מאמר שיטה

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59449

⸱

22 במאי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Neuroscience, University of Virginia School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

תקציר

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא אקראי השתקה של כרומוזום X אחד אצל נקבות כדי להשיג איזון המינון הגנטי בין המינים. כתוצאה מכך, כל הנקבות מheterozygous ביטוי גנטי מקושר ל-X. אחד הרגולטורים המפתח של XCI הוא Xist, אשר חיוני עבור ייזום ותחזוקה של xci. מחקרים קודמים זיהו 13 משחק טרנס כרומוזום X בכרומוזום הפעלה (XCIFs) באמצעות בקנה מידה גדול, אובדן הפונקציה של המסך הגנטי. עיכוב של XCIFs, כגון ACVR1 ו-PDPK1, באמצעות מעכבי מולקולת ה-RNA או מולקולה קטנה, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים כרומוזום X בתאים מתורבתים. אבל הכדאיות והסבילות של הפעלה מחדש של כרומוזום X לא פעיל בvivo שרידים להיקבע. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר עם xci שאינם אקראיים בשל מחיקה של xist על כרומוזום X אחד. באמצעות מודל זה, היקף ההפעלה הפעילה של X לא פעיל היה כימות במוח העכבר לאחר הטיפול עם מעכבי XCIF. תוצאות שפורסמו לאחרונה להראות, בפעם הראשונה, כי עיכוב תרופתי של XCIFs מפעיל מחדש Mecp2 מן כרומוזום X לא פעיל בנוירונים בקליפת המוח של העכבר החי.

מבוא

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא תהליך של פיצוי המינון המאזן ביטוי גנים מקושר X על ידי השתקה עותק אחד של כרומוזום X אצל נקבות1. כתוצאה מכך, כרומוזום X לא פעיל (Xi) מצטבר תכונות אופייניות של הטרוכרוטין כולל מתילציה DNA ומעכבות שינויים היסטון, כגון היסטון H3-ליזין 27 הטריתילציה (H3K27me3) ו H2A ההיסטון (H2Aub) 2. הרגולטור הראשי של כרומוזום x השתקה הוא מרכז x-inactivation פעלה (Xic) אזור, סביב 100 לערך 500 kb, אשר שולט את הספירה ואת הזיווג של כרומוזומים X, הבחירה האקראית של כרומוזום x עבור inactivation פעלה, ואת החניכה ו הפצת שהשתקה לאורך כרומוזום X3. התהליך של הפעלת X מופעל על ידי תעתיק ספציפי X לא פעיל (Xist) כי מעילים את Xi ב- cis כדי לתווך כרומוזום-רחב השתקה לשפץ את המבנה תלת מימדי של כרומוזום X4. לאחרונה, כמה מסכי פרוטאומית וגנטית זיהו הרגולטורים נוספים של xci, כגון שישי אינטראקציה חלבונים5,6,7,8,9 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , 12. למשל, מחקר הקודם באמצעות הגנום משוחדת כלל הפרעה RNA התערבות מזוהה 13 משחק טרנסמפעל גורמי Xci (xcifs)12. מכונאי, XCIFs להסדיר ביטוי Xist ולכן, הפרעה עם הפונקציה xcifs גורם לפגום xci12. יחד, ההתקדמות האחרונה בתחום סיפקו תובנות חשובות לתוך המנגנון המולקולרי הנדרש ליזום ולתחזק XCI.

זיהוי של הרגולטורים xci והבנת המנגנון שלהם ב-xci רלוונטי ישירות למחלות אנושיות המקושרות באמצעות X, כגון תסמונת רט (rtt)13,14. RTT היא הפרעה נוירוהתפתחותית נדירה הנגרמת על ידי מוטציה heterozygous בחלבון כריכת מתיל-CpG מקושר-X 2 (MECP2) המשפיעה בעיקר על בנות15. מכיוון MECP2 ממוקם על כרומוזום X, בנות rtt הם Heterozygous עבור MECP2 מחסור עם ~ 50% תאים המבטא פראי סוג ו ~ 50% להביע MECP2מוטציה. במיוחד, RTT תאי מוטציה הנמל העתק רדום אך פראי של Mecp2 על Xi, מתן מקור של הגן הפונקציונלי, אשר אם מופעל מראש, עלול להקל על סימפטומים של המחלה. בנוסף RTT, יש כמה מחלות אחרות הקשורות ל-X, שעבורן ההפעלה החוזרת של Xi מייצגת גישה טיפולית פוטנציאלית, כגון תסמונת DDX3X.

