דגימת התחום הספקטרלי.

הדמיה היפרספקטראלית פותחה על ידי נאס א בשנות ה-70 וה-1980 בשילוב עם לווין הראשון של landsat⁵^,⁶. איסוף נתונים מכמה להקות ספקטרליות רציפות מותר לדור של ספקטרום זוהר של כל פיקסל. זיהוי והגדרה של ספקטרום הזוהר של רכיבים בודדים איפשר לא רק לזהות את חומרי השטח על ידי הספקטרום האופייני שלהם, אבל זה גם מותר להסרת אותות בהתערבות, כגון וריאציות באות בשל תנאים אטמוספריים. הרעיון של זיהוי חומרים באמצעות ספקטרום האופייני שלהם הוחל על מערכות ביולוגיות ב 1996 כאשר שרדינגר et al. בשימוש שילובים של חמישה fluorophores שונים ואת הספקטרום הידוע שלהם כדי להבדיל כרומוזומים המסומנים בתהליך כינה מקלדת ספקטרלית⁷. טכניקה זו פירט על ידי Tsurui ואח 2000 ' עבור הדמיה פלואורסצנטית של דגימות רקמה, באמצעות שבעה צבעי פלורסנט והתפרקות ערך יחיד כדי להשיג הפרדה ספקטרלית של כל פיקסל לתוך צירופים ליניאריים של ספקטרום בהפניה . ספריה⁸ בדומה עמיתיהם חישה מרחוק שלהם, את התרומה של כל fluorophore ידוע ניתן לחשב מן התמונה היפרספקטראלית, נתון מידע של הספקטרום של כל fluorophore.

הדמיה היפרקטרלית בשימוש גם בתחומי החקלאות⁹, אסטרונומיה¹⁰, ביודינין¹¹, הדמיה כימית¹², יישומים סביבתיים¹³, טיפול עיניים¹⁴, מזון מדע¹⁵, המדע המשפטי¹⁶^,¹⁷, מדעי הרפואה¹⁸, מינרלוגיה¹⁹, ומעקבים²⁰. מגבלה מרכזית של הנוכחי מיקרוסקופ היפרספקטקטרליות מערכות הדמיה היא כי טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית היפרקטרלית מבודד אותות זריחה להקות צר ידי 1) סינון ראשוני של אור עירור כדי לשלוט עירור המדגם, אז 2) מסנן את האור הנפלט כדי להפריד את פליטת הזריחה ללהקות צרות שיכולות להיות מופרדות מאוחר יותר²¹מתמטית. סינון הן התאורה העירור והזריחה הנפלטת מפחית את כמות האות הזמינה, המורידה את היחס בין האות לרעש ומחייבת זמני רכישה ארוכים. האות הנמוך וזמני הרכישה הארוכים מגבילים את הישימות של הדמיה היפרספקטראלית ככלי אבחון.

מודאליות הדמיה פותחה שעושה שימוש בהדמיה היפרקטרלית אבל מגביר את האות הזמין, ובכך לצמצם את זמן הרכישה הדרוש²¹^,²². זה חדש מודאליות, שנקרא עירור-סריקה היפרספקטקטרלית, רוכשת נתונים התמונה ספקטרלית על ידי שינוי אורך הגל ואיסוף מגוון רחב של אור נפלט. זה כבר הוכח כי טכניקה זו מניבה הזמנות של עליות גודל ביחס אות לרעש בהשוואה לטכניקות סריקה פליטה²¹^,²². הגידול ביחס אות לרעש הוא במידה רבה בשל המעבר ברוחב (~ 600 nm) של אור פליטה זוהה, בעוד הספציפיות מסופק על ידי סינון רק אור עירור במקום פליטת הזריחה. זה מאפשר את כל האור הנפלט (עבור כל גל עירור) כדי להגיע לגלאי²¹. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפלות את הקרינה האוטומטית מתוויות אקסוגני. יתר על כן, את היכולת להפחית את זמן הרכישה בשל האות מוגבר לגילוי מפחית את הסכנה של הלבנת, כמו גם מאפשר סריקות ספקטרליות בקצב הרכישה מקובל עבור דימות וידאו ספקטרלי.

המטרה של פרוטוקול זה היא לשמש כמדריך לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. בנוסף, כלולים תיאורים המסייעים להבנת הנתיב האור והחומרה. תואר גם הוא יישום של תוכנה מקור פתוח עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. לבסוף, התיאורים מסופקים לאופן הכיול של המערכת לתקן הניתן למעקב נשים, להתאים הגדרות תוכנה וחומרה לקבלת תוצאות מדויקות ולבטל את הערבול של האות המזוהה לתרומות מרכיבים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הגדרת התקן

מקור אור: לבחור מקור רחב הלהקה אור ספקטרלי עם התפוקה הגבוהה החשמל ואת המקור גבוה (300 W Xe מנורת arc שימש למחקרים אלה).
תריס (אופציונלי): להוסיף תריס על הנתיב האופטי כדי להפחית את הלבנת התמונה עבור הדמיה זמן.
מערכת מסנן tunable: לשלב הרכבה כוונון מכני ו-סרט דק מסנן tunable (TFTF) הגדר כדי לאפשר את טווח עירור הרצוי אורך הגל (למשל, 360-485 nm).
מיקרוסקופ: השימוש הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטית כולל דיקרואיק ממונע מסנן הצריח ובקר.
1. קוביית מסנן פלואורסצנטית: להרכיב קוביית לעבור ארוך לעבור מסנן זריחה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבחור מראה דיקרואיק ומסנן פליטה ארוך לעבור באותו הגל כדי להשיג הפרדה אופטימלית של עירור מאור פליטה (למשל, 495 nm).
2. המטרה: להשתמש במטרה האפורומטית המתאים כדי להבטיח מיקוד אחיד על טווח אורך הגל המשמש לניסוי (מטרת המים 60x שימש למחקר זה).
3. השלב האוטומטי (אופציונלי): השתמש בשלב אוטומטי לדגימה מהירה של שדות מרובים של תצוגה ו/או שדות גדולים מאוד באמצעות תפירת תמונות. כיילו את הבמה עם המטרה והמצלמה.
מצלמה: בחר מצלמה מתאימה כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית, רגישות, ואת דרישות הרעש של הניסוי (מערכת זו מנוצל מצלמה sCMOS רגישות גבוהה).