עיכוב של XCIFs, 3-פוספהונותזול חלבון קינאז-1 (PDPK1), ופעילות מסוג קולטן 1 (ACVR1), או על ידי מעכבי מולקולה קטנה (שרין) או מולקולת מולקולות קטנות, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים Xi12. ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא נצפתה בדגמי vivo ex שונים הכוללים את העכבר לתאי הפיצוץ קווים, נוירונים למבוגרים העכבר הקליפת המין, העכבר העובריים מתחלקים, ואת קווי התאים פיברובפיצוץ נגזר מחולה RTT12. עם זאת, אם ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא אפשרי vivo שרידים להיות הפגינו. גורם מגביל אחד הוא חוסר של מודלים יעילים בעלי חיים כדי למדוד במדויק את הביטוי של גנים מופעל מראש Xi. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר כי נושאת גנטית מתויג Mecp2 על Xi בכל התאים בשל Heterozygous מחיקה ב Xist על כרומוזום X אימהי16. באמצעות מודל זה, הביטוי של Mecp2 מ Xi כבר כימות בעקבות הטיפול עם מעכבי XCIFs במוח של עכברים חיים. כאן, הדור של הXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר ומתודולוגיה כדי כימות ההפעלה הראשונה של נוירונים בקליפת הסביבה המבוססת על מבוססי immunofluorescence מבוססת מתוארת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבודה מעורבים עכברים אושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת וירג (IACUC;4112).

1. ליצור מודל מסוג XCI עכבר שאינו אקראי עם התווית גנטית Mecp2 על Xi

הערה: זנים העכבר המשמשים במחקר היו כדלקמן: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2tm 3.1 ציפור, שולחן חומרים) ו xist/ΔXist (B6; 129-xist < tm5Sado >; שסופקו על ידי אנטוניו בדפורלוב, פרד האצ המרכז לסרטן, סיאטל). אסטרטגיות רבייה בין הזנים המתאימים עוצבו כדי להרחיב את מושבות העכבר על כל זן.

  1. לבצע PCR-הקלדה על כל זני עכברים הprogenies שהתקבלו לאחר הרבייה באמצעות התחל הספציפי ג'ין המפורטים בטבלה 1.

2. עיצוב אסטרטגיית רבייה העכבר כדי ליצור XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp

  1. הגדר זוג הרבייה על ידי דיור Mecp2-Gfp/Y זכר XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 נקבה יחד (12 h/12 h: מחזור אור/כהה) (איור 1A). באופן אידיאלי, להגדיר לפחות 5 זוגות רבייה בכל פעם באמצעות עכברים קיימא ופורה. אחרי שהנקבה ההרה יולדת, הרשי לה לגדל את האשפה הראשונה שלה עם הזכר.
    הערה: בגלל הנוקאאוט האבהי Xist פוגע מוטבע xci, מינון פיצוי, ובידול מסלולים17, השימוש XistΔ-Mecp2/Y עכברים ברבייה לא יצליחו לייצר את הגורים הנקביים עם גנוטיפ נדרש.
  2. לאחר הגמילה המלטה ביום לאחר לידה 21 (P21), לזהות ולתייג את XistΔ: Mecp2/Xist: גורי נשים Mecp2-Gfp באמצעות שיטת ה-PCR המבוססת על הקלדה (איור 1b).
    הערה: במונחים של מספר בעלי החיים הדרושים לכל קבוצה, עבור התוצאות שדווחו להלן, 5 זוגות רבייה הוגדרו שנוצרו כ 10 נקבה XistΔ: Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp .
  3. השתמש מודלים העכבר הנשי עבור כל הניסויים המוצעים.
    הערה: סקס הוא משתנה ביולוגי חשוב למחקרים XCI, והמודל הגברי אינו מסביר את ההשפעות הקונקקריות של XCI אקראיים.
  4. להיות עקביים במהלך לימודי החיות ולשלול את כל ההשפעות של גיל החי, לבצע את כל הניסויים ב-5 XistΔ נקבה בת 8 שבועות : Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp .

3. לבודד נקבה XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp העכבר העובריים (mefs)

  1. להגדיר ההזדווגות מתוזמן בין Mecp2-Gfp/Y זכר ו XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 נקבה. הגדר לפחות 3-4 כלובי ההזדווגות כדי להגדיל את הסבירות של ההריון.
  2. לאחר אישור תקע הנרתיק בבוקר לאחר ההזדווגות, הפרד את הנקבה ואת היום הזה נחשב יום עובריים 0.5 (E 0.5). לפקח על העלייה במשקל של האישה ההרה פוטנציאליים ולבדוק חזותית את הבטן של העכברים כדי לאשר הריון. ב-14.5 בבוקר הייתה המתת החסד של העכברים הנשיים באמצעות נקע בצוואר הרחם.
  3. מתחת למכסה המנוע, נגב את הבטן של האישה ההרה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים סטרילי, לנתח את חלל הבטן ולהסיר את הקרניים הרחם המכיל את העוברים. באמצעות מלקחיים, בעדינות להוציא את העוברים בזמן לחתוך את רקמת הבטן שנותרה (6-12 עוברים בדרך כלל צפוי).
  4. הניחו את קרני הרחם המכילות את העוברים בצלחת של 10 מ"מ ברקמת הרקמה. באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים, לבצע חתך לאורך קרני הרחם כדי לבודד שקי בודדים נושאת העובר. בזהירות, במקום קרניים הרחם המכיל את שאר העוברים ב 30 מ ל של תמיסת מלח סטרילי מאוזנת של הנקס (HBSS) על הקרח.
  5. לחתוך בעדינות את השק לבודד את העובר באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים. להסיר את השליה על ידי חיתוך חבל הטבור.
  6. . לערוף את ראשו של העובר
    הערה: בעוד שאר הרקמה העובריים יהיה מעובד נוסף, הרקמה מהראש העובר ישמש לבידוד ה-DNA עבור גנוהקלדה.
  7. פתח את הבטן על ידי חיתוך קו האמצע של העובר באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים. הסירו את אברי הקרביים, כגון הלב, הכבד והריאות.
  8. להעביר את הרקמה העובארית הנותרים לתוך לוחית סטרילית 60 מ"מ רקמות רקמה וחותכים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים או סכין גילוח. כדי לשבור את המקבצים לפתוח את התאים, להוסיף 3 מ ל טריפסין-EDTA (0.05%) ו הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 15 דקות.
  9. לנטרל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 5 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMG) עם 10% סרום העובר העוברי (FBS) ו 10 μx/mL פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) לצלחת והנתק את הרקמה על ידי ליטוף חוזר (כ 20-30 פעמים).
  10. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ו-מחדש להשעות את הגלולה התא ב 4 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% fbs ו 10 Μg/mL עט/דלקת. צלחת התאים על הצלחת תרבות 60 מ"מ, ותרבות התאים ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2.
  11. בצע את השלבים 3.5-3.10 עבור כל עובר.
  12. התרבות MEFs השיגה בשלב 3.11 לפחות 3-4 ימים.
    הערה: בשלב זה, MEFs יכול גם להיות הקפאת שמורות לניסויים עתידיים.
  13. כדי לקבוע את המין ואת הגנוטיפ של כל עובר, לבצע את ה-גנוהקלדה-PCR באמצעות דנ א מבודדים מראשי העוברים באמצעות תנאי התחל ו-PCR המפורטים בטבלה 1.