2. תוכנת רכישה

בחר חבילת תוכנה המאפשרת שליטה בלתי תלויה בכל אחד מרכיבי החומרה, כגון מיקרו-מנהל.
1. יצירת קובץ התצורה: קובץ התצורה הוא ערכה שנשמרה של מכשירים והוראות שמיקרו-מנהל ייטען כדי להפעיל את חומרת המערכת. כדי ליצור קובץ תצורה, לחץ על כלים ≫ אשף קביעת תצורת החומרה.
  1. בשלב 1, לחץ על צור תצורה חדשה ≫ הבא כדי להמשיך. שים לב שהמשתמש יכול לבחור לשנות או לחקור תצורה קיימת אם קיים כבר זמין.
  2. בשלב 2, עיין ברשימת ההתקנים הזמינים כדי למצוא את ההתקנים ששולטים באמצעות מיקרו-מנהל, כגון מיקרוסקופ, מנורה, שלב, תריס ומצלמה. כאשר מודגש, לחץ על הוסף. .. כדי להוסיף את ההתקן לרשימת ההתקנים המותקנים. . זה יפתח חלון חדש
    1. ציין את תווית ההתקן בתיבה תווית . (למשל, מצלמת sCMOS)
    2. תחת ערך, בחר את יציאת ה-COM המתאימה עבור כל התקן. פעולה זו תגרום להופעת רשימה של מאפייני התקנים בתחתית החלון.
    3. השאר את מאפייני ההתקן בהגדרות ברירת המחדל. שים לב שערכים מותאמים אישית עבור כל מאפיין התקן עשויים להיות מוזנים כרצונך.
    4. לאחר הוספת כל התקן, לחץ על הלחצן הבא כדי להמשיך לשלב הבא. שים לב שבעת השארת התקנים שנותרו או שאין צורך לשנותם, ניתן לשנות את קובץ התצורה מאוחר יותר כמתואר בשלב 2.1.1.1.
  3. בשלב 3, השתמש בתפריטים הנפתחים כדי לבחור את מצלמת ברירת המחדל, התריס והמוקד בשלב. אם רצוי שתריס אוטומטי, לחץ על תיבת הסימון מתחת לרשימה הנפתחת של שלב המיקוד. אם כיוון המיקוד של השלב Z מוכר, בחר אותו מתוך הרשימה הנפתחת תחת כיווני מיקוד שלב (מתקדם). אחרת, השאר את ברירת המחדל כבלתי ידועה.
  4. בשלב 4, לחץ פעמיים על התיבות תחת הכותרת עיכוב [ms] להגדיר עיכובים המשויכים התקנים אוטומטיים כגון עיכובים של 100 ms עבור המנורה, הבמה, תריס, ו 250 ms עיכוב עבור פקודות למכלול כוונון מכני לחשבון עבור זמן מיתוג מכני בין מסננים.
  5. בשלב 5, הקצה תוויות עבור התקני המצב. קביעת התצורה של מערכת מיקרוסקופ עירור-סריקה משתמשת בתוויות בבלוק המסנן כדי לזהות כל קוביית מסנן פלואורסצנטית (לדוגמה , מצב 0 מתאים לתווית בהיר, קוביית המסנן הריקה המשמשת בהדמיית שדה בהיר; בעוד ש מצב 3 מתאים התווית 495 ננומטר ומותאם אישית 495 nm דיקרואיק פילטר הקוביה המשמש להפרדת עירור ואור פליטה ב 495 nm). תוויות משמשות גם במכלול כוונון מכני כדי לאחסן את הפקודות המעבר עבור כל אורך גל (g., מצב 0 מתאים ל340 ננומטר באורך גל כוונון הפקודה מכני כוונון).
  6. בשלב 6, לחץ על לחצן עיון לצד תיבת קובץ התצורה כדי לבחור מיקום שמירה ושם קובץ עבור קובץ התצורה. לחץ על ' סיום ' כדי לשמור את קובץ התצורה.
2. קבוצות אתחול והגדרות קבועות מראש: מיקרו-מנהל יכול לאחסן קבוצות שונות בתוך כל קובץ תצורה כדי להפעיל או לשנות קבוצת משנה של החומרה. לדוגמה, קבוצת ' אתחול מערכת ' ושילוב מוגדר מראש יאחסנו הגדרות ברירת מחדל כגון גודל ביננינג וקצבי בדיקה עבור המצלמה.
  1. צור קבוצה (לדוגמה, מערכת) על-ידי לחיצה על + בחלון הראשי בסעיף הקטן של הקבוצה.
  2. האם לבדוק שימוש כלשהו בקבוצה? בתוך הקבוצה שתדרוש ערך ברירת מחדל להגדרה (לדוגמה, במצלמת ברירת המחדל המשויכת).
  3. צור הגדרה מראש חדשה (לדוגמה, "Startup") על-ידי לחיצה על + בחלון הראשי בסעיף הקטן הקבוע מראש.
  4. כל תיבה שהוכנסה בשלב 2 תופיע כאפשרות מוגדרת מראש כאן. בחר ערך ברירת מחדל שייטען עבור כל אחת מהתיבות שסומנו.
3. קבוצה והגדרות קבועות מראש עבור אורכי גל עירור: מיקרו מנהל מתייחסת לכל עירור גל כערוץ משלו עם זה הפקודה מיתוג אורך הגל שלה; לכן, יש לשמור כל אחד מהם כקביעה מוגדרת מראש.
  1. צור קבוצה חדשה כדי להכיל קבוצה של אורכי גל עירור הרצוי (למשל, "495 nm דיקרואיק")
  2. האם לבדוק את השימוש ב-Group? box בשם ' תווית ' המתאימה להתקן vf-5.
  3. צור מוגדרת מראש חדשה בשם עבור כל אורך הגל (למשל, "340 nm").
  4. הקצה לכל אחד מקביעות שם המאפיין המתאים והערך הקבוע מראש (לדוגמה, שם מאפיין: "תווית"; ערך מוגדר מראש: "340 nm").
4. כלי רכישה רב מימדי: לחץ עלAcq רב-ממדי.ליד החלק העליון השמאלי של החלון מיקרו מנהל לפתוח כלי להתאמה אישית להשתמש עבור לכידת תמונה של המדגם בכל גל עירור עם לחיצה של לחצן יחיד. ישנן מספר אפשרויות התאמה אישית כדי לבנות את הרכישה בדיוק כפי שנדרש.
  1. נקודות זמן (לא נעשה בהן שימוש בדוגמה זו): ללימודים ללא רכיב השגות בזמן, השאר את התיבה לא מסומנת. , אם יש צורך במחקרים בזמן. תבדקו את התיבה הזאת אם מסומנת, הזן את מספר הפעמים שיש לבצע את שאר הגדרות הרכישה בתיבה מספר . הגדר את הזמן בין רכישות עוקבות על-ידי הזנת המשך בתיבה מרווח ובחירת היחידה המתאימה (אלפיות שניה, שניות או דקות; בדרך כלל שניות).