4. לאשר את העדר חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ביטוי במוח של XistΔ: Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp באמצעות מיון מבוסס תא המופעל בשיטת המיון

  1. באמצעות מספריים, הפרד את קליפת המוח משאר האונות המוחית, ובמקום 1 מ ל של הקרח קר גרעיני מדיה בידוד (נים) מאגר המכיל 250 mM סוכות, 25 מ"מ אשלגן כלוריד (KCl), 5 מ"מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), 10 מ"מ טריס-Cl, שיושלם עם 2% פראפורמלדהיד (בתחתית), ו 0.1% nonionic החומר (טבלת חומרים).
  2. הומוגון באמצעות מכשיר זכוכית קר-קרח.
  3. ספין למטה רקמת הומוגניים ב 600 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  4. הסר supernatant ולהשהות את הגלולה ב 1 מ ל של 25% יודיקסנול בפתרון נים.
  5. להוסיף 1 מ ל של 29% lodixanol בפתרון נים ל 4 מ"ל ultracentrifuge tube (חנות על הקרח עד הדגימות מוכנים) ובזהירות שכבה 1 מ ל של מדגם (ב 25% lodixanol).
  6. צנטריפוגה ב 9,000 x g, 4 ° צ' עבור 10 דקות ב ultracentrifuge.
  7. ולאחר מכן השעיית מחדש את הגלולה ב-500 μL של מיון תאים המופעל על ידי הפלואורסצנטית (FACS) מאגר (מלוחים המלח באגירה [PBS] שיושלם עם 1 מ"מ EDTA, 0.05% נתרן azide, ו 2% סרום שיסמין [BSA]).
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-4 ° צ' או עד 1 שבוע.
  8. הוסף 5 μL של 7-אמינו-אקטינומיצין D (7-עמ מ; 50 mg/mL) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים דנ א.
  9. לנתח דגימות עבור 7-עמ ' חלבון פלורסנט ירוק (GFP) האות באמצעות הזרימה cy, לנסות.

5. קביעת הכדאיות של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר עבור ההפעלה הראשונה של Xi

  1. Seed 1 x 105 תאים/mL נקבה XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp mefs, Mecp2/Mecp2-gfp ו xist-Mecp2/Y mefs שהתקבל בשלב 3.12 בפורמט 6-טוב ובשקופיות קאמרית, ב-dmem עם 10% fbs ו 10 μg/mL עט/דלקת, ב 37 ° c ב נוכחות של 5% CO2.
    הערה: Mecp2/Mecp2-Gfp ו Xist-Mecp2/Y mefs משמשים כפקדים חיוביים ושליליים בניסויים.
  2. הוסף מדיום טרי לתאים לאחר 24 שעות. עבור XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs, להוסיף בינוני בתוספת עם מעכבי XCIFs (למשל, 0.5 ΜM LDN193189 ו 2.5 ΜM GSK650394), או רכב לבד. החלף בינוני בתוספת עם מעכב או רכב טרי לבדו כל יומיים. עבור Mecp2/Mecp2-Gfp ו Xist-Mecp2/Y mefs, להוסיף מדיום טרי כל יומיים.
  3. פוסט 1 שבוע של טיפול מעכב, הקציר MEFs גם עבור בידוד RNA (6-באר צלחת) או לתקן תאים לאימונולואואורנציה (שקופיות קאמרית). השתמש ב-MEFs בודד מ- Mecp2/Mecp2-Gfp כאשר עוברים חיובי ו -Xist-Mecp2/Y כפקדים שליליים בהתאמה.
    1. עבור בידוד RNA, לבודד RNA הכולל על ידי guanidinium מבוסס רנ א החילוץ מבוססי RNA, ולהפוך את הפוך באמצעות היפוך הטרנססקריפט. למדוד ביטוי Mecp2-Gfp על ידי היפוך כמותי הטרנססקריפט-Pcr (רביעיית-pcr) באמצעות Mecp2-WT ו Mecp2-gfp, ו התחל בלוח 1, כפי שמתואר בעבר12.
    2. עבור immunofluorescence, כתם הכתמים עם נוגדן ראשוני אנטי gfp (1:100), כפי שמתואר בעבר12,16. למדוד את עוצמת GFP על ידי אימונוXistΔ כמותיים לטיפול תרופתי : Mecp2/Xist: Mecp2-gfp mefs, כפי שמתואר בעבר18.

6. להדגים את ההפעלה הפרמקולוגית במוח של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר

  1. . הכן סמים ושליטה ברכב
    1. הכינו פתרון טרי וסטרילי של הרכב (0.9% הנאגל, 0.5% מתיל תאית, 4.5% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) עבור זריקות המוח.
    2. הכנת מעכבי כימיים כולל 1.5 mM LDN193189 (מולקולה קטנה מעכב של ACVR1) ו 1.6 mM GSK650394 (מולקולה קטנה מעכב של SGK1, המורד הזרם של PDPK1) מושעה מחדש ברכב (0.9% הנאגל, 0.5% מתילתאית, 4.5% DMSO), או רכב לבד. הנפח הכולל של מעכבי כימיים או רכב הוזרק הוא 10 μL לכל מינון לכל חיה.
  2. . הכן חיה לזריקות מוחית
    1. הכן את אזור כירורגי על ידי ניגוב הספסל ומשטח חימום עם חיטוי (10% נתרן היפוכלוניט הפתרון).
    2. מורדם העכבר 4 השבוע עם הזרקה התוך הצפק של תערובת קטמין/xylazine במינון של 140 מ"ג/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה. השתמש ברפלקס הדוושה כדי לקבוע את רמת ההרדמה.
    3. החלת משחה אופטלמולוגית לעיניים בעקבות אינדוקציה של הרדמה כדי למנוע ייבוש הקרנית.
    4. לגלח את הפרווה מהצוואר עד ראש העכבר.
    5. למקם את העכבר בפלטפורמת סטריאוטקטיקה על ידי חיבור השיניים חותכת של העכבר בתוך החטיף של הרסן החוטם והידוק מהדק האף על החוטם תוך הבטחת כי הראש של העכבר הוא על מישור רמה.
    6. כוונן את גובה פסי האוזן, בהתאם לצורך, כדי להגיע לחלק caudal של תעלת האוזן, ומאבטח אותם כך שראש העכבר נמצא במישור ברמה ומתכוונן על מגע האצבע.
    7. לחטא את הראש של העכבר עם מגבונים לסירוגין של חיטוי אקטואלי, כגון povidone-יוד ו 70% אתנול.
  3. . מנהל סמים
    1. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך אופקי 0.75 ס מ באמצע הקרקפת.
    2. באמצעות בר 0.45 מ"מ, לקדוח שני חורים סימטריים מעל האונות הימנית והשמאלית (2 מ"מ מן תפר משונן 2 מ"מ מתפר המדוגת, בערך באמצע עצם הקודקוד).
    3. הצמד מזרק של 10 μL לפלטפורמת הסטריאוטקטיקה בחוזקה.
    4. לערבב את הפתרון של מעכבי כימיים, ולצייר 10 μL של פתרון לתוך המזרק. הימנע בועות אוויר במזרק.
    5. מראש את המחט מזרק לתוך חור בגולגולת שמירה על המחט בניצב (90 °) לגולגולת. כאשר המחט החוצה את הגולגולת, לאפס את נקודות הציון על התצוגה הדיגיטלית סטריאוטקטיקה ולאחר מכן לקדם את קצה המחט עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מ"מ.
    6. משיכת המחט 0.5 מ"מ לעומק עבור 2 מ"מ.
    7. הכנס לאט את 10 μL של פתרון (~ 1 דקות). לאחר ההזרקה הושלמה, להשאיר את המחט במוח עבור ~ 1 דקות ולאחר מכן למשוך את המחט.
    8. חזרו על הזריקה לחצי הכדור השני (בקרת הרכב בלבד).
    9. באמצעות תפרים או "דבק עור" לסגור את העור של העכבר (אם הפצע הוא > 0.5 ס"מ שני תפרים ו" דבק העור "יש להשתמש).
    10. שחרר את פסי האוזן והסר את העכבר ממנגנון הסטריאוטקטיקה.
    11. ניהול משככי כאבים (בוטאורפין SR 0.5 mg/ק"ג) ומניחים את העכבר על כרית חימום שנקבעה ל-37 ° c עד שהחיה תחזור להכרה.
    12. ברגע שהעכבר הוא ערני ומגיב, העבר את החיה חזרה לכלוב המקורי.
    13. חזור על ההליך מדי יומיים במשך 20 יום. הקידוח החוזר של האזור אינו נדרש לזריקות הבאות.
  4. . תבודד את מוח העכבר
    1. לאחר משטר המינון הושלמה, המתת החסד העכבר בחדר CO2 .
    2. לשתק את העכבר על פני השטח באמצעות מחטים.