  2. מספר תפקידים (XY; לא בשימוש בדוגמה זו): למחקרים של מיקום XY בודד, השאר את התיבה לא מסומנת. אם רצוי מספר מיקומי XY, בדקו את התיבה ולחצו על הלחצן ' עריכת רשימת מיקומים ' כדי לפתוח חלון נפרד. הזז את השלב לכל מיקום רצוי ולחץ על לחצן סמן כדי לשמור את המיקום בתוכנה. חזור על הפעולה עד שכל מיקומי XY הרצויים יסומנו. סגור חלון זה כדי להמשיך.
  3. Z-ערימות (שקופיות; לא בשימוש בדוגמה זו): למחקרים של מיקום Z בודד, להשאיר את התיבה לא מסומנת. אם מספר מיקומי Z רצוי, בדוק את התיבה. הזיזו את השלב לתנוחת Z הרצויה ולחצו על הלחצן ' קבע ' שליד תיבת ההתחלה Z . הזז את השלב לתנוחת הסיום הרצויה של Z ולחץ על לחצן קבע לצד תיבת Z-end . הזן את גודל השלב הרצוי (במייקרון) בתיבה Z-step .
  4. ערוצים: ודא שהתיבה ערוצים מסומנת. כאן, ערוצים הם השמות הניתנים לאורכי גל עירור הפרט. זמין "ערוצים" מתאימים "קבוצות" המתוארים בשלבים 2.1.2 ו 2.1.3.
    1. קבוצה: לחץ על הרשימה הנפתחת כדי לבחור קבוצה ממנה ניתן לבחור אורכי גל עירור (לדוגמה, 495 nm דיקרואיק).
    2. לחץ על התיבה לשמור על תריס פתוח כדי לשמור על התריס פתוח בין רכישות עבור כל ערוץ. לתשומת לבך, התריס ייסגר בין סריקות ספקטרליות עוקבות אם תיבה זו מסומנת, בהנחה שהאפשרות ' תריס אוטומטי ' נבחרה גם היא בחלון הראשי.
  5. לחץ על הלחצן החדש כדי להוסיף ערוצים לרשימת הרכישות. שים לב שניתן להשתמש בלחצן Remove כדי להסיר ערוצים שאינם רצויים עוד ושניתן להשתמש באפשרות ' למעלה ולמטה ' כדי לסדר מחדש את כל הערוצים שנבחרו.
    1. האם לוודא כי השימוש? תיבת סימון נבחרה עבור כל אורך גל רצוי בסריקה ספקטרלית.
    2. קביעת תצורה: לחץ על הרשימה הנפתחת תחת קביעת התצורה ובחר את הגל הראשון בטווח הספקטרלי הרצוי (למשל, 340 nm).
    3. חשיפה: לחץ פעמיים על התיבה תחת חשיפה וקלט את זמן החשיפה הרצוי עבור אורך הגל הנבחר (למשל, "100" עבור 100 ms). ראה סעיף 5 ("רכישת נתונים") להצעות לבחירת זמני חשיפה מתאימים.
    4. היסט Z (לא ישים בסריקה ספקטרלית): השאר תיבה זו ריקה (ב -0) בעת ביצוע סריקה ספקטרלית.
    5. Z-מחסנית: להבטיח כי תיבה זו מסומנת עבור כל אורך גל בטווח ספקטרלי אם ביצוע מחסנית Z.
    6. סקיפ Fr. (לא ישים בסריקה ספקטרלית): השאר תיבה זו ריקה (ב -0) בעת ביצוע סריקה ספקטרלית. שים לב כי זה עשוי להיות שימושי באופן סלקטיבי לדלג על מסגרות במקרה אחד או כמה אורכי גל עירור משמעותית יותר מאשר אחרים או אם אורכי גל של עירור הפרט להיות פוטורעילים במיוחד.
    7. צבע: להשאיר את התיבה הזאת ריקה בעת ביצוע סריקה ספקטרלית. לתשומת לבך, ניתן לבחור צבעים לרצועות בודדות של אורך הגל למטרות ויזואליזציה של נתונים, אך הצבע אינו מתאים לערבוב הרפאים העוקב.
    8. חזור על השלבים הבאים עד להוספת כל אורך הגל הרצוי בטווח הסריקה הספקטרלי הנתון.
  6. הזמנת רכישה: לחץ על הרשימה הנפתחת כדי לבחור את הסדר שלעיל (2.1.4.1-2.1.4.5) תתבצע. לסריקות ספקטרליות כמו זה שמוצג כאן, סדר הרכישה הוא פשוט ערוץ. שים לב שאפשרויות נוספות מופיעות כתיבות נוספות נבדקות בתוך כלי הרכישה הרב-מימדי [נקודות זמן, מיקומים מרובים (XY) ו-Z-ערימות (פרוסות)) ומאפשרות לבחור את המיקום או הזמן הראשון, ואחריו פרוסה או ערוץ.
  7. פוקוס אוטומטי (לא נעשה שימוש בדוגמה זו): אם נבחר מספר תפקידים (XY) , כמה סגנונות שונים של התמקדות אוטומטית זמינים. לחץ על לחצן אפשרויות ובחר שיטה פוקוס אוטומטי מתוך הרשימה הנפתחת לצד לחצן סגור .
  8. תקציר: סקור חלון זה לסיכום של מספר נקודות הזמן, מיקומי XY, פרוסות Z, ערוצים, מספר כולל של תמונות, זיכרון מוחלט, משך סריקה והזמנת רכש כדי להבטיח שהמידע המפורט יתאים להגדרות הרכישה הצפויות.
  9. שמור תמונות: ודא שהתיבה זו מסומנת כדי לשמור את הנתונים שנאספו באמצעות הכלי ' רכישה מרובת מימדים '.
    1. לחץ על... ליד ספריית הבסיס לספריה כדי לבחור ספריית בסיס לספריה שבה יישמרו הקבצים. נקוב בספריית הבסיס באופן שמתאר את הפרטים הרלוונטיים של הניסוי (לדוגמה, GCaMP שריר האוויר החלק תאים שרירים).
    2. הזן שם בתיבה לצד קידומת שם המתארת את רכישת התמונה הנוכחית (לדוגמה FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). מומלץ ליצור קידומת שם המזהה את שדה התצוגה ואת זמן החשיפה, כמו גם מידע רלבנטי אחר כגון האובייקט והמסנן דיקרואיק שבשימוש. שים לב שערימת התמונות הראשונה שצולמה באמצעות הגדרות אלה תישמר עם "_ 1" בעקבות קידומת השם. כל המחסנית הבאה שצולמה באמצעות שורש ספריה זהה וקידומת שם תישמר עם "_ n", שבה "n" הוא מספר הפעמים שבהן מחסנית צולמה עם שם זה בספריה.
    3. לחצו על ' הפרד קובצי תמונה ' כדי לוודא שהתמונה שנוצרת בכל אחד מהעירור של הגל נשמרת.
  10. שמירה בשם: לחץ על לחצן שמור כ..., ליד הימנית העליונה של כלי הרכישה הרב-מימדי כדי לשמור את הגדרות הרכישה הללו לשימוש עתידי קל. שים לב כי גם הקידומות של ספריית הבסיס והשמות של הספריות יישמרו.
  11. לרכוש: לבסוף, לחץ על לרכוש! כדי להתחיל ברכישת תמונות בהתאם להגדרות הרכישה שנבחרו לעיל.