    3. לעשות חתך לרוחב דרך הקיר עור והבטן ממש מתחת לכלוב הצלעות באמצעות מספריים מלקחיים. . הפרידו בזהירות את הכבד מהסרעפת
    4. באמצעות מספריים, חותכים את הסרעפת וממשיכים לחתוך לאורך כל כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הצפק.
    5. באמצעות מספריים, לבצע חתך לקצה האחורי של החדר השמאלי.
    6. מיד, התחל להזריק את חדר הלב הימני עם ~ 15 מ ל של PBS מעל ~ 2 דקות. צבע הכבד שינוי מאדום כדי ורוד בהיר מעיד על perfusion טוב.
    7. הכנס את התא הימני של לב העכבר עם ~ 10 mL של 4% פאראפורמלדהיד ב PBS מעל ~ 2 דקות.
    8. ערוף את ראשו של העכבר, ולהשתמש במספריים לעשות חתך באמצע קו של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
    9. הניחו קצה אחד של המספריים לתוך מגנום האמן, וחתכו אותו לתוך הגולגולת לכיוון העין. . אני חוזר לצד השני נסו לשמור על סוף המספריים שטחיות ככל האפשר כדי למנוע פגיעה במוח.
    10. להשתמש במספריים כדי לחתוך את האזור בין העיניים ומעל האף של העכבר.
    11. השתמש מלקחיים כדי לקלף בעדינות את עצמות הגולגולת מהמיאונות במוח.
    12. הרם את המוח במרית, והשתמש במספריים כדי לנתח בזהירות את סיבי העצב הגולגולתית שיתקנו אותה לגולגולת.
    13. מניחים את המוח על צלחת פלסטיק, לגזור את נורות המוח ואת הריח, ולמקם את המוח לתוך 15 מ ל שפופרת מלא עם 4% בתחתית הוא PBS.
  5. . מחלקת ההקפאה במוח העכבר
    1. לתקן את המוח ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS ב 4 ° c בלילה.
    2. לשטוף את המוח עם PBS ב 4 ° צ' לפחות 3 x עבור 5 דקות כל אחד.
    3. סמן את התבניות החד החד-פעמיות עבור הקפאת הרקמות.
    4. חותכים את החלק הקדמי של המוח באמצעות מספריים מלקחיים (להתחיל לעשות ~ 5 מ"מ סעיפים מאתרי הזרקה).
    5. להעביר את המוח לקריוזקן עם החזית של המוח הפונה כלפי מטה כדי להשיג סעיפים ילתית. טבול את העובש המכיל את המוח בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT).
    6. יוצקים חנקן נוזלי לצלחת מפלסטיק 10 מ"מ ומניחים את המוח בתבנית ההקפאה לתוך החנקן.
      הערה: חשוב לכוון את הרקמה כמתואר בשלב 6.5.5 כדי להנחות את הכיוון של המוח.
    7. כאשר OCT הוא לבן מוצק, מניחים את המוח הקפוא לתוך a-80 מקפיא ° c לאחסון.
    8. המוח עד 20 ° c לפחות 30 דקות לפני הפסקה עם קריוסטט ו קריומטר (5-6 יקרומטר עובי) המוח, הרכבה 2-3 סעיפים לכל שקופית. ניתן לאחסן שקופיות ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר.
  6. לקבוע את ההפעלה העצמית באמצעות הגישה המבוססת על immunofluorescence.
    1. לפני שמתחילים בהליך ההכתמים, מייבשים את חתכי המוח ללילה ב -4 ° c.
    2. שקופיות לטבול בפתרון אחזור אנטיגן (0.1 m חומצת לימון, 0.1 M טריס-base, pH = 6.0) 100 על בלוק חום בגובה ° c עבור 5 דקות.
    3. לשטוף את השקופיות 4x עם 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
    4. לטבול שקופיות בפתרון חסימה (0.1 M NH4CL/PBS/0.2% ג'לטין/0.05% nonionic) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לשטוף שקופיות 3 x עם מאגר לשטוף (PBS/0.2% ג'לטין) בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כל אחד.
    6. כתם המוח סעיפים עם anti-GFP-AlexaFluor647 (1:100) ו anti-MAP2 (1:1000) נוגדנים ב דגירה בינונית (PBS/0.2% ג'לטין/1% BSA) ו דגירה ב 4 ° c לילה.
    7. לאסוף נוגדנים עיקריים (ניתן לעשות שימוש חוזר). לשטוף שקופיות 4x עם מאגר לשטוף עבור סך של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. דגירה סעיפים המוח עם עז נגד עוף Fluorescein isothiocyanate (FITC)-מסומן נוגדן משני (1:1000) ב דגירה בינונית ו דגירה 1-2-h בטמפרטורת החדר בחושך.
    9. לשטוף שקופיות 4x עם מאגר לשטוף עבור סך של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. מקום טיפה של בינוני הרכבה עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) על מחליק 22 מ"מ x 50 מ"מ, ואז להפוך את coverslip על שקופית, כיסוי כל מקטעי רקמות.
    11. תמונה על מיקרוסקופ ולהתאים תמונות לניגודיות ובהירות. לכידת תמונות ולכמת את מספר התאים GFP-חיוביים עבור תרופות מטופלים והרכב שטופלו XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp המוח העכבר אונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את הכדאיות של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר עבור לימודי ההפעלה מראש של XI, xcif מעכבי-בתיווך ההפעלה של xi מקושרים Mecp2-gfp נבדק העכבר מעובריים מתחלקים (mefs). הנקבה MEFs היו מבודדים מיום 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp העוברים כמתואר בסעיף 3 (איור 1a). הגנוטיפים של הנקבה XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs אושרו על ידי הגנואיות-PCR, כמתואר בעבר19 (איור 1B), ו-facs מבוססי שיט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבר, XCIFs כי הם נדרשים באופן סלקטיבי עבור השתקה של גנים מקושרים Xi בתאי נשים ביונקים זוהו12. אנחנו עוד אופטימיזציה מולקולה קטנה חזקה מעכבי כדי XCIFs היעד, כגון ACVR1 ו המורד הזרם של PDPK1, אשר ביעילות הפעלה מחדש של Xi Mecp2 בעכבר פיברוההדף קווים תא, נוירונים בקליפת העכבר, ו תא האדם פיברוביסט קו שנגזר מחולה RTT. תוצאות אלה מרמזות כי Xi ההפעלה העצמית היא גישה טיפולית סבירה כדי להציל את הליקויים גנים בחולים מקושרים X מחלות; עם זאת, בvivo הכדאיות נותר להיקבע. לאחרונה, XCIF מעכבי הוכחו להפעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים אנטוניו בדפורלוב על מתן ריאגנטים; אוניברסיטת וירג היסטולוגיה רקמות הליבה להקפאה; האוניברסיטה של וירג זרימה Cyהליבה ליבה עבור הניתוח cy, הזרמת הזרימה; כריסטיאן בלו ו Saloni סינג לקבלת סיוע טכני עם הדפס. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק כפול מחקר Z.Z., ואת התוכנית פיילוט פרויקט פרס מאוניברסיטת וירג-וירג טק הקרן הטכנולוגי הקרן הארטבאר בודדים במחקר ביו פרס על S.B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים
Mecp2tm3.1Birdמעבדת ג'קסון#014610
B6; 129-Xist (tm5Sado)מסופק על ידי אנטוניו בדלוב, מרכז הסרטן פרד האצ'ינסון, סיאטל
ריאגנטים
22x22 מ"מ כיסויFISHERfinest (פישר סיינטיפיק)125488
32% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714-S
50 מ"ל מזרקMedline IndustriesNPMJD50LZ
צלחת תרבית 60 מ"מCellStar628160
7-AAD BioLegend420403
אמוניום כלוריד (NH4Cl)Fisher ChemicalA661-3
anti-GFP-AlexaFluor647InvitrogenA-31852
anti-MAP2Aves LabsMAP
BSAPromegaR396D
בופרנורפין SRזופארם
חומצת לימון סיגמאC-1857
DMSOפישר ביוריאגנטיםBP231-100
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)Corning Cellgro10-013-CV