3. תיקון התגובה ספקטרלי (אופציונלי):

ניתן לבצע תיקון הפלט הספקטרלי כדי לכייל את התגובה הספקטרלית של המערכת לתקן ידוע, כגון מנורה שניתן לטפל בהם או מכשיר אחר למעקב אחר נשים. שלב זה חשוב במיוחד אם התוצאות מושוות עם כלי דימות ספקטרלים אחרים, ספקטרומטרים, או בין מעבדות שונות. תהליך זה דווח בפירוט בעבר²¹^,²³.
1. השתמש בספקטרומטר ספקטרומטרי למקור אור הנמצא על-ידי רופא (כגון LS-1-CAL-INT, אופטויית האוקינוס) או תקן אחר למעקב אחר לרכישת הכוח הספקטרומטר של התאורה כפי שנמדד בשלב המדגם. בצע תיקון נפרד עבור כל שילוב של הגדרת מקור אור, דיקרואיק mirror ואובייקטיבי. השתמש כדור שילוב ביחד את ספקטרומטר כדי למדוד במדויק תאורה רחבת זווית מתוך מטרת המיקרוסקופ.
2. השתמש בשיטת שילוב, כגון כלל הטרפז, כדי לשלב את הנתונים הספקטרומטרים מעל אורכי גל מוארים. רוחב פס של 40 ננומטר לאינטגרציה המרוכז סביב אורך הגל המרכזי מספיק עבור רוב המסננים בעלי רוחב פס נומינלי של בין 14-20 ננומטר ברוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM). הערך המשולב מייצג את עוצמת ההארה הספקטרלית בכל להקה באורך גל עירור.
3. להתוות את העוצמה המשולבת של כל להקה באורך הגל כפונקציה של מרכז עירור של הגל כדי לאפשר ויזואליזציה של הפרופיל עוצמת התאורה ספקטרלית.
4. קבע את פס אורך הגל עם העוצמה המשולבת הנמוכה ביותר.
5. לנרמל את פרופיל עוצמת התאורה ספקטרלי על ידי חלוקת העוצמה המשולבת הנמוכה ביותר על ידי העוצמה המשולבת של כל פס אורך הגל כדי ליצור גורם תיקון תלוי אורך הגל.

4. הכנה לדוגמא

הכן דגם "ריק" (לדוגמה, הציבו שמיכות זכוכית בתא התא והוסיפו 1 מ ל של מאגר). מאגר זה תואר בעבר²⁴.
הכן מדגם ללא תווית כדי לקבוע את המדגם האוטומטי לדוגמה (למשל, מניחים שמיכות זכוכית המכילות תאים שריר בלתי מסומן בדרכי הנשימה החלקה²⁵^,²⁶ בתא התא ולהוסיף 1 מ ל של מאגר).
הכן דוגמה נפרדת המסומנת בתווית אחת עבור כל תווית פלורסנט המשמשת בניסוי באופן הבא:
1. הוסף תווית מיטוכונדריאלי מדולל למאגר כדי להשיג ריכוז 100 ננומטר. הוסף את המאגר הזה לcoverslip המכיל תאים השריר חלקה הנשימה. דגירה של 20 דקות ב 20-25 ° c. העבר את הכיסויים לתא התא והוסף 1 מ ל של מאגר. שים לב כי הריכוז האופטימלי של תווית מיטוכונדריאלי ישתנה על-ידי גורמים כגון יצרן, צבע משויך וספציפיות.
2. להעביר שמיכות המכיל את דרכי הנשימה תאים השריר חלקה מזוהמים עם בדיקה GCaMP²⁷ לחדר התא ולהוסיף 1 מ ל של מאגר.
הכן דוגמית ניסיונית אחת או יותר המכילה תערובת של תוויות הפלורסנט הרצויות.
1. להוסיף 1 מ ל של מאגר (100 nM הריכוז של התווית מיטוכונדריאלי) כדי coverslip המכיל תאים השריר החלקה דרכי הנשימה מזוהמים עם בדיקה GCaMP ו דגירה עבור 20 דקות ב 20-25 ° c. העבר את הכיסויים לתא התא והוסף 1 מ ל של מאגר.