אתנולDecon Labs2701
סרום בקר עוברי (FBS)VWR מדעיהחיים89510-198
ג'לטיןSigma-AldrichG9391
שקופיות זכוכיתFisherbrand22-034-486
נוגדן משני נגד עוף עם תווית FITC Aves LabsF-1005
GSK650394ApexBioB1051
hamilton 10μ l מזרק המילטון סיגמא-אולדריץ'28615-U
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)Gibco14025-092
קטמיןקטאסטNDC 0856-2013-01
מספריים מעוקלים קהים / קהים גדוליםFine Science Tools14519-14
LDN193189Cayman Chemicals11802
lodixanolSigma
מגנזיום כלוריד (MgCl2)פישר כימיקלM35-212
מתילצלולוזסיגמאM0262-100G
מדיום הרכבה עם קצה מחט DAPI VectashieldH-1200
, 26 GA x 1.25 אינץ'PrecisionGlide305111
רענון Lacri-Lube93468
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) ThermoFisher
PCR פניצילין
/סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקוקוק)קורנינג30-002-Cl
פוספט חוצץ מי מלח pH 7.4 (PBS)קורנינג Cellgro46-103-CM
אשלגן כלורי (KCl)להבי
זכוכית רדודה או פלסטיק מגש
דבק עור / דבק רקמות3M Vetbond1469SB
נתרן אזידפישר סיינטיפיקCAS 26628-22-8
נתרן כלורי (NaCl)פישר כימיקלS642-212
מלקחיים סטנדרטיים המוסטטFine Science Tools13013-14
פינצטה סטנדרטיתפיין Science Tools11027-12
מספריים ישרים לקשתיתכלי מדע עדינים14058-11
סוכרוזפישר סיינטיפיקBP220-1
Tris-baseפישר ביוריאגנטיםBP152-5
טריטון X-100פישר ביוריאגנטיםBP151-500
טריפסין-EDTA גיבקו15400-054
XylazineAkornNDC: 59399-111-50
ציוד
Zeiss AxioObserver מיקרוסקופ תא חי Zeiss ZeissAxioObserver
0.45 מ"מ קוציםIDEAL MicroDrill67-1000
BD FACSהומוגנייזר
חממת תרבית תאיםThermo Scientific HERACELL VIOS 160i13-998-213
Leica 3050S מחקר קריוסטט
פלטפורמה
thermocycler
טיימר
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר אופטימה L-100 XP
אמבט מים (37 ומעלה; ג)פישר סיינטיפיק איזוטמפ 2239
1343517 משחת עיניים תערובת אזמל פישר סיינטיפיק P330-500 זכוכית צנטריפוגה סטריאוטקטית

מקורות

  1. Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
  2. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  3. Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
  4. Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
  5. Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
  6. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  7. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  8. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
  9. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383(2016).
  10. Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
  11. Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  12. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
  13. Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
  14. Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
  15. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
  16. Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
  17. Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
  18. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  19. Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XMecp2XCIFMecp2 GFP

מאמרים קשורים