5. רכישת נתונים:

בדוק כי דיקרואיק beamsplitter נאותה (למשל, 495 ננומטר דיקרואיק מסנן קוביית), המטרה (למשל, 60x מטרת המים), ומצלמה (sCMOS מצלמה) נבחרו.
. העמיסו את הדגימה על הבמה
לחץ פעמיים על התיבה הסמוכה לחשיפה [ms] והקלד "100" כדי לקבוע את זמן החשיפה ב-100 Ms. שים לב שייתכן שיהיה צורך להגדיל או להקטין את זמן החשיפה בהתאם לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המדגם.
בחר 475 ננומטר מהתפריט הנפתח של החלון הראשי של מיקרו-מנהל עבור הצגה ראשונית של המדגם. שים לב כי 475 ננומטר לא יכול להיות אורך הגל האופטימלי עבור צפייה לדוגמה או קביעה אם הרוויה תתרחש ברחבי מחסנית תמונה.
לחץ על Live כדי להציג את הדוגמה.
1. לחץ על לחצן טווח הצפייה בעוצמה אוטומטית ליד ההיסטוגרמה בתחתית החלון כדי להביא את הערכים המינימליים והמרביים לטווחים חזותיים משמעותיים.
השתמש בידיות המיקוד של המיקרוסקופ כדי להתמקד במדגם. לעתים קרובות שימושי למצוא את הקצה של המדגם כדי לסייע בהתמקדות. הדוגמה תהיה ממוקדת כאשר תכונות הקצה בתמונה מופיעות בחדות. שים לב כי ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על כפתור אוטומטי מספר פעמים במהלך התמקדות לסייע בהצגת התמונה הפלואורסצנטית. בנוסף, משתמשים מסוימים עשויים למצוא את זה קל יותר להתמקד במדגם אם המיקרוסקופ הוא במצב שידור.
1. אם התמקדות במצב שידור, לצורך בטיחות, תחילה ודא כי מקור האור הספקטרלי אינו משדר אור לעיניים לפני התאמת נתיב האור לדימות השידור. כמו כן, שים לב שייתכנו סטיות קטנות בין מוקד השידור לבין תמונות הקרינה הפלואורסצנטית. כאשר ההתמקדות המקובלת הושגה, הגדר את הנתיב האור עבור הדמיה פלואורסצנטית ספקטרלי.
לחץ על ה- Acq הרב-ממדי. בסמוך לקצה השמאלי העליון של החלון כדי לפתוח את כלי הרכישה הרב-מימדי (המתואר והוגדר בסעיף 2).
בחר טווח ספקטרלי מתאים לרכישת ספקטרלי (למשל, 360-485 nm עבור 495 nm דיקרואיק פילטר) על ידי לחיצה על הלחצן טען. ...... בפינה הימנית העליונה של חלון כלי הרכישה רב-מימדי וניווט להגדרות עירור נשמר בעבר (בשלב 2.1.4.10). עיין בדיון לקבלת מידע בנוגע לטווחים ספקטרלי מתאימים.
לרכוש תמונה ברקע/ריק שאינה מכילה נתונים בעלי קרינה לשימוש ברקע ובחיסור רעש. ניתן לבצע זאת באמצעות מדגם ריק (שלב 4.1) או על-ידי ניווט לאזור ריק של דגימה ניסיונית. כפי שמתואר בשלב 5.6, זה מושגת בקלות ביותר על ידי מציאת קצה המדגם ולאחר מכן מיקום אותו כך את הקצה ממורכז בתוך שדה התצוגה.
1. לאחר שהגדרות הרכישה מאושרות ואזור רקע גלוי, לחץ על הלחצן לרכוש כדי לרכוש מחסנית תמונה ספקטרלית המכילה רקע ורעש לשימוש עבור חיסור מאוחר יותר. יש לציין כי הדגימות עשויות להיות במרחק של יותר פלואורסצנטית אינטנסיבי יותר מקצה המדגם. ייתכן שיהיה מומלץ לעבור לדוגמה כדי למצוא את האזורים "המבריקים" ולבצע מספר ערימות של תמונות בדיקה כדי לקבוע את זמני הרכישה המתאימים ולהימנע מחשיפה יתר.
קח מחסנית תמונה בודדת על אזור של המדגם שנראה שיש לו פלואורסצנטית אינטנסיבי כדי להבטיח שאין שילוב של אורכי גל ושעות החשיפה האלה יגרמו לחשיפת יתר.
השתמש ב-ImageJ כדי לוודא שאורכי גל אינם מכילים פיקסלים שנחשפו ביתר.
1. ב-ImageJ, לחץ על קובץ ≫ ייבוא ≫ רצף התמונות ונווט לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות שצולמו בשלב 5.10. . זה יפתח חלון חדש לחץ על התיבה הסמוכה למספר התמונות והזן את מספר אורכי הגל הנכללים בסריקה הספקטרלית (לדוגמה, 26). השאר את התמונה מתחילה וגדל בתור "1". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך.
2. לחץ על המקלדת כדי להשתמש בפונקציה מדידה של imagej. ודא שהמספר המפורט תחת מקסימום אינו מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה (לדוגמה, 65,535). חזור על כל תמונה. בסריקה הספקטרלית שים לב כי מגבלת הזיהוי של המצלמה תלויה במצלמה עצמה. הגבול העליון מוצג בחלק הימני העליון של ההיסטוגרמה בחלון הראשי של MicroManager. לחלופין, ניתן לקבוע את המגבלה העליונה על-ידי פתיחת תמונה ב-ImageJ וניווט לתמונה > התאם > בהירות/ניגודיות. לחץ על לחצן Set בחלון המוקפץ המתקבל, הזן ערך גדול מדי (לדוגמה, 999,999) בפריט הריק שליד הערך המירבי המוצגולחץ על אישור כדי להמשיך. הערך המירבי המוצג בהיסטוגרמה החדשה צריך להיות מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה.
3. אם כל התמונות הכילו את מגבלת הזיהוי העליון של המצלמה (למשל, 65,535), להתאים את זמן החשיפה של הסריקה ספקטרלי כדי להבטיח כי האות המקסימלי ברחבי טווח ספקטרלי לא יעלה על הטווח הדינמי של המצלמה.
לרכוש נתוני תמונה ספקטרלי מדגימות ללא תווית כדי לקבוע כל פלואורסצנטית אוטומטי. לרכוש את הסריקה עבור דגימות ללא תווית באמצעות טווח גל זהה הגדרות המצלמה כמו שאר הניסוי (למשל, 360-485 nm ב 100 ms לאורך גל).
לרכוש נתונים ספקטרלי תמונה מדגימות חד התווית להשתמש כפקדים ספקטרלי לבנות את הספרייה ספקטרלית. בצע את הסריקה עבור כל תווית באמצעות טווח אורך-גל זהה, זמן חשיפה והגדרות מצלמה. שים לב לכך שזמן רכישה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מסוימות כדי לאפשר זיהוי מדויק של ספקטרום תוויות עם תרומת רעש מינימלי.
לבצע מדידות על מדגם ניסיוני (למשל, האדם החלקה בדרכי הנשימה תאים שרירים עם בדיקה GCaMP התווית מיטוכונדריאלי).
1. מקם שקופית או כיסוי המכיל את המדגם הניסיוני במיקרוסקופ.
2. בחר שדה תצוגה עם תאים בעלי תוויות כראוי של רקמות.
3. לרכוש את נתוני התמונה ספקטרלי באמצעות הגדרות הרכישה הרצויה, כפי שמתואר לעיל.

6. ניתוח תמונה

לתקן את התמונות לתגובה ספקטרלית שטוחה.
1. הפחת את ספקטרום הרקע שהושג בסעיף 5.9 והכפל על-ידי מקדם התיקון שנקבע בסעיף 3.1.5. ניתן לעשות זאת באמצעות script פשוט של MATLAB או שגרת ImageJ. חיסור/תיקון קוד MATLAB (בשימוש בדוגמה זו) זמין באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה Bioimaging משאבים.
  1. טען את קוד החיסור/תיקון ב-MATLAB.
  2. בכרטיסיה עורך, לחץ על הפעלה. פעולה זו תפתח חלון חדש המכיל לחצן תיקון Bsq . לחץ על הלחצן b תיקון רבוע כדי לפתוח חלון אחר המכיל אפשרויות לעבודה בספריה, קובץ רקע, קובץ פקטור תיקון ותיקיית tiff שלא תוקנה.
    1. השתמש בעיון. .. ליד ' ספריית עבודה ' כדי לבחור את נתיב הקובץ שבו ייפתחו החלונות הבאים. נווט אל התיקיה המכילה את קשת הרקע השמורה (בתבנית. dat).
    2. השתמש בעיון. .. ליד קובץ רקע (. dat) כדי לפתוח את הספריה שנבחרה בשלב 6.1.1.2.1 ולבחור את קובץ הרקע הרצוי (בתבנית. dat). לחץ על לחצן פתח כדי להמשיך.
    3. השתמש בלחצן עיון.. ., ליד פקטור תיקון (. dat) כדי לבחור פקטור תיקון. הספריה עבור ברירות המחדל של פקטור התיקון למיקום של קוד האב MATLAB. במקרה הצורך, נווטו לתיקיית המשנה המכילה את קובץ פקטור התיקון (בתבנית. dat). סמן את קובץ פקטור התיקון המתאים ולחץ על הלחצן פתח (Open) כדי להמשיך.
    4. השתמש בלחצן עיון ..., ליד תיקיית Tiff לא מתוקנת כדי לפתוח את הספריה שנבחרה בשלב 6.1.1.2.1 ולבחור את התיקייה לחיסור רקע ותיקון תמונה (זו בדרך כלל התיקיה Pos0 המכילה מיד את החומר הגולמי תמונות ספקטרליות). לחץ על לחצן פתח כדי להמשיך.
    5. לחצו על הלחצן ' לחץ לתיקון ספקטרלי '. לאחר השלמת העיבוד, נפתח חלון עם ההודעה "תיקון Bsq הושלם". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך. תמונות תיקון מאוחסנות בתיקיה חדשה בשם עם התיקייה המקורית raw התמונה, ועוד "_ מתוקן" (למשל, Pos0_Corrected).
. צור את הספרייה הספקטרלית ניתן להשתמש במספר חבילות תוכנה כדי לחלץ נתונים ספקטרלי מתמונות, כולל ImageJ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנרמל כל endmember לרצועת אורך הגל של העוצמה הגדולה ביותר על ידי קביעת הלהקה באורך הגל יש את הערך האינטנסיבי ביותר וחלוקת המדידה בכל פס אורך הגל לפי ערך מרבי זה. יש לציין שפקדים בעלי תווית אחת שנוצרו באמצעות דוגמיות פלורסנט יזדקקו לשינויים נוספים²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³². ראה שלב 6.2.4 ודיון לקבלת פרטים.
1. ב-ImageJ, לחץ על קובץ ≫ ייבוא ≫ רצף תמונות. . זה יפתח חלון חדש נווטו לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות המתוקן. לחץ פעמיים על קובץ תמונה כלשהו בתיקיה כדי לפתוח חלון חדש. לחץ על התיבה הסמוכה למספר התמונות והזן את מספר אורכי הגל הנכללים בסריקה הספקטרלית (לדוגמה, 26). השאר את התמונה והגדל אותו כ-"1". לחץ על אישור לחצן כדי להמשיך.
2. בחלון הראשי ImageJ, לחץ על סמל בחירת המצולע ולאחר מכן השתמש במצביע העכבר על-ידי לחיצה על התמונה כדי ליצור מצולע סביב אזור המכיל נתונים בעלי קרינה פלואורסצנטית. שים לב שייתכן שאין מידע מועט ביותר באורך הגל ההתחלתי. נווט לתמונה באורך גל אחר ו/או השתמש בכלי בהירות/ניגודיות (תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות ≫ אוטומטי) כדי להמחיש בצורה טובה יותר אזורים המכילים נתונים בעלי התעניינות בקרינה.
3. כאשר המצולע מצויר, צור את הפרופיל של ציר Z על-ידי לחיצה על תמונה ≫ ערימות > מתווה z-פרופיל ציר. . זה יפתח חלון חדש לחץ על ' שמור ' כדי לשמור את הנתונים הספקטרלי כקובץ csv.
4. לבצע חיסור כדי להבטיח ספרייה ספקטרלית נכונה עם תוויות טהור נטול זיהום באמצעות הקרינה האוטומטית. השתמש במשוואה הבאה²⁹ כדי לבודד ספקטרום טהור מערבוב של תווית אחת וקרינה פלואורסצנטית:
  1
  כאשר: s_טהור הוא הספקטרום הטהור של התווית, s מעורב הוא הספקטרום נמדד של המדגם מזוהם עם פלואורסצנטית אוטומטי, s _אוטופל הוא הספקטרום של אור הזריחה נמדד, "a" הוא שיטתי מכפיל של ספקטרום הקרינה האוטומטית (בין 0 ל-1; לדוגמה, 0.4) ו-"היסט" הוא היסט (בדרך כלל 0). שנה את המונח "a" עד שערך כמעט אפס מושגת עבור התרומה הנראית לעין של פלואורסצנטית אוטומטי. מידע נוסף ניתן למצוא במספר פרסומים²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³².
הסרת מיקס של נתוני התמונה הספקטרלית. שלב ללא ערבוב יפיק תמונה שפע עבור כל תווית פלורסנט, שבו שפע הוא כמות האות הניאון היחסי בתמונה מתווית בהתאמה. מספר אלגוריתמים שאינם מתערבבים זמינים לשימוש עם imagej³³^,³⁴^,³⁵. בנוסף, קוד MATLAB ספקטרלי בלתי מתערבב (בשימוש בדוגמה זו) זמין באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה Bioimaging משאבים. סקירה מקיפה יותר של unmixing ספקטרלי זמין³⁶.
1. העמיסו את קוד הערבוב. הספקטרלי בMATLAB
2. ערוך את אורך הגל. mat וספריה. mat קבצים כדי להתאים את התנאים הניסיוניים (למשל, "אורך הגל" כמו 360-485 בהפרשים של חמישה).
  הערה: יש לטעון את הערכים המתאימים לאורכי גל אלה לתוך "ספריה" עבור כל תווית פלורסנט (וללא התאמה אוטומטית). Endmember_Name צריך לפרט את התוויות בסדר זהה לזה של ערכי העמודות של "Library". שים לב שהקובץ Library. mat אמור לכלול גם משתני "ספריה" ו-"Endmember_Name".
3. בכרטיסיה עורך, לחץ על הפעלה. פעולה זו תפתח חלון חדש המאפשר למשתמש לבחור בספריה. נווטו לתיקייה המכילה את התמונות הספקטרליות שאינן מעורבות. לאחר שנבחר, פעולה זו תפתח חלון חדש.
4. במקומות הריקים התוצאות, הזן את שם התמונה (לדוגמה, HASMC עם GCaMP ו-Mito FOV1), מספר הלהקות של אורך הגל (לדוגמה, 26), מספר נקודות הזמן (לדוגמה, 1) והאם הצורך במדידה מדידה (לדוגמה, n) במקומות הריקים שלהם. אם נבחר "n" עבור הפונקציה, השאר את שני הריקים ריקים. לחץ על אישור כדי להמשיך, אשר יפתח חלון חדש.
5. Naviagate לתיקיה המכילה את הקובץ אורך הגל. mat. לאחר שנבחרו, לחצו על ' פתח להמשך ', שיפתח חלון חדש.
6. נווט אל התיקיה המכילה את הקובץ Library. mat. לאחר שנבחר, לחץ על פתח כדי להמשיך, אשר לשמור את התמונות ללא מעורבות בתיקייה חדשה "unmixed עורב" בתוך הספרייה המכילה את התמונות ספקטרליות.
בדקו את התמונות הספקטרליות הבלתי מעורבבות לאיכות.
1. פתח כל תמונה שאינה מעורבת כדי לבדוק חזותית את התפלגות הרכיבים הטהורים.
  1. השווה את גודל תמונת השגיאה לאלה של התמונות הבלתי מעורבות (בדומה לשלב 5.11, ניתן לעשות זאת באמצעות הפונקציה מדידה של imagej). אם הגודל של תמונת השגיאה דומה בסדר גודל לתמונות שפע שאינו מעורב, סביר להניח כי יש אותות נתוני התמונה ספקטרלים שאינם מתומחרים במדויק על ידי הספרייה ספקטרלית ואת תהליך הערבוב ספקטרלי ליניארי.
  2. השווה את תמונת השגיאה לתמונות שלא התערבבו כדי לראות אם קיימים מבנים שיורית לא מזוהים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר צעדים חשובים מפרוטוקול זה נחוצים כדי להבטיח את אוסף הנתונים שהוא גם מדויק ונטול הדמיה וחפצים ספקטרליות. דילוג על שלבים אלה עלול לגרום לנתונים הנראים משמעותיים אך לא ניתן לאמת או לשכפל עם כל מערכת הדמיה ספקטרלית אחרת, ובכך לבטל את כל המסקנות שנעשו עם הנתונים אמר. הראשי בין הצעדים החשובים האלה הוא תיקון הפלט ספקטרלי הנכון (סעיף 3). גורם התיקון מפצה על וריאציות תלויות אורך הגל בפלט הספקטרלי של מערכת העירור. זה מושגת על ידי שינוי אורכי גל עם עירור כוח גבוה כגון כוח התאורה האופטי הוא המקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש האופטימלי של הגדרת הדמיה היפרספקטקטרלית בסריקת עירור מתחיל בבניית הנתיב האור. בפרט, בחירה של מקור אור, מסננים (tunable ו דיקרואיק), החלפת מסנן שיטה, ומצלמה לקבוע את טווח ספקטרלי זמין, מהירות סריקה אפשרית, הרגישות גלאי, ודגימה מרחבית. מנורות מרקורי קשת מציעים רבים באורך גל הפסגות אבל לא מספקים פלט ספקטרלי שטוח ידרוש הפחתת אות משמעותית על פסגות הפלט כדי לתקן את נתוני התמונה הספקטרלית בחזרה לתגובה רופא ממעקב³⁸. מקורות אור חלופיים, כגון מנורות Xe ארק ולייזרים אור הרצף הלבן, עשוי לספק פלט ספקטרל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר Leavesley ו ריץ לחשוף את האינטרס הפיננסי בחברת סטארט-up, SpectraCyte ייט LLC, הוקמה כדי לסחור טכנולוגיה הדמיה ספקטרלית.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר בתמיכה של NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, וקרן אברהם מיטשל לחקר הסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי שריר חלק בדרכי הנשימה	מחלף מחקר מחלות לאומי (NDRI)	מבודד מרקמות ריאה אנושיות המתקבלות מ- NDRI	תאים אוטופלואורסצנטיים מאוד, רגישים לסידן
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	תריס הניתן לשליטה מרחוק כדי למזער הלבנת אור
שלב אוטומטי	H177P1T4 מדעי קודם		שלב הניתן לשליטה מרחוק לשדה ראייה מרובה אוטומטי או איסוף תמונות תפור.
בקר במה אוטומטי (XY)	קדם מדעי	Proscan III (H31XYZE-US)	לממשק שלב אוטומטי עם מחשב וג'ויסטיק
מאגר	תוצרת הבית		145 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 20 מ"מ HEPES, 10 מ"מ D-גלוקוז, 1 מ"מ MgCl₂, ו-1 מ"מ CaCl₂, ב-pH 7.3
תא	ThermoFisher Scientific	Attofluor, A7816	מחזיק כיסוי המורכב מפלדת אל חלד כירורגית וטבעת O מגומי לאיטום במדיה ומניעת זיהום דגימה ו/או אובייקטיבי
מסנני עירור	Semrock Inc.	TBP01-378/16	טווח אורכי גל מרכזי (340-378 ננומטר), רוחב פס (מינימום 16 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	טווח אורכי גל מרכזי (360-400 ננומטר), רוחב פס (מינימום 16 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	טווח אורכי גל מרכזי (400-448.8 ננומטר), רוחב פס (מינימום 15 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	טווח אורכי גל מרכזי (448.8-501.5 ננומטר), רוחב פס (מינימום 15 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	טווח אורכי גל מרכזי (501.5-561 ננומטר), רוחב פס (מינימום 14 ננומטר, FWHM נומינלי 20 ננומטר), מקדם שבירה (1.83)
קוביית מסנן פלואורסצנטי מפצל קרן דיכרואי	Semrock Inc.	FF495-Di03	מפריד בין אור עירור ופליטה ב-495 ננומטר (>98% השתקפות בין 350-488 ננומטר, >93% שידור בין 502-950 ננומטר), אינדקס אפקטיבי של מסנן (1.78)
קוביית מסנן פלואורסצנטי מסנן לונגפס מסנן	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	מאפשר מעבר של אור ארוך מ-496 ננומטר (>93% שידור ממוצע בין 503.2-1100 ננומטר), מקדם שבירה (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; פלסמיד #22692	מחוון סידן מקודד גנטית מבוסס GCaMP2 באורך גל יחיד
שילוב	אופטיקה של אוקיינוס	FOIS-1	משמש למדידה מדויקת של תאורה בזווית רחבה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מיקרוסקופים הפוכים	של Nikon Instruments	TE2000	מאפשרים עירור ישיר של דגימה ללא צורך לחדור לשכבות של מדיה ו/או רקמה.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	תוויות מיטוכונדריה
מנורת כיול ניתנת למעקב NIST	אופטיקה אוקיינוס	LS-1-CAL-INT	מנורה עם ספקטרום ידוע לשימוש כתקן
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	לאימות תגובה ספקטרלית מתאימה של המערכת
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	תוויות גרעיני תאים
אובייקטיבי (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	שימושי לשדות ראייה גדולים
אובייקטיבי (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	משמש לרוב עבור דגימות רקמות
אובייקטיבי (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	משמש לרוב לדגימות תאים
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	לרכישת תמונות דיגיטליות ברגישות גבוהה
ספקטרומטר	אופטיקה אוקיינוס	QE65000	משמש למדידת תפוקה ספקטרלית של מערכת ספקטרלית סריקת עירור
מחליף מסנן מתכוונן	מכשיר סאטר	Lambda VF-5	יחידה ממונעת לכוונון אוטומטי של מסנן עירור / החלפת
מנורת קשת קסנון	טכנולוגיות Sunoptic	Titan 300HP מקור	אור מקור אור עם תפוקה ספקטרלית אחידה יחסית

תא כדור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901(2013).
Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901(2014).
Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802(2018).
Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034(2018).
Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518(2018).
Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207(2005).
Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601(2007).
Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614(2014).
Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017(2014).
Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M(2019).
Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B(2019).
Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spectral Unmixing Micromanager Image J MATLAB

עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